La citocinina BAP retrasa senescencia, aumenta antioxidantes, proteina y crecimiento en el pasto ovillo (Dactylis glomerata L.)
The cytokinin BAP delays senescence and increases antioxidants, protein and growth in orchard grass (Dactylis glomerata L.)
Claudia Y. Wilson–García1, Hilda A. Zavaleta–Mancera1*, Humberto López–Delgado2 y Alfonso Hernández–Garay3
1 Botánica, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). 52140. Metepec, Estado de México. México. * Autor responsable: (arazavaleta@colpos.mx)
2 Programa Nacional de Papa, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). 52140. Metepec, Estado de México. México.
]]> 3 Ganadería. Campus Montecillo Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México. México.
Recibido: Noviembre, 2007.
Aprobado: Octubre, 2008.
Resumen
La senescencia es una de las principales causas en la reducción de la calidad nutritiva y área verde de los forrajes. Las citocininas promueven el retraso de la senescencia foliar, pero poco se conoce de su efecto en la regulación del estrés oxidativo en forrajes. En el presente trabajo se evaluó el efecto de la citocinina 6–bencilaminopurina (BAP) en el crecimiento, senescencia, proteína soluble (PS), ácido ascórbico (AA), peróxido de hidrógeno (H2O2) y actividad de la ascorbato peroxidasa (APX) en el pasto ovillo (Dactylis glomerata L.). Plantas de 10 meses de edad para medir crecimiento y de cuatro meses de edad para evaluar APX, AA, H2O2 y proteína soluble (PS) fueron cortadas a 5 cm sobre el nivel del suelo; luego fueron asperjadas semanalmente por siete semanas con una solución BAP 0.1 mM. El diseño experimental fue completamente al azar. Los resultados se analizaron con una ANOVA (SAS, 1995) y las medias se compararon con una prueba de Tukey (p<0.05). Las aspersiones con BAP aumentaron (p<0.05) la elongación y el crecimiento de la hoja (cm tallo –1) en 36% a la semana 17 después del corte. La senescencia foliar acumulada por tallo (cm tallo –1) se redujo (p<0.05) en las plantas con BAP, y se retrasó la senescencia desde la semana 13 después del corte. Las hojas asperjadas con BAP aumentaron (p<0.05) su PS en 18% a los 47 d después del corte (DDC) con respecto al registrado a los 14 DDC y superaron (p<0.05) en 64% al testigo. En las plantas con retraso de senescencia (BAP) aumentó el contenido de AA, la actividad APX y el H2O2. Se concluye que la citocinina BAP promovió el crecimiento, acumulación de proteína soluble y retrasó la senescencia foliar, regulando la señalización mediante el H2O2, en la acumulación de AA y actividad de la APX, con una función protectora ante el estrés oxidativo de la senescencia.
Palabras clave: Dactylis glomerata, ácido ascórbico (AA), ascorbato peroxidada (APX), crecimiento, senescencia, 6–bencilaminopurina.
Abstract
]]> Senescence is one of the main causes in the reduction of forage nutritive quality and green area. Cytokinins promote delay of leaf senescence, but little is known of their effect on regulation of oxidative stress in forages. This study assessed the effect of the cytokinin 6–benzylaminopurine (BAP) on growth, senescence, soluble protein (PS) ascorbic acid (AA), hydrogen peroxide (H2O2), and activity of ascorbate peroxidase (APX) in orchard grass (Dactylis glomerata L.). Ten–month–old plants were used to measure growth and 4–month–old plants were used to assess APX, AA, H2O2, and soluble protein (PS). After cutting the plants 5 cm above ground level, they were sprayed weekly for seven weeks with a BAP (0.1 mM) solution. The experimental design was completely random. Results were analyzed with ANOVA (SAS, 1995), and means compared with the Tukey test (p£0.05). Spraying with BAP increased (p<0.05) leaf elongation and growth (cm stem–1) by 36% 17 weeks after cutting. Accumulated leaf senescence per stem (cm stem –1) decreased (p<0.05) in plants treated with BAP, and senescence was delayed from week 13 after cutting. Leaves sprayed with BAP increased (p<0.05) PS by 18% between 14 and 47 d after cutting and surpassed (p<0.05) the control by 64%. In plants with delayed senescence (BAP) the AA content, APX activity, and H2O2 increased. It is concluded that the cytokinin BAP promoted growth, accumulation of soluble protein, and delayed leaf senescence, by regulating signaling through H2O2, in AA accumulation and APX activity, with a protective function against the oxidative stress of senescence.Key words: Dactylis glomerata, ascorbic acid, ascorbate peroxidase, growth, senescence, 6–benzylaminopurine.
