Adaptación de métodos en microplacas para identificar mecanismos de resistencia en Tetranychus urticae Koch

Adaptation of methods using microplates to identify mechanisms of resistance in Tetranychus urticae Koch

Ernesto Cerna¹, Yisa Ochoa²*, Mohammad Badii³, Jerónimo Landeros¹

¹ Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Parasitología. 25315. Buenavista, Saltillo, Coahuila.

² Universidad Autónoma de Aguascalientes, Avenida Universidad No. 940, Colonia Ciudad Universitaria. Aguascalientes, Aguascalientes. * Autor responsable: (yisa8a@yahoo.com)

Recibido: Marzo, 2009.
Aprobado: Julio, 2010.

RESUMEN

Las pruebas bioquímicas son útiles para conocer la actividad y cantidad de enzimas responsables de la resistencia. En este estudio se recolectaron ácaros Tetranychus urticae Koch en campos productores de fresa del estado de Guanajuato, México. Se realizaron pruebas bioquímicas para determinar los mecanismos enzimáticos de resistencia, usando una línea susceptible de T. urticae como referencia y adaptando los métodos en microplacas, según lo describe Fersht para mosquitos. Una vez estandarizado el método se determinó el nivel de enzimas en ambas poblaciones. Se encontró que las oxidasas y las α y β esterasas tienen una mayor presencia en la población de campo; por tanto, son responsables de la resistencia a acaricidas de la población de T. urticae muestreada en este estudio.

Palabras clave: ensayos en microplacas, esterasas, oxidasas.

ABSTRACT

Key words: tests in microplates, esterases, oxidases.

INTRODUCCIÓN

Tetranychus urticae Koch ataca a más de 180 especies de plantas y es una de las especies que mayor daño ocasiona a los cultivos. El control químico es el más usado en esta plaga, pero la mala aplicación de los plaguicidas ha provocado el desarrollo de resistencia (Georghiou y Saito, 1983). La de tipo fisiológico es la más importante debido a los sistemas enzimáticos (Lagunes y Villanueva, 1994).

La forma convencional para detectar de la resistencia se basa en pruebas de susceptibilidad a acaricidas, requiriendo numerosos organismos que permitan cuantificar el nivel de resistencia, pero sin detectar los mecanismos responsables (Keiding, 1986). El monitoreo y la detección de la resistencia requieren técnicas efectivas, y las pruebas bioquímicas se usan para conocer la actividad y la cantidad de enzimas responsables de este fenómeno (Hemingway et al., 1986). Además, se puede conocer los fenotipos multirresistentes, la capacidad de detectar etapas iníciales de resistencia en una población y la frecuencia de genes con mecanismos de resistencia específicos (Rodríguez et al., 2001).

Aunque estos métodos se usan para algunas especies de mosquitos de tamaño medio (7 a 20 mm), utilizando hasta un individuo por muestra, no hay técnicas para especies de tamaño pequeño (1 a 6 mm), como los ácaros. Por tanto, el objetivo del presente estdudio fue adaptar el método de microplacas para determinar los mecanismos y niveles de resistencia enzimática en poblaciones del ácaro de dos manchas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas de ácaros

Determinación de proteína

Para determinar la cantidad de ácaros por muestra se usó como referencia la proteína por mosquito (Brogdon y Barber, 1987). Se usó el método de Bradford (1976) modificado por Brogdon (1984), con el Kit–II de Bio–Rad y la albúmina sérica bovina (ASB) como proteína de referencia. Se usaron hembras adultas (8 d edad) en siete concentraciones en relación al número (10, 30, 50, 100, 300, 500 y 800 ácaros); cada una con 30 repeticiones.

Una vez determinada la cantidad de muestra en relación a la proteína (30 ácaros) se homogenizaron en 100 μL de amortiguador fosfato de potasio (KPO₄) a 0.05 M y pH 7.2, diluyéndose a 1 mL con el mismo amortiguador, para utilizarlo como fuente de enzima.

Adaptación de los métodos

La L–s, se usó para determinar los niveles de α–esterasas (αEST), β–esterasas (βEST), oxidasas (Ox), glutatión s–transferasas (GST), acetilcolinesterasa (ACE) y acetilcolinesterasa insensible (ACE in) y se adaptaron com se describió para mosquitos (Brogdon et al., 1997), usando la metodología de Fersht (1985). Para cada prueba se usaron 90 muestras de ácaros por triplicado en placas de 96 cavidades y las absorbancias se tomaron con un lector Stat–Fax 2100.

