Desarrollo in vitro de cuatro cepas nativas de Paecilomyces Fumosoroseus y su patogenicidad en estados inmaduros de mosquita blanca
In vitro development of four Paecilomyces Fumosoroseus isolates and their pathogenicity on immature whitefly
Wilberth Chan–Cupul1, Esaú Ruiz–Sánchez1*, Jairo Cristóbal–Alejo1, Alfonso Pérez–Gutiérrez1, Ricardo Munguía–Rosales2, Joel Lara–Reyna3
1 Instituto Tecnológico de Conkal. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Km 16.3 Antigua Carretera Mérida–Motul, Conkal, Yucatán. C.P. 97345. * Autor responsable: (esau_ruiz@hotmail.com).
2 Comite Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Yucatán. Calle 19 # 443 Colonia Ciudad Industrial. C.P. 97288 Mérida, Yucatán.
]]> 3 Colegio de Posgraduados. Campus Campeche. Calle Nicaragua # 91 tercer piso. Col. Santa Ana. C.P. 24150. Campeche, Campeche.
Recibido: Marzo, 2009.
Aprobado: Junio, 2010.
RESUMEN
El uso de insecticidas químicos en el manejo de la mosquita blanca (Bemisia tabaci) (Gennadius) causa serios daños al ambiente y ha generado poblaciones resistentes a los productos convencionales. Una alternativa promisoria es el control biológico mediante hongos entomopatógenos. En el presente estudio se evaluó el desarrollo in vitro y la patogenicidad de cuatro cepas nativas (Pf–Tim, Pf–Tiz, Pf–Hal, Pf–Rg) y una comercial (Pae–sin) de Paecilomyces Jumosoroseus (Wize) Brown & Smith en huevos y ninfas del primer instar de Bemisia tabaci (Gennadius). Las variables para evaluar el desarrollo in vitro fueron: tasa de crecimiento diario de la colonia (TCD), esporulación y tasa de germinación de esporas (TGE). La patogenicidad de las cepas se determinó por inmersión de hojas de Capsicum chinense, que contenían los inmaduros de B. tabaci, en una suspensión conidial 1×107 esporas mL–1. La TCD de la cepa Pae–sin (1.63 mm d–1) fue mayor (p<0.05) que la de Pf–Hal (1.40 mm d–1) y Pf–Rg (1.35 mm d–1). La esporulación no fue diferente (p>0.05) entre los aislamientos nativos y la cepa comercial. La TGE fue mayor (p<0.05) en Pf–Rg (22 % h–1) que la observada en las otras cepas nativas y en Pae–sin (11.91 a 12.50 %). Todos los hongos fueron más patogénicos en ninfas que en huevos; la mortalidad en huevos y ninfas varió de 29.8 a 45.5% y de 51.4 a 74.5%. Con los datos del ensayo de mortalidad en ninfas se calculó el tiempo letal medio (TL50) y el área bajo la curva de la mortalidad acumulada (ABCMA). Los valores menores de TL50 y mayores de ABCMA se observaron en la cepa Pae–sin con 3.2 d y 311.93 unidades, y en Pf–Hal con 3.7 d y 301.93 unidades. El análisis de los resultados indica que no hubo una relación clara entre la capacidad de desarrollo in vitro de los aislamientos y su virulencia sobre los estados inmaduros de B. tabaci.
Palabras clave: Bemisia tabaco, control biológico, entomopatógenos.
