Tomato spotted wilt virus: agente causal de la marchitez del Miguelito (Zinnia elegans Jacquin) en el Estado de Morelos, México

Tomato spotted wilt virus: causal agent of wilt in "Miguelito" (Zinnia elegans Jacquin) in Morelos, Mexico

Ma. Valeria Morales–Díaz, Salomé Alcacio–Rangel y Rodolfo De La Torre–Almaraz

Laboratorio de Microbiología. Unidad de Biotecnología y Prototipos. FES–Iztacala, UNAM. Avenida De los Barrios No 1. 54090. Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México (drodolfo@servidor.unam.mx)

Resumen

Se observaron síntomas de moteado, manchas necróticas anulares, enanismo y marchitez severa en plantas de miguelito (Zinnia elegans Jacquin) (Fam: Compositae) cultivadas en viveros comerciales del Estado de Morelos, México. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la etiología de esta enfermedad. Se identificó al virus marchitez manchada del tomate (Tomato spotted wilt virus. TSWV) como el agente causal de la enfermedad del miguelito con base en los ensayos de transmisión mecánica en plantas indicadoras y de patogenicidad en plántulas sanas de Z. elegans, cultivadas desde semilla en el invernadero. En las plantas el virus causó los síntomas de moteado, manchas necróticas en forma de anillos concéntricos, enanismo y marchitez, idénticos a los observados en plantas de miguelito cultivados en condiciones de campo. Se detectó por serología (DAS–ELISA) sólo al TSWV en plantas de miguelito con síntomas de marchitez procedentes de viveros comerciales del Estado de Morelos, en las plantas indicadoras usadas para separar al virus y en las plantas de miguelito producidas desde semilla inoculadas con el aislamiento puro de TSWV en el invernadero. La identidad taxonómica del TSWV se confirmó mediante secuenciación directa de los productos de la RT–PCR. Las secuencias obtenidas del TSWV de muestras de campo de miguelito (número de acceso EF067862) y del mismo virus separado de N. rustica (número de acceso EF067863) mostraron una homología en el fragmento amplificado del gen de la proteína de la cápside del TSWV del 100% entre ellas y del 93% con las existentes en la base de datos de lNCBI/GenBank de aislamientos del TSWV ampliamente distribuidos en el mundo. Este trabajo es el primer reporte de la presencia del TSWV en Z. elegans en México y se describen dos métodos moleculares para diagnosticar e identificar este virus.

Palabras clave: Zinnia elegans, plantas ornamentales, TSWV, virus.

Abstract

Mottle symptoms, necrotic ring spots, dwarfism, and severe wilt were observed on "miguelito" (Zinnia elegans Jacquin) (Fam: Comositae) plants cultivated in commercial nurseries in the State of Morelos, México. Therefore, this study was conducted to determine the etiology of the disease. Tomato spotted wilt virus (TSWV) was identified as the causal agent of the disease in miguelito by mechanical transmission tests on indicator plants and pathogenicity tests on healthy Z. elegans seedlings cultivated from seed in a greenhouse. On these plants the virus caused mottled symptoms, necrotic spots in the form of concentric rings, dwarfism and wilt, identical to those observed in miguelito plants cultivated in field conditions. Through serology (DAS–ELISA) only TSWV was detected in miguelito plants with wilt symptoms from commercial nurseries in the State of Morelos, in indicator plants used to separate the virus, and in miguelito plants produced from seed and inoculated with a pure isolate of TSWV in the greenhouse. Taxonomical identity of TSWV was confirmed by direct sequencing of the RT–PCR products. The TSWV sequences obtained from field samples of miguelito (access number EF067862) and the same virus separated from N. rustica (access number EF067863) showed 100% homology in the amplified fragment of the capsid protein gene of TSWV, while with the samples of TSWV isolates widely distributed over the world existing in the INCBI/GeneBank there was 93% homology. This paper is the first report of the presence of TSWV in Z. elegans in México, and two molecular methods for diagnosing and identifying this virus are described.