INTRODUCCIÓN
En los sistemas intensivos de producción pecuaria se requieren alternativas como la producción en pastoreo, con pasto ovillo (Dactylis glomerata L.), ballico perenne (Lolium perenne L.) y praderas asociadas con alfalfa (Medicago sativa L., en zonas templadas. Además, la determinación de las curvas de crecimiento de las plantas forrajeras (Velasco–Zebadúa et al., 2001) permiten mejorar la productividad y calidad del forraje, reduciendo los efectos de la edad y su deterioro (Hodgson y Brookes, 1999). Los pastos después de la madurez sufren envejecimiento o senescencia foliar, que es un tipo de muerte celular programada y un proceso degenerativo genéticamente regulado (Buchanan–Wollaston et al., 2003). En la senescencia foliar hay pérdida de clorofila y de actividad fotosintética; se reducen las proteínas, ARN y el tejido sufre estrés oxidativo con la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO): oxígeno en estado singulete (1O2), superóxido(O–2), radicales hidroxilo (OH –) y H2O2 que dañan la célula y contribuyen a la muerte de la planta (Prochazkova et al., 2001). Los principales sistemas antioxidantes en las células vegetales son: 1) compuestos de destoxificación enzimáticos: catalasa (CAT), peroxidasas (POX), superóxido dismutasa (SOD), glutatión reductasa; 2) no enzimáticos: ácido ascórbico (AA), carotenoides, antocianinas (Foyer y Noctor, 2005). En condiciones normales estos mecanismos de protección pueden controlar la concentración de ERO y reducir sus efectos (Scandalios, 2005). Durante la senescencia foliar hay un desequilibrio porque aumenta la concentración de ERO y disminuye la producción de antioxidantes. Entonces, un aumento en los mecanismos antioxidantes es determinante en la protección al estrés oxidativo (Foyer y Noctor, 2005).
La citocinina 6–bencilaminopurina (BAP) puede retrasar la senescencia foliar de varias especies (Gan y Amasino 1996), reduciendo la degradación de pigmentos, de proteínas fotosintéticas y membranas cloroplásticas y manteniendo el equilibrio hídrico del tejido (Dangl et al., 2000), pero poco se conoce de su efecto biológico en el crecimiento, contenido de proteína y balance oxidativo en el pasto ovillo. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de la citocinina BAP en el crecimiento, senescencia y acumulación de proteína soluble en pasto ovillo, midiendo la respuesta antioxidante enzimática (APX) y no enzimática (AA), y la acumulación de H2O2 durante la senescencia.
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se efectuó en los invernaderos de Botánica, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México, (48' 27'' O y 19° 48' 23'' N). Se sembró un promedio de 27 semillas de pasto ovillo por maceta (30 kg ha–1) en 135 macetas (23.5 cm diámetro; 20 cm profundidad) con una mezcla 1:1:1 de suelo arcillo–arenoso (prevaleciente en Montecillo), sustrato comercial (peat–moss comercial, COSMOCEL) y agrolita estéril (Dicalite de México). Desde la siembra (03 de marzo 2005) a su establecimiento (tres meses) las plantas fueron regadas cada tercer día, y después cada 4 d.