ABSTRACT
]]> The use of chemical insecticides in the management of whitefly (Bemisia tabaci) (Gennadius) causes serious damage to the environment and has generated populations resistant to conventional products. A promising alternative is biological control by using entomopathogenic fungi. In the present study the in vitro development and pathogenicity of four native strains (Pf–Tim–Tiz Pf, Pf–Hal, Pf–Rg), as well as a commercial (Pae–sin) of Paecilomyces Jumosoroseus (Wize) Brown & Smith were evaluated in eggs and first instar nymphs of Bemisia tabaci (Gennadius). The variables to assess the in vitro development were: daily growth rate of the colony (TCD), sporulation and spore germination rate (TGE). The pathogenicity of the strains was determined by dipping the leaves of Capsicum chinense, which contained the immature stages of B. tabaci in a conidial suspension 1×107 spores mL–1. The TCD of the strain Pae–sin (1.63 mm d–1) was higher (p<0.05) than that of Pf–Hal (1.40 mm d–1) and Pf–Rg (1.35 mm d–1). Sporulation was not different (p> 0.05) between native isolates and the commercial strain. The TGE was higher (p<0.05) in Pf–Rg (22 % h–1) than that observed in other native strains and Pae–sin (11.91 to 12.50 %). All fungi were more pathogenic in nymphs than in eggs; the mortality of eggs and nymphs ranged from 29.8 to 45.5 % and from 51.4 to 74.5 %. With the data of mortality in nymphs, mean lethal time (TL50) and the area under the curve of cumulative mortality (ABCMA) were calculated. The lowest values of TL50 and the highest of ABCMA were observed in the strain Pae–sin with 3.2 d and 311.93 units and in Pf–Hal with 3.7 d and 301.93 units. The analysis of the results indicates that there was no clear relationship between the in vitro development capacity of the isolates and their virulence on B. tabaci immature stages.Keywords: Bemisia tabaci, biological control, entomopathogenic microorganisms.
INTRODUCCIÓN
La mosquita blanca (Bemisia tabaci) (Gennadius) (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga primaria de especies de plantas de importancia económica, principalmente hortalizas, cultivos básicos y ornamentales (Gutiérrez et al., 2007). B. tabaci destaca por causar daños en forma directa mediante la succión de savia, e indirecta, al transmitir begomovirus y manchar el producto con la excreción de sustancias azucaradas sobre las cuales se desarrollan hongos formadores de fumaginas (Ortega, 2002).
Las altas poblaciones de B. tabaci en los cultivos conducen a realizar repetidos tratamientos de insecticidas químicos con resultados no satisfactorios. Esta práctica causa riesgos para la salud humana, altos niveles de contaminación ambiental, generación de poblaciones resistentes y efectos negativos en la fauna benéfica (Basso et al., 2001). Por ello, el uso de microorganismos entomopatógenos es una alternativa promisoria al problema de plagas como la mosquita blanca y al uso excesivo de insecticidas químicos. Más de 20 especies de hongos infectan mosquitas blancas, entre las que destacan las que pertenecen a los géneros Paecilomyces, Verticillium, Aschersonia, Beauveria y Metarhizium (Pozo y Rodríguez, 2003).
El hongo Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith (Deuteromycotina: Hyphomycetes) es un patógeno de amplio intervalo de hospederos y gran distribución geográfica, que ha sido aislado del suelo y de insectos de diversos órdenes como homópteros, coleópteros y colémbolos. La patogenicidad de este hongo en B. tabaci y su uso potencial como biocontrolador está documentado (Osborne y Landa, 1992; Pozo y Rodríguez, 2003), y se ha desarrollado con éxito algunos productos comerciales derivados del mismo: PreFeRal® en Bélgica, Bemesin® en Venezuela y Pae–sin® en México.