Key words: Zinnia elegans, ornamentals, TSWV, virus.

INTRODUCCIÓN

Durante recorridos, de enero a abril de 2006, en viveros comerciales de ornamentales en Cuautla, Morelos, se encontraron numerosas plantas de una especie ornamental de origen mexicano conocida localmente como miguelito (Zinnia elegans L.) (Fam: Compositae), con síntomas de manchas cloróticas y necróticas en forma de anillos concéntricos, reducción del tamaño de tallos, pérdida severa del color de pétalos y estructura floral, finalmente marchitez generalizada del follaje que fue el síntoma más conspicuo para reconocerla (Figura 1).

La información disponible no permitió determinar los patógenos que afectan al miguelito en México, ni tampoco se conoce el volumen y valor de la producción de esta planta, que se cultiva en maceta o en cepellón para adornar jardines y que se comercializa en viveros locales o en las centrales de abasto y mercados en el Distrito Federal. A pesar de la severidad de los daños causados por la marchitez en plantas comerciales de miguelito, no se conocen las pérdidas económicas causadas en el proceso productivo ni la distribución de esta enfermedad en todos los viveros dedicados a la producción de esta planta (observación personal).

Conocer a los patógenos relacionados con la marchitez del miguelito es importante para establecer medidas preventivas o curativas que reduzcan su impacto en la misma especie o en otras especies de ornamentales importantes cultivadas en el Estado de Morelos (Sosa et al., 1997). El análisis fitopatológico del material recolectado, en nuestro laboratorio, no mostró la presencia de hongos, bacterias o nemátodos; entonces se sospechó que estos daños pudieran ser causados por algún virus o patógenos similares. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la etiología de la enfermedad marchitez del miguelito (Z. elegans L.) que se produce en Morelos, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Separación de virus y pruebas de susceptibilidad en plantas indicadoras

Las plántulas de las especies indicadoras usadas para separar y caracterizar los virus asociados al miguelito fueron producidas desde semilla libres de virus en invernadero y que pertenecen al Banco de Semillas del Laboratorio de Virología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.

Pruebas de patogenicidad

Para probar los postulados de Koch, adaptados para el caso de virus, se seleccionaron 10 plántulas de Z. elegans con 10 hojas verdaderas de 15 cm de alto, producidas desde semilla, certificadas de estar libres de virus, mantenidas individualmente en vasos de unicel con suelo estéril en invernadero. Luego fueron inoculadas por transmisión mecánica con macerados de hojas de N. rustica y D. stramonium, las especies de hospedantes que mostraron los mismos síntomas en los diferentes ensayos de separación de virus, al inocularse con los macerados de hojas de miguelito con síntomas de marchitez seca recolectadas en campo (Dijkstra y De Jager, 1998).

Detección serológica de proteína viral por ensayo inmunológico ligado a enzimas (DAS–ELISA)

Se hizo la detección serológica de infecciones virales en muestras de miguelito recolectadas en campo, mediante la técnica ELISA (Clark y Adams, 1977; Chantler y Clayton, 1988), usando antisueros específicos comerciales para Tobacco mosaic virus (TMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Alfalfa mosaic virus (AMV), Impatiens necrotic spoted virus (INSV), Tomato spoted wilt virus (TSWV) y Tobacco etch virus (TEV) (Agdia, USA), a una dilución de 1/200. El ensayo serológico se hizo en las plantas indicadoras y en las usadas en las pruebas de patogenicidad. Las lecturas de las placas se hicieron a una longitud de onda de 405 nm (De La Torre et al., 2002).