Para las α y β–esterasas se determinó la concentración de sustrato saturante (css) de α y β naftil acetato, el tiempo óptimo de reacción (ToR) y la velocidad inicial (Vo). Las lecturas de absorbancia de α y β naftil acetato (0.3, 0.5, 0.7 y 0.9 mM) se analizaron a intervalos de 3 hasta 20 min, para determinar la meseta del ToR. Los valores de Vo se obtuvieron con base en la pendiente de la curva y divididos por el ToR. Para la css se graficaron los resultados de Vo contra cada concentración de α y β naftil acetato. Respecto a la GST se determinó la ccs de 1–cloro–2–,4–dinitrobenzeno (CDNB) y de glutatión reducido (GR), el ToR y la Vo. Se mantuvo constante la concentración de GR (2 mM) y las concentraciones de CDNB (2, 5, 10 y 15 mM) se analizaron en intervalos de 1 a 20 min. La css, el ToR y la Vo del GR se encontraron al probar diferentes concentraciones y tiempos (2, 4, 8, y 16 mM; 1 a 20 min) y manteniendo la concentración de CDNB establecida. Para las oxidasa se determinó la css, ToR y Vo para el 3,3',5,5'–tetrametil–bencidina–dihidrocloruro (TMBZ), con metodología similar para esterasas. Las concentraciones evaluadas de TMBZ fueron 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mM, a intervalos de 1 a 20 min. Finalmente, para la ACE y ACE in se determinó la css para el yoduro de acetilcolina (ATCH) y el ácido 5,5'–ditio–bis–2–nitrobenzoico (DTNB), el ToR y la Vo. La metodología fue similar a la de GST: concentración de DTNB 0.5 mM, y concentraciones de ATCH (2, 2.5, 3.0 y 4.0 mM) analizadas a intervalos de 3 hasta 20 min. Para el DTNB las concentraciones e intervalos de tiempo fueron 0.25, 0.50, 0.75 y 1.0 mM, y de 3 hasta 20 min; manteniendo la concentración de ATCH establecida.

Determinación de los niveles enzimáticos

Para las α y β–esterasas se colocaron 100 μL del homogenato en cada celda de la microplaca y 100 μL de α o β naftil acetato al 0.7 mM, por 15 min. Se adicionaron 100 μLde Fast Blue y se leyó a 545 nm. Para las GST se colocaron 100 μL de la muestra de ácaros más 100 μLde GR al 8.0 mM y 100 μLde CDNB al 10 mM. Al inicio se tomó una primer lectura (T₀) a 340 nm, luego una segunda (T₁₀) a los 10 min a 340 nm. La diferencia de lecturas (T₁₀–T₀) se usó para el análisis de los resultados. Para las oxidasas se colocaron 100 μL del homogenato más 200 μL de TMBZ al 2.0 mM y 25 μL de peróxido de hidrógeno al 3 %. Se dejó reaccionar por 10 min y se leyó a 630 nm. Finalmente, para la ACE y ACE in se colocaron 100 μL del homogenato más 100 μLde ATCH al 3.0 mM y 100 μLde DTNB al 0.25 mM. Se tomó la (T₀) a 405 nm, luego de 15 min se tomó una segunda lectura (T₁₅) con el mismo filtro. La diferencia entre las lecturas (T₁₅ –T₀) se usó para el análisis de los resultados. Para determinar los niveles de ACE insensible, la metodología fue similar a la anterior, pero en la solución de ATCH se agregaron 25 mg de naled (1,2–dibromo–2,2–dicloroetil dimetil fosfato) como inhibidor.

Análisis de los resultados

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contenido de proteína

Las muestras de 50–800 ácaros presentaron una alta cantidad de proteína que sobrepasó el rango requerido (60 a 140 μg) y las muestras de 500 y 800 ácaros mostraron valores que sobrepasaban el rango lineal del método (Cuadro 1). Bradford (1976) menciona que valores fuera del rango no son confiables para la cuantificación de proteína en tejidos y fluidos. Las muestras con 10 y 30 ácaros presentaron los valores dentro del rango, por lo que se tomaron 30 ácaros por muestra, por sus valores de proteína altos y estables.