La evaluación de nuevos aislamientos para detectar aquéllos con mejores características es una labor preponderante. Las cepas nativas podrían tener mayor potencial patogénico para el manejo regional de B. tabaci por estar adaptadas a las condiciones ambientales específicas de esas áreas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue caracterizar el desarrollo in vitro de cuatro aislamientos nativos y uno comercial de P. fumosoroseus y comparar su patogenicidad en estados inmaduros de B. tabaci.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Establecimiento de la colonia de B. tabaciLa colonia de B. tabaci se estableció en el invernadero de adaptación del Instituto Tecnológico de Conkal (ITC), Conkal, estado de Yucatán, México, en jaulas entomológicas de 1.2 × 1.2 × 1.0 m construidas con aluminio y malla antiáfidos de 16/16 hilos cm2. Los adultos de B. tabaci fueron recolectados de cultivos de chile habanero (Capsicum chínense Jacq.) del área de producción hortícola del ITC. La identidad de los insectos se corroboró con base en las características morfológicas de las ninfas (Ortega, 2002). Los insectos fueron confinados con plántulas de C. chinense de 30 d de edad, establecidas en macetas de plástico con sustrato cosmopeat (Cosmocel®, Canadá). Los adultos ovipositaron por 48 h en las plantas de C. chinense y fueron retirados para iniciar la colonia con los huevos que estaban en las hojas. Debido al daño que la alta población de adultos producía a las plantas, éstas se sustituyeron cada 15 a 20 d para proveer de hospederos nuevos a B. tabaci.
Multiplicación de los aislamientos
Las cepas nativas de P. fumosoroseus se aislaron de mosquitas blancas y fueron proporcionadas por el Laboratorio de Reproducción de Hongos Entomopatógenos del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado de Yucatán. La identidad de los hongos fue confirmada mediante características morfológicas y coloración del conidio, conidióforo y colonia, de acuerdo a Humber (1998) y Barnett y Hunter (2003).
Los aislamientos Pf–Tim, Pf–Tiz y Pf–Hal son originarios de Yucatán y Pf–Rg de Zacapa, Guatemala. Se incluyó una cepa de referencia comercialmente disponible conocida como Pae–sin (Agrobionsa, México). Los hongos fueron reactivados en medio artificial Sabouraud–Dextrosa–Agar (SDA) (Merck, Alemania) más 0.5 mg L–1 de cloranfenicol (Lab. Sophia S. A. de C. V. México) y desarrollados en laboratorio a 27±3 °C y 14 h de fotoperíodo.
Desarrollo in vitro de los aislamientos
El desarrollo in vitro se evaluó mediante la tasa de crecimiento diario de la colonia (TCD), esporulación y tasa de germinación de esporas (TGE). La TCD se midió usando la metodología de Skrobek (2001). Se colocó 1 µL de una solución conidial de 1 × 107 esporas mL–1 en el centro de cada caja petri (60 × 15 mm) que contenía 10 mL de medio de cultivo SDA; las cajas petri inoculadas se incubaron en las condiciones antes descritas. El diámetro de la colonia se midió diariamente (15 d) por el reverso de la caja petri para calcular su tasa de crecimiento (mm d–1).
La producción de esporas se determinó con la metodología descrita por Gindin et al. (2000). En las cajas petri con las colonias usadas para evaluar el crecimiento diametral se agregó 10 mL de agua destilada esterilizada más 5 µL de Tween 80 (Merck, Alemania). Luego la colonia se raspó con una espátula esterilizada y el producto obtenido se filtró a través de una gasa esterilizada para separar los conidios de las impurezas y micelio. La concentración de esporas de la solución conidial se determinó usando una cámara de Neubauer doble rayado línea regular (Marienfeld, Alemania) y un microscopio estereoscópico (Modelo BME L13395H11, Leica Inc., USA).
La evaluación del TGE se efectuó con la metodología de Berlanga–Padilla y Hernández–Velázquez (2002). Se colocaron cinco gotas de 2 µL de una suspensión conidial de 1×107 esporas mL–1 en cajas de petri (100×15 cm) con medio SDA; sobre las gotas se colocaron cubreobjetos para la observación. Cada hora se contabilizaron 100 esporas al azar y se registró su tasa de germinación (% h–1), considerando como germinadas aquellas que presentaban un tubo germinativo con una longitud igual o mayor que la de la espora.