Crecimiento foliar y retraso de senescencia
]]> Se usaron ocho macetas con plantas de 10 meses de edad y se tomaron datos del 31 de enero al 30 de mayo de 2006. Los tratamientos (cuatro macetas en cada uno) fueron: 1) una solución BAP 0.1 mM (0.1 mM 6–bencilaminopurina, 0.02% dimetilsulfóxido (DMSO) y 0.02% Tween 20 en agua); 2) una solución testigo (0.02% DMSO y 0.02% Tween 20 en agua). Se hizo un corte de uniformización a 5 cm del suelo y una semana después se asperjaron semanalmente (en siete ocasiones) con 100 mL de solución de BAP y testigo por maceta, a las 07:00 h.Las mediciones se hicieron en cinco tallos por maceta, seleccionados al azar (Bircham y Hodgson, 1983). Los tallos se identificaron con etiquetas plásticas de colores. En cada hoja de cada tallo marcado se midió la longitud total de la lámina (distancia de la lígula al ápice); la longitud de la parte verde y la longitud de la parte senescente se calculó por diferencia de las anteriores. Las longitudes de la parte senescente y de la parte verde se sumaron y dividieron entre cinco tallos por repetición, para obtener el promedio por tallo. Los datos se reportan (cm tallo–1) como crecimiento acumulado, senescencia acumulada y crecimiento neto de la hoja (diferencia entre crecimiento acumulado y la senescencia acumulada.
Proteína soluble y actividad antioxidante
En plantas (100 macetas) de cuatro meses de edad (5 de julio) se hizo un corte de uniformidad, a 5 cm del nivel del suelo. El experimento inició el 12 de julio y terminó el 22 de septiembre de 2006. De cada tallo se marcó (corrector tipográfico) la hoja más joven expuesta, para monitorear cada día el crecimiento de las hojas nuevas. Se muestrearon: hojas jóvenes, 7 d después del corte (DDC); parcialmente expandidas, sin lígula expuesta; hojas maduras (14 DDC), con lígula expuesta y totalmente expandidas. Desde 14 DDC edad (hojas maduras) 50 macetas fueron asperjadas semanalmente (siete aspersiones) con solución BAP y 50 con solución testigo. Se muestrearon hojas senescentes (47 DDC) con 30–40% de senescencia y hojas (59 DDC) con 50–60% de senescencia de plantas testigo y asperjadas con BAP. La actividad de ascorbato peroxidasa (APX) se midió según Jiménez et al. (1997); el contenido de ácido ascórbico (AA) según Noctor y Foyer (1998) y la proteína soluble (PS) según Bradford (1976). El contenido de H2O2 se determinó con el método de quimioluminiscencia (Warm y Laties, 1982).
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar. Los resultados se analizaron con ANO VA (SAS, 1995) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Crecimiento foliar y retraso de senescencia
Las aspersiones BAP promovieron la elongación de la hoja (crecimiento acumulado; Figura 1A) desde la semana tres del corte; en la semana seis las plantas tratadas aumentaron (p<0.05) su crecimiento con respecto a las testigo y en la semana 17 el crecimiento acumulado fue 36% superior al testigo. En las primeras cuatro semanas el crecimiento neto no fue diferente (p>0.05) entre tratamientos (Figura 1C), mientras que las plantas testigo desde la semana 15 mostraron una caída marcada hasta alcanzar valores negativos, ya que las pérdidas por descomposición superaron al crecimiento foliar. Al respecto, Chapman y Lemaire (1993) mencionan que al final de la curva de acumulación de forraje las pérdidas por senescencia superan al crecimiento y, por tanto, se reduce la acumulación neta de forraje. Según Velasco–Zebadúa et al. (2001), en pasto ovillo las máximas tasas de crecimiento ocurren en la semana tres de primavera, en la cuarta de verano, en la sexta de otoño y en la séptima de invierno; después las tasas de crecimiento disminuyen debido a un aumento progresivo de tallos y material senescente. El mayor crecimiento en pasto ovillo se relaciona con una promoción de la división y el alargamiento celular, efectos conocidos de las citocininas en cotiledones y hojas de mostaza (Brassica nigra) cucurbitáceas (Cucurbita pepo) y girasol (Helianthus annuus) (Taiz y Zeiger, 2002). Además, la extensión de la pared celular es regulada por auxinas y citocininas; la falta de citocininas detiene la fase G2 del ciclo celular (Jacobs, 1995).