Adaptación de los métodos en microplacas

Se adaptaron las técnicas de detección de α y β EST, oxidasas, GST y ACE en T. urticae. Se determinó la css para cada enzima, donde las EST presentaron una css para α y β–naftil acetato de 0.7 mM (Cuadro 2), en comparación con la concentración de 3.0 mM de α y β–naftil acetato utilizada para mosquitos (Brogdon y Dickinson, 1983), difiriendo en 77% de los resultados del presente estudio. Sin embargo, Yang et al. (2001) señalan una concentración de 0.27 mM de α–naftil acetato para T. urticae. Las oxidasas mostraron una css para el TMBZ de 2.0 mM (Cuadro 2), que difiere en 20% a las de Brogdon et al. (1997) para mosquitos con una css de 1.6 mM de TMBZ. Para la GST la css fue 10 y 8.0 mM para el CDNB y GR (Cuadro 2), siendo superior a los mencionados por Brogdon y Barber (1990), una css de 2.0 mM para el GR y de 1.0 mM para el CDNB en mosquitos; y similar a los de Yang et al. (2001) quienes indican una concentración de 150 mM para el CDNB y de 10 mM para el GR en T. urticae. Por último, para ACE se determinó una css de 3.0 mM para ATCH y de 0.5 mM para DTNB (Cuadro 2). Brogdon y Barber (1987), para mosquitos, mencionan una concentración de 2.6 y 0.33 mM para ATCH y DTNB.

Las diferencias de la css encontradas en T. urticae respecto a lo reportado para mosquitos se puede deber al tamaño de la muestra y a los fluidos donde están contenidas estas proteínas (Fersht, 1985). También influye el tipo de sustrato alimenticio ya que algunos hospederos pueden generar metabolitos secundarios que dañan al ácaro en su sistema fisiológico, como en las plantas de frijol (Phaseolus vulgaris), que aumentan naturalmente el contenido de esterasas dentro de las poblaciones de ácaros (Yang et al., 2001).

Los valores de ToR se muestran en el Cuadro 2 y para el sustrato α y β–naftil acetato fue de 15 min, debido a que lecturas en tiempos superiores no modifican estadísticamente las lecturas. Brogdon y Dickinson (1983) registran un tiempo de incubación de 10 min. En el sustrato TMBZ, usado para medir cantidad de oxidasas, el ToR fue a los 10 min lo que contrasta con el tiempo (5 min) sugerido por Brogdon et al. (1997). Para los sustratos CDNB y el GR, el ToR fue 10 min que es superior al de 5 min sugerido por Brogdon y Barber (1990). Por último, para los sustratos ATCH y DTNB el ToR fue de 15 min, mientras Brogdon y Barber (1987) reportan 10 min. Estas diferencias se pueden deber a que sólo se tomó la mitad de concentración de la muestra.

Niveles enzimáticos

Al comparar la cantidad de enzima con el promedio de absorbancia (Cuadro 3) se encontró que el principal factor de resistencia para la Lc son las oxidasas (2.0251 A), seguidas por las α y β–EST (1.1784 B y 1.3801 B). Las enzimas con una menor presencia en la Lc fueron GST, ACE y ACE in (0.4930 D, 0.0401 E y 0.0306 E). Por ello, el principal mecanismo de resistencia en la Lc son oxidasas, debido al elevado número de aplicaciones de abamec–tina en la región (10 a 12). Al respecto, Campos et al. (1996) señalan un aumento de oxidasas en líneas de T. urticae que recibieron más de seis aplicaciones de abamectina por temporada. Asimismo, Clark et al. (1994) mencionan que el principal mecanismo fisiológico de resistencia a la abamectina son las enzimas oxidativas. Otro mecanismo enzimático en la Lc fueron las enzimas α y β–EST, lo que se puede deber a la aplicación alterna de productos como piretroides y organofosforados para el control de plagas del cultivo. La resistencia en T. urticae se debe a una alta presión de selección con piretriodes y organofosforados, donde se incrementa la actividad de carboxiesterasas. Además, la unión éster de los piretroides constituye el sitio vulnerable de la molécula, donde actúan esterasas específicas (Lagunes y Villanueva, 1994). Las enzimas GST, ACE y ACE in causan resistencia en especies de insectos; sin embargo, en el presente estudio estos sistemas fueron los menos relevantes (Dauterman, 1983).