Obtención de estados inmaduros de B. tabaci para los bioensayos
]]> Plantas de C. chinense de 30 d de edad se usaron como hospederas de B. tabaci. Los estados inmaduros se obtuvieron con la metodología de Muñiz y Nombela (2001). Cinco adultos de la colonia de B. tabaci se tomaron con un aspirador bucal y se depositaron en una jaula pinza de 1 cm de diámetro. Las microjaulas se colocaron en hojas completamente extendidas de la parte superior de las plantas hospederas; los adultos y las jaulas pinza se retiraron a las 24 h y los huevos ovipositados se usaron inmediatamente. Para los bioensayos con ninfas los huevos se dejaron en las hojas por 5 a 7 d hasta obtener ninfas de primer instar.Patogenicidad de P. Jumosoroseus en huevecillos y ninfas de B. tabaci
Las suspensiones conidiales se obtuvieron de las colonias cultivadas en medio SDA, como ya se describió (Gindin et al., 2000). Los conidios de P. fumosoroseus se aplicaron a los inmaduros de B. tabaci según la metodología de Al–Deghairi (2008). Soluciones conidiales de 1 × 107 esporas mL–1 se aplicaron por inmersión de las hojas de C. chinense que contenían los huevos o ninfas por 15 s. El testigo fue tratado con agua destilada esterilizada más Tween 80 al 0.05 % v/v. Las plantas con las hojas tratadas se mantuvieron en el laboratorio a 27±3 °C y humedad relativa de 75 ±8 % para evaluaciones diarias de la mortalidad de huevos por 7 d y de ninfas por 12 d. Se usó un microscopio estereoscópico para observar los individuos muertos, contabilizando como huevos muertos los micosados, deformes y no eclosionados (Gindin et al., 2000; Skrobek, 2001). En los bioensayos con ninfas se consideraron como muertas aquéllas con cambios de coloración, brillo, forma, aspecto del cuerpo y recimiento de micelio sobre éstas (Pozo y Rodríguez, 2003).
Diseño experimental y análisis de datos
El diseño experimental fue completamente al azar con cinco repeticiones. Los experimentos de desarrollo in vitro se analizaron (ANDEVA y comparación de medias Tukey, p< 0.05) usando GraphPad InStat (GraphPad Software Inc., 2000). Para los experimentos de crecimiento de la colonia y esporulación, las unidades experimentales fueron las cajas petri con las colonias de los hongos; para la variable tasa de germinación de esporas, la unidad experimental fue un grupo de 100 esporas observadas al azar, y sembradas en cajas petri con medio SDA. Para los bioensayos con huevos y ninfas la unidad experimental fue un grupo de 25 a 30 huevos o ninfas establecidas en una hoja. Los datos de los bioensayos se analizaron con SAS ver. 8e para Windows (SAS Institute Inc., 2000), con el cual se calculó el TL50 mediante análisis probit. El área bajo la curva de la mortalidad acumulada (ABCMA) se calculó con la siguiente ecuación (Campbell y Madden, 1990):
donde, n es el número de evaluaciones; y es el porcentaje acumulado de mortalidad; t es el número de días entre cada evaluación. La primera evaluación se realizó con t=1 y y=0.
RESULTS Y DISCUSSION
Desarrollo in vitro del hongo
]]> La tasa diaria de crecimiento diametral fue significativamente diferente (p<0.05) entre los aislamientos (Cuadro 1); la cepa de referencia Pae–sin y la nativa Pf–Tiz mostraron mayor crecimiento diametral que Pf–Rg. Las tasas de crecimiento diametral de Pf–Hal, Pf–Tim y Pf–Rg no fueron diferentes (p>0.05).La producción de esporas no fue diferente (p>0.05) entre los aislamientos nativos y el de referencia (Cuadro 1); la cantidad de esporas producidas varió de 2.06 a 2.49×106 esporas mL–1. La tasa de germinación de las esporas de Pf–Rg (22.9 % h–1) fue más alta (p<0.05) que la de la cepa Pae–sin (Cuadro 1). Cabe mencionar que en todos los aislamientos se alcanzó 100 % de germinación de esporas, 10 h después de su siembra en medio SDA.