Electroforesis de ARN de doble cadena de origen viral (ARN–dc)

Se obtuvo ARN de doble cadena de origen viral a partir de 3.5 g de hojas de diferentes plantas de miguelito con síntomas de manchas en forma de anillos cloróticos y marchitez, inoculadas con el virus procedente de muestras de campo. El ARN–dc se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida (6%), usando un minigel (1.75 mmX7 cmX8 cm) montado en una cámara Biorad doble. El volumen del extracto de ARN–dc viral de las muestras fue 40 µL por carril. Se incluyeron como marcadores de peso molecular (PM) el ARN–dc viral de CMV y una mezcla de ARN–dc viral de TSWV con CMV, ambos obtenidos de plantas tabaco (N. tabacum) inoculadas en invernadero; el testigo negativo fue un extracto de ARN–dc de plantas sanas de miguelito producidas en invernadero. La electroforesis se hizo a 100 V por 2:15 h a temperatura de laboratorio. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y después con solución de nitrato de plata (0.011 M) (Valverde et al., 1990).

Caracterización molecular por secuenciación de productos de la trascripción inversa ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT–PCR)

Se obtuvo ARN total de 0.1 g de hojas de Z. elegans, G. globosa y de N. rustica, inoculadas con macerados de hojas de miguelito con síntomas de marchitez seca, usando el kit RNA Reagent (InvitroGen, USA) y ARN–dc de origen viral por cromatografía con celulosa CF–11 (Valverde, 1990; Okuda y Hanada, 2001). El ARN se usó para el ensayo de la RT–PCR en un solo paso usando el Kit One–step RT–PCR Access (Promega, USA) con los oligonucleótidos TSWV–Sense (5'–ATG TCT AAG GTT AAG CTC–3') y TSWV–Antisense (5'–TTA AGC AAG TTC TGT GAG–3'), que amplifican una segmento del gen de la proteína de la nucleocapside (N) del componente S del TSWV (Pappu et al., 1996; Jain et al., 1998). Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento a 52 °C por 1 min y extensión a 72 °C por 1 min, por 35 ciclos y un solo ciclo a 72 °C por 10 min. Los productos de la RT–PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.0%, y su PM se calculó por comparación con el marcador de PM 1kb plus (GIBCO BRL) incluido en el mismo gel. La electroforesis se corrió a 80 V/85 min a temperatura de laboratorio (Surzycki, 1999).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Separación de virus por plantas indicadoras

Se confirmó la presencia de un solo virus en plantas de miguelito con síntomas de marchitez, recolectadas en invernaderos en Morelos, al inocular por transmisión mecánica los macerados de sus hojas a plantas sanas de las distintas especies indicadoras. Todas las plantas indicadoras usadas en los ensayos de transmisión mecánica mostraron alguna clase de síntomas 15 a 25 d después de la inoculación, tanto en los experimentos de inoculación directa de macerados de hojas de miguelito con síntomas de marchitez recolectados en campo como en los experimentos de separación de virus de plantas indicadoras a nuevas plantas indicadoras (Cuadro 1). Se seleccionaron plantas de N. rustica, D. stramonium y G. globosa como fuente de inóculo fresco del virus aislado de miguelito, por la persistencia de los síntomas y la longevidad de las plantas de estas especies en los invernaderos donde se incubaron.

Por la constancia en el tipo de síntomas observados en las especies de las plantas indicadoras usadas en este trabajo se concluyó preliminarmente que TSWV era el virus asociado con los síntomas de marchitez del miguelito. Por ejemplo, en C. annuum y D. stramonium se observaron en las hojas inoculadas lesiones locales cloróticas en forma de anillos concéntricos, que se transformaron en manchas anulares necróticas. Luego apareció necrosis de nervaduras y, finalmente, mosaico con deformación sistémica de las hojas apicales (Figura 2A). Pero en las distintas especies de tabaco, como N. rustica y N. glutinosa, se observaron lesiones locales cloróticas en forma de anillos concéntricos y después manchas anulares necróticas, mosaico y deformación sistémica severa de hojas apicales y, finalmente, necrosis y marchitez (Figura 2 B y C).