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La senescencia acumulada no cambió (p>0.05) en las primeras semanas (Figura 1B), pero desde la semana 11 el BAP redujo la senescencia; en la semana 17, las plantas asperjadas con BAP tuvieron 28.6% menos senescencia que las testigo. Estos resultados son nuevos para el pasto ovillo donde el BAP puede retrasar su senescencia foliar y prolongar la vida de las hojas verdes, como ha sido observado en hojas de otras especies: arroz, Oriza sativa (Ookawa et al., 2004); maíz, Zea mayz (He et al., 2005); trigo, Triticum aestivum (Zavaleta–Mancera et al., 2007) donde el retraso de la senescencia foliar está asociado con retenciones de clorofila (50–70%) y una disminución de clorofilasas, nucleasas y proteasas. Durante la senescencia natural disminuyen las concentraciones de citocininas en el xilema (Gan y Amasino, 1996); entonces, las aspersiones con BAP compensaron las deficiencias de este regulador en las hojas y retrasaron el envejecimiento en pasto ovillo. Se midió el porcentaje de senescencia en la hoja y no la clorofila en el pasto ovillo, ya que su patrón de senescencia se presenta como muerte foliar, la cual inicia en el ápice y avanza hacia la base de la lámina (basípeta). Además, en forrajes la senescencia se mide como presencia de material muerto (Hernández–Garay et al., 1997; Velasco–Zebadúa et al., 2001).
Contenido de proteína soluble, antioxidantes y peróxido de hidrógeno
En las hojas testigo el mayor contenido de PS (11.0±0.49 mg g–1 tejido) ocurrió a los 14 DDC en hojas maduras, pero luego disminuyó con la edad (Figura 2. A los 47 DDC las hojas presentaron 30–40% de senescencia y 50–60% a los 59 DDC. En contraste, las hojas asperjadas con BAP mantuvieron el contenido de PS e incluso aumentó (p<0.05) 18% a los 47 DDC respecto a los 14 DDC, y 64% respecto a las testigo. A los 59 DDC las plantas con BAP tuvieron 2.5 veces más PS que las testigo (senescentes). Estos resultados concuerdan con lo observado en hojas de trigo, donde aplicaciones de BAP retuvieron 60% de clorofila y 77% de PS (Zavaleta–Mancera et al., 2007). Las citocininas pueden promover la síntesis de proteínas cloroplásticas, las cuales constituyen 70% de la PS en una hoja verde (Dangl et al., 2000). Así, en el presente experimento, la aplicación de BAP en pasto ovillo retrasó la pérdida de PS durante la senescencia, pero promovió su acumulación a los 47 y 59 DDC.
El contenido de AA aumentó (p<0.05) en los primeros 47 DDC, (1.5 µmol mg–1 tejido), pero disminuyó (p<0.05) durante la senescencia (59 DDC) en las plantas testigo (Figura 3A). En contraste, en las hojas asperjadas con BAP el contenido de AA aumentó (p>0.05) a los 47 DDC (2.1 µmol mg–1 tejido) y a los 59 DDC (2.5 µmol mg–1 tejido) respecto a las plantas testigo (1.5 y 1.2 µmol mg–1tejido). La actividad de APX también aumentó (p<0.05) a los 47 DDC (27%) y 59 DDC (79.5%) respecto a las hojas testigo (Figura 3B). Estos resultados concuerdan con Liu y Huang (2002) y Zavaleta–Mancera et al., (2007), quienes proponen que las citocininas activan la defensa antioxidante y retrasan el daño oxidativo durante la senescencia.
CONCLUSIONES
La aplicación de 6–bencilaminopurina BAP (0.1 mM) retrasó la senescencia foliar del pasto ovillo; a las 17 semanas se redujo 28.6% y a los 59 d la PS aumentó 2.5 veces. Además, BAP promovió la acumulación de ácido ascórbico (AA). Se propone que uno de los mecanismos de retraso de senescencia en el pasto ovillo es mediante el aumento de los antioxidantes APX, AA aumentando la protección al daño de membranas durante la senescencia foliar. Entonces, se podría manipular la senescencia en una pradera lo cual ofrece ventajas para su aprovechamiento y manejo, además de los aumentos en proteína y AA que podría mejorar su calidad nutritiva.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo fue financiado por el proyecto CONACYT–SEP 43866–Z y es parte de la investigación de maestría del primer autor.
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