Skrobek (2001) reporta crecimientos de 3.6 mm d–1 en dos aislamientos de P. fumosoroseus sembrados en medio SDA. La tasa alta de crecimiento diametral de la colonia en ese experimento pudo deberse a que la incubación se efectuó en oscuridad total, mientras que en el presente experimento las colonias se expusieron a luz y obscuridad. En algunos hongos la luz puede inducir degradación o inhibir la síntesis de compuestos esenciales para el crecimiento, como la riboflavina y el ergosterol (Yusef y Allam, 1967; Seviour y Codner, 1973; Trigos y Ortega–Regules, 2002). Respecto a la esporulación, es difícil comparar los resultados obtenidos aquí con los observados por otros autores debido a la influencia de la metodología de extracción de las esporas en la concentración conidial de las suspensiones. En la presente investigación se requirieron 10 h para lograr la germinación de todas las esporas, en tanto que en otros estudios se necesitó 24 h para obtener el mismo resultado (Vidal et al., 1997).
Patogenicidad de Paecilomyces fumosoroseus en inmaduros de B. tabaci
Patogenicidad en huevos
P. fumosoroseus causó 29.8 a 45.5 % de mortalidad en huevos de B. tabaci 7 d después de la aplicación (dda). No hubo diferencias significativas (p>0.05) en la mortalidad de huevos por efecto de las cepas nativas y de referencia (Cuadro 2), mientras que el testigo mostró 9.8 % de mortalidad. En general, en este experimento los valores de mortalidad en huevos fueron dos veces más altos que los reportados por Lacey et al. (1999) para P. fumosoroseus. Es conveniente mencionar que otras especies de hongos entomopatógenos como Verticillium lecanii (a concentraciones de 1×107 esporas mL–1) han ocasionado sólo14 a 26 % de mortalidad sobre huevos de B. tabaci (Gindin et al., 2000), valor bajo con respecto a lo observado en el presente estudio. En contraste, Skrobek (2001) reportó que Metarhizium anisopliae causó 33 a 45 % de mortalidad 6 dda en B. tabaci. Según estos antecedentes, todos los aislamientos nativos evaluados en el presente trabajo, excepto Pf–Rg, presentan buen potencial ovicida sobre B. tabaci.
Patogenicidad en ninfas
Los porcentajes de mortalidad en ninfas por efecto de la aplicación P. fumosoroseus fueron mayores que los observados en huevos, registrándose más del 50 % de mortalidad en todos los aislamientos probados, sin diferencias significativas entre las cepas nativas y la de referencia (Cuadro 2). Sin embargo, hubo diferencias (p<0.05) respecto al testigo con 10.9 % de mortalidad. Estos resultados concuerdan con los reportados por Osborne et al. (1990) quienes encontraron 70 a 90 % de mortalidad en ninfas usando P. fumosoroseus (1.0×106 esporas mL–1).
]]> P. fumosoroseus también ha mostrado efectividad en estudios in vitro con otras especies de mosquitas blancas, como Trialeurodes vaporariorum. Al respecto, la aplicación de nueve aislamientos de P. fumosoroseus (1×107 conidios mL–1) ocasionó más de 70 % de mortalidad acumulada (Ayhan y Kubilay, 2005). La mortalidad de ninfas es 80 % al usar 1.2×106 esporas mL–1 (Avery et al., 2004), pero es mayor a 90 % al utilizar 1×106 conidios mL–1 (Sterk et al., 1996; Veire et al., 1996). Coincidentemente, la virulencia de los aislamientos nativos de P. fumosoroseus evaluados en el presente estudio son considerados similares a los reportados anteriormente en ninfas de mosquitas blancas.Se considera que la capacidad patogénica está directamente asociada con la velocidad de crecimiento y germinación de los hongos entomopatógenos (Heale et al., 1989; Estrada–Valencia et al., 1997), por lo que se esperaba que tanto la cepa de referencia Pae–sin como la nativa Pf–Rg fueran las más virulentas en inmaduros de B. tabaci, lo cual no ocurrió. Lo anterior indica que existen otros factores críticos que determinan en gran medida la virulencia de los hongos, como la producción de enzimas que degradan la cutícula y permiten la penetración rápida del hongo al cuerpo de los insectos (Jiang et al., 2003), o la producción de metabolitos secundarios que suprimen la reacción del sistema inmune (Vey et al., 1982).