Se descartó la presencia del TEV asociado a los síntomas de marchitez en plantas de miguelito, ya que este virus sólo causa mosaico y jaspeado sistémico en plantas de tabaco, aunque es más típico en N. tabaco var. Xanthii y en D. stramonium mosaico y deformación, pero nunca manchas necróticas en forma de anillo y marchitez. Se descartó la presencia de TMV en plantas de miguelito ya que este virus causa lesiones locales necróticas a los 4 o 5 d postinoculación sin movimiento sistémico en D. stramonium, N. rustica y N. glutinosa. Situación similar es el caso del CMV, pues no se conoce si infecta naturalmente al miguelito, que causa moteados cloróticos en hojas inoculadas, eventualmente en forma de anillos cloróticos y mosaico sistémico en todas las especies de tabaco y chile, pero no causa ningún síntoma en D. stramonium (De La Torre et al., 2002).

Zinnia elegans es susceptible experimentalmente a 76 especies de virus entre las que destacan Alfalfa mosaic virus (AMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Tobacco etch virus (TEV), Tobacco rings–pot virus (TRSV), Tomato bushy stunt virus (TBSV) y Tomato spotted wilt virus (TSWV). Esta especie aparentemente no es susceptible al INSV, CMV y TMV entre los virus más conocidos (Brunt et al., 1996). Por tanto, se concluyó que el virus causante de la marchitez del miguelito era el TSWV considerando el conjunto de los síntomas observados en las plantas indicadoras inoculadas con los macerados de hojas de miguelito con síntomas de marchitez recolectadas en Morelos.

Se observaron síntomas de moteados cloróticos al inicio de la infección; después se transformaron en manchas cloróticas en forma de anillo en las hojas de miguelito producidas en el invernadero e inoculadas con macerados de hojas de N. rustica o D. stramonium. El virus se mantuvo aislado de plantas de miguelito con marchitez recolectadas en campo y que por las pruebas de inoculación en plantas diferenciales indicó la posible presencia del TSWV (Figura 3A). En estos anillos aparecieron después pequeñas y numerosas manchas necróticas que al coalecer causaron la necrosis del área afectada, que se distribuyó en toda la planta causando marchitez (Figura 3B). Las plantas afectadas no crecieron completamente, presentando enanismo (Figura 4A) y deformación de hojas, reducción del tamaño y pérdida del color de la flor (Figura 4B). Todas las plantas con estos síntomas murieron por marchitez idéntica a la observada en las plantas recolectadas en los invernaderos comerciales de Morelos.

TSWV causa típicamente manchas en forma de anillos concéntricos en la mayoría de sus hospedantes susceptibles, pero es común que también cause mosaicos, necrosis de tallos, pecíolos y flores, así como enanismo (Kurstak, 1981; Walkey, 1986; Index of Viruses, 2006). La similitud entre los síntomas causados por TSWV y los asociados con algunos hongos, bacterias u otros patógenos virales puede causar confusión y dificultar su identificación. Sin embargo, los análisis fitopatológicos realizados en nuestro laboratorio al material de miguelito con marchitez no reveló la presencia de hongos y bacterias, pero se separó consistentemente un solo virus de plantas de miguelito con síntomas de marchitez en las diferentes especies de plantas indicadoras, de donde se tomaron hojas frescas con síntomas y con sus macerados inocular plantas sanas de miguelito producidas desde semilla en el invernadero, que reprodujeron los mismos síntomas observados en campo. Así, de acuerdo con los postulados de Koch, aplicado a virus, se concluyó que el virus aislado de miguelito es el agente causal de la marchitez.

Detección serológica de proteína viral por ensayo inmunológico ligado a enzimas (DAS–ELISA)

Se detectó por ELISA únicamente al TSWV en las muestras de miguelito procedentes de Morelos, en las plantas indicadoras inoculadas con el virus aislado de miguelito y en las plantas de miguelito utilizadas en las pruebas de patogenicidad e incubadas en el invernadero. Las lecturas de absorbancia de los controles positivos variaron de 0.452 a 0.649 nm; en las muestras de campo y hospedantes indicadoras los valores de absorbancia tuvieron un valor de 1.392 nm y en las plantas de miguelito inoculadas con el TSWV en el invernadero el valor fue 1.485 nm. Los valores de la absorbancia fueron considerados positivos, específicos y de alta reactividad para el antisuero de TSWV usado en este trabajo y la reacción negativa para los antisueros de otros virus confirmó que el agente causal de la marchitez del miguelito es el TSWV.