CONCLUSIÓN

Las oxidasas, y las α y β esterasas aportaron mayor presencia dentro de la población de campo, por lo que estas enzimas son las responsables de la resistencia a acaricidas de la población de T. urticae Koch en estudio.

LITERATURA CITADA

Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the priciples of proteindye binding. Analyt. Biochem. 72: 248–254.         [ Links ]

Brogdon, W. G. 1984. Mosquito protein microassay–1, protein determinations from small portions of single–mosquito homogenates. Comp. Biochem. Physiol. 79: 457–459.         [ Links ]

Brogdon, W. G., and C. M. Dickinson. 1983. A microassay system for measuring esterase activity and protein concentration in small samples and in hig–pressure liquid chromatography eluate fractions. Analyt. Biochem. 131: 499–503.         [ Links ]

Brogdon, W. G., and A. M. Barber. 1987. Microplate assay of acetylcholinesterase inhibition kinetics in single mosquitoes homogenates. Pest. Biochem. Phisiol. 29: 252–259.         [ Links ]

Brogdon, W. G., and A. M. Barber. 1990. Microplate assay of glutathione S–transferase activity for resistance detection in single mosquito triturates. Comp. Biochem. Physiol. 96: 339–342.         [ Links ]

Brogdon, W. G., J. C. McAllister, and J. Vulule. 1997. Hemeperoxidase activity measured in single mosquitoes identifies individuals espressing an elevated oxidase for insecticide resistance. J. Am. Mosq. Control Assoc. 13: 233–237.         [ Links ]

Campos, F., D. A. Krupa, and R. A. Dybas. 1996. Susceptibility of populations of two–spotted spider mites (Acari: Tetranychidae) from Florida, Holland and the Canary Islands to abamectin and characterization of abamectin resistance. J. Econ. Entomol. 89(3) : 594–601.         [ Links ]

Clark, J. M., J. G. Scott, F. Campos, and J.R. Bloomquist. 1994. Resistance to avermectins: Extent, mechanisms and management implications. Annu. Rev. Entomol. 40: 1–30.         [ Links ]

Dauterman, W. C. 1983. Role of hydrolases and gluthathione s– tranferases in insecticides resistance. In: Georghiou, G.P., and T. Saito (eds). Pest Resistance Pesticides. Plenum Press. New York. pp: 229–247.         [ Links ]

Fersht, A. 1985. Measurement and magnitude of enzimatic rate constants. In: Enzyme Structure and Mechanism. 2 ed. New York. W. H. Freeman and Company. pp: 121–124,         [ Links ]

Georghiou, P. G., and T. Saito. 1983. Resistance to Pesticides. Plenun Press. New York, USA. 809 p.         [ Links ]

Hemingway, J., C. Smith, K. J. I. Jayawardena, and P. R. J. Hearth. 1986. Field and laboratory of the altered acetylcholinesterase resistance genes which confer organophosphate and carbamate resistance in mosquitoes (Diptera: Culicidae). Bull. Entomol. Res. 76: 559–565.         [ Links ]

Keiding, J. 1986. Prediction or resistance risk assessment. In: Pesticide Resistance. National Academy Press. Washington D. C. pp: 279–297.         [ Links ]

Lagunes, T., y J. J. Villanueva, A. 1994. Toxicología y manejo de insecticidas. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas. 265 p.         [ Links ]

Rodríguez, M. M., J. A. Bisset, D. Molina, C. Díaz, y L. A. Soca. 2001. Adaptación de los métodos en placas de microtitulación para la cuantificación de la actividad de esterasas y glutation s–transferasas en Aedes aegypti. Rev. Cub. Med. Trop. 53 (1): 32–36.         [ Links ]

SAS Institute Inc. 1985. Guide for Personal Computers. Ver 8. SAS Institute, Cary, N. C. 243 p.         [ Links ]

Yang, X., D. C. Marcolies, K. Yanzhu, and L. L. Buschman. 2001. Host plant changes in detoxification enzymes and susceptibility to pesticides in the twospotted spider mites (Acari: Tetranychidae). J. Econ. Entomol. 94: 381–387.         [ Links ]