La menor actividad de los hongos en huevos respecto a la observada en ninfas pudo deberse a la poca cantidad de conidios que entra en contacto con los huevos debido a su forma y tamaño. Además, los huevos presentan partículas cerosas provenientes de los adultos que limitan el contacto directo entre los conidios y el corion del huevo. También es posible que estos lípidos inhiban la germinación de las esporas de los hongos entomopatópogenos debido a la reducción de la cantidad de humedad sobre la superficie del corion, como lo reportan James et al. (2003).
Área bajo la curva de la mortalidad acumulada (ABCMA) y tiempo letal medio (TL50)
Para obtener otras variables que permitieran conocer la capacidad patogénica de los hongos evaluados, se determinó para ninfas el área bajo la curva de la mortalidad acumulada (ABCMA) a los 7 dda de los hongos y el tiempo letal medio (TL50). Al respecto, no hubo diferencias significativas (Cuadro 3) en el ABCMA entre los aislamientos nativos y el de referencia. El TL50 varió de 3 a 7.5 d (Cuadro 3) y hubo diferencia significativa (p<0.05) con base en el traslape de los intervalos de confianza. El valor calculado para Pf–Hal no fue significativamente diferente del de la cepa de referencia Pae–sin, pero sí respecto al de Pf–Tiz y Pf–Rg. Según Balogun y Fagade (2004), los valores de TL50 están directamente relacionados con la capacidad patogénica de los hongos. En el presente estudio el aislamiento nativo más patogénico en ninfas, según la evaluación del porcentaje de mortalidad a los 12 dda, fue Pf–Hal que también sobresalió en el ABCMA y se destacó por su menor TL50. Respecto a la relación tiempo–mortalidad, Gindin et al. (2000) indican valores de TL50 de 3 a 3.8 d para algunas cepas de P. fumosoroseus en ninfas de B. tabaci, muy similares a los obtenidos con el aislamiento nativo Pf–Hal. En otras especies de mosquitas blancas, P. fumosoroseus presenta un valor promedio de TL50 de 3 d cuando se aplica a concentraciones de esporas similares a las probadas en el presente estudio (Pozo y Rodríguez, 2003). Esto indica que la cepa nativa Pf–Hal podría considerarse por sus características patogénicas, un componente importante en programas de control microbiológico de B. tabaci.
CONCLUSIONES
La tasa de crecimiento diario fue mayor en el aislamiento comercial Pae–sin con respecto a los nativos Pf–Hal y Pf–Rg. La esporulación fue similar en los aislamientos nativos y Pae–sin, en tanto que la germinación de esporas fue significativamente mayor en el aislamiento Pf–Rg. P. fumosoroseus fue más patogénico en ninfas que en huevos de B. tabaci. En ninfas, el efecto del aislamiento Pf–Hal sobresalió del resto de los nativos, con base en el tiempo letal medio. No se observó una relación clara entre la capacidad de desarrollo in vitro de los aislamientos y su patogenicidad en estados inmaduros de B. tabaci. Con base en los valores de TL50, el aislamiento nativo Pf–Hal es promisorio para el control biológico de estados inmaduros de B. tabaci.
AGRADECIMIENTOS
]]> Se agradece la colaboración del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Yucatán por el aislamiento de las cepas nativas de P. fumosoroseus. También se otorga especial agradecimiento a la Dra. Gabriela Heredia del Instituto de Ecología por la identificación de los hongos, así como a Basilio Uch, Francisco Couoh y Agatha Rosado, alumnos del Instituto Tecnológico de Conkal, por su apoyo en el desarrollo de los experimentos.
LITERATURA CITADA
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