Electroforesis de ARN de doble cadena de origen viral (ARN–dc)

El análisis electroforético en geles de agarosa al 1% de ARN–dc extraído de diferentes plantas, con síntomas de marchitez seca, producto de la inoculación con extractos de hojas de miguelito con síntomas de origen viral, mostró un perfil electroforético compuesto de cuatro bandas de ARN–dc, cuyo peso aproximado fue 8.897 kb (L–RNA); 5.4 kb (M–RNA); 2.916 kb (S–RNA) y 1.0 kb, probablemente un segmento subgenómico de este virus (Figura 5, carril A). En algunas muestras sólo se observaron dos bandas (L y S), posiblemente debido a la mayor concentración de ARN–dc de estos dos componentes (Figura 5, carril B). El patrón electroforético obtenido fue diferente al del CMV usado como comparación y en mezcla con el ARN–dc de TSWV (Figura 5, carril A). No se observaron patrones de ARN–dc viral en plantas de miguelito sanas, que indicó que éstas no estaban infectadas por virus. Se concluyó que el patrón electroforético ARN–dc viral obtenido de las distintas plantas utilizadas en este trabajo y con síntomas virales correspondía únicamente al TSWV.

La determinación del patrón electroforético de ARN–dc de origen viral, obtenidos en geles de poliacrilamida, es un método de diagnóstico fácil, barato, relativamente seguro, que junto con otras pruebas complementarias como las usadas en nuestro trabajo, permite identificar la mayoría de los virus de ARN de cadena sencilla; en su forma replicativa de doble cadena (ARN–dc) es única para cada virus, muy estable a la degradación enzimática y al calor. Esto permite usarlo para pruebas de diagnóstico moleculares como la RT–PCR o la clonación directa (Valverde et al., 1990).

Se obtuvo consistentemente un producto de la RT–PCR de 750 pb (Figura 6) cuando se usaron los oligonucleótidos sense/antisense (Pappu et al., 1996) y el ARN obtenido de plantas de miguelito enfermas y de las distintas plantas de hospedantes inoculadas con un aislamiento del TSWV identificado previamente por serología. Para obtener un buen producto de la RT–PCR fue necesario obtener el ARN viral de plantas de 15 a 25 d después de la inoculación con el virus y usándolo inmediatamente después de su extracción y purificación. Aunque se obtuvieron productos de la RT–PCR con ambos métodos de extracción y purificación de ARN viral, la mejor fuente para obtener un buen producto para la RT–PCR y usarlo para su secuenciación fue usando el reactivo incluido en el kit RNA Reagent (InvitroGen, USA).

La comparación de la secuencia de nucleótidos del fragmento del gen de la cápside amplificado por RT–PCR, de los aislamientos de TSWV obtenidas del miguelito (número de acceso EF067862) con la obtenida de N. rustica (número de acceso EF067863) mostraron una homología del 100%, mientras que la homología fue 93% al compararlo con las secuencias de TSWV disponibles en la base de datos del NCBI/GenBank. Esto es suficiente para confirmar que el virus causante de la marchitez del miguelito es el Tomato spotted wilt virus.

Tomato spotted wilt virus es la especie tipo dentro del género Tospovirus ubicada en la familia Bunyaviridae y es una de las principales amenazas a la producción de múltiples cultivos (Moyer, 1999; Fauquet et al., 2005; Index of Viruses, 2006). Este virus infecta a más de 650 especies de plantas, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas (German et al., 1992; Moyer, 1999) y es una seria amenaza para hortalizas como chile (Adkins, 2003), tomate (Zitter, 1991) y tomatillo (De La Torre et al., 1998) y para un gran número de especies ornamentales (Daughtrey et al., 1995; Pappu, 1997). Puede ser distribuido en plantas propagadas vegetativamente con infecciones asintomáticas y los tubérculos, cormos, rizomas y bulbos infectados son fuente excelente de inóculo de este virus (Daughtrey et al., 1995). Se ha destacado que numerosas especies de malezas asociadas a cultivos son hospedantes naturales de trips y la principal fuente de inóculo del TSWV (Hobbs et al., 1993; Groves et al., 2002).

Este virus es transmitido persistentemente de planta a planta sólo por adultos de al menos ocho especies de trips y sólo el estado larval puede adquir el virus. Después de su replicación en el insecto, los adultos y algunas ocasiones el segundo estadio larval puede transmitir el virus. Los adultos pueden ingerir el virus de plantas infectadas pero no llegan a ser virulíferos debido a las barreras de la garganta media que impiden el paso del virus a los tejidos internos del insecto (Ullman et al., 1992; Mason, et al., 2003; Assis et al., 2004). Los trips tienen un amplio intervalo de hospedantes, lo que facilita la distribución, permanencia y variación genética de TSWV o la ocurrencia en cultivos que no eran sus hospedantes originales (Ullman et al., 1992). TSWV se ha detectado en México en tomate, chile y otras especies de ornamentales causando marchitez y se ha demostrado que diversas variantes de este virus causan los mismos síntomas en las hospedantes indicadoras usadas en este trabajo (De La Torre et al., 1998; De La Torre et al., 2002).

Por la gran diversidad de síntomas que causa el TSWV en sus diferentes hospedantes, que pueden ser confundidos por los causados por hongos, bacterias y otros virus, en México el diagnóstico más frecuente para TSWV se hace principalmente por serología, usando antisueros comerciales. Sin embargo, TSWV tiene un amplio número de plantas hospedantes e interactúa con varias especies de su insecto vector donde se replica eficientemente, lo que favorece una alta tasa de variación genética (German et al., 1992; De Avila et al., 1993). Por tanto, es factible que de este virus se encuentre un alto número de variantes sin identificar en los cultivos que infecta, e incluso pueden estar presentes nuevas especies de Tosposvirus que se han identificado y diagnosticado en otras partes del mundo en cultivos importantes e incluso en su insecto vector, principalmente por métodos moleculares (Okuda et al., 2001; Mason et al., 2003); no sólo por serología, donde la clonación y secuenciación de los productos de la RT–PCR de los diferentes componentes genómicos son fundamentales (Jain et al., 1998; Chu et al., 2001).

CONCLUSIONES

Se identificó al virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) como el agente causal de la marchitez seca del miguelito (Z. elegans L.) que se cultiva en viveros comerciales en el Estado de Morelos, México, mediante pruebas de transmisión mecánica en plantas indicadoras y después en ensayos de patogenicidad inoculando por transmisión mecánica un aislamiento puro de este virus en plántulas sanas de miguelito, producidas desde semilla, en las que causó moteados, manchas en anillos concéntricos, enanismo y marchitez, síntomas idénticos a los observados en condiciones de campo.

Se detectó por serología (DAS–ELISA) únicamente al TSWV en muestras procedentes de viveros comerciales con síntomas de marchitez seca, en las plantas hospedantes indicadoras usadas para separar a este virus, así como en las plantas de miguelito usadas en los ensayos de patogenicidad. Se purificó el ARN–dc, la forma replicativa de los componentes genómicos de los virus de ARN de cadena sencilla, que permitió identificar el patrón electroforético específico del TSWV, que podría ser una herramienta complementaria para su diagnóstico.

Este informe es el primero de la presencia del TSWV en miguelito, planta ornamental de origen mexicano. Se describen dos métodos moleculares para el diagnóstico e identificación de este virus.

RECONOCIMIENTO

Esta investigación fue totalmente financiada por el Proyecto SAGARPA–CONACYT No 077. Se contó también con el apoyo logístico del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.

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