Análisis de la expresión transcripcional inducida bajo condiciones de estrés biótico y abiótico en Capsicum chinense BG–3821
Analysis of transcriptional expression induced in Capsicum chinense BG–3821 under conditions of biotic and abiotic stress
Alberto Barrera–Pacheco1, Ahuizolt de J. Joaquín–Ramos1, Irineo Torres–Pacheco3, Mario M. González–Chavira2 Ma. Cristina I. Pérez–Pérez1, Lorenzo Guevara–Olvera1 y Ramón G. Guevara–González3
1 Departamento de Ingeniería Bioquímica. Instituto Tecnológico de Celaya. Avenida Tecnológico y Antonio García–Cubas, s/n Colonia FOVISSSTE. 38010. Celaya, Guanajuato, México,
2 Centro. Campo experimental del Bajío. Unidad de Biotecnología,Carretera Celaya–San Miguel de Allende, Km. 6.5, Celaya, Guanajuato, México. Apartado Postal 112.
]]> 3 Facultad de Ingeniería. Universidad Autónoma de Querétaro. 76010. Querétaro, Querétaro, México, (gerardo@itc.mx).
Recibido: Noviembre. 2006.
Aprobado: Noviembre, 2007.
Resumen
El objetivo del presente trabajo fue analizar la expresión transcripcional inducida bajo diferentes tipos de estrés biótico y abiótico en plantas de chile habanero (Capsicum chinense BG–3821). Los estudios de expresión de genes de plantas bajo diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico son importantes porgue son una estrategia para entender, a nivel molecular, cómo las plantas actúan en fenómenos de resistencia a patógenos y condiciones abióticas de crecimiento, lo que puede ampliar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares de defensa a estos tipos de estrés en las plantas. Para el análisis transeripcional se emplearon sondas moleculares de los EST R50 y R100. Ambos son fragmentos diferenciales y posiblemente implicados en la respuesta de resistencia de C. chinense BG–3821 a infecciones por el virus huasteco vena amarilla del chile (PHYVV). Se comprobó la especificidad de la expresión de los genes correspondientes a R50 y R100 en plantas de C. chinense infectadas con PHYVV, así como por la bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria y el hongo Fusarium solani. Plantas infectadas con el oomiceto Phytophthora capsici no indujeron la expresión de estos genes. Asimismo, se evaluó si la expresión de estos genes es inducida mediante la aplicación de ácido salicílico (AS), metil Jasmonato, etileno o estrés abiótico (hídrieo y térmico) a plantas de C. chinense BG–3821, Adicionalmente, se realizó análisis de hibridación de ADN complementario (ADNc), para lo cual se seleccionaron varias clonas de bancos sustraetivos que contienen fragmentos de genes de C. chinense BG–3821 cuya expresión fue inducida en infecciones de PHYVV. Se demostró que la expresión de los genes correspondientes a los fragmentos R50 y R100 no son sólo inducidos específicamente por la infección de PHYVV, sino además por X. campestris pv. vesicatoria y F. solani, así como por la aplicación de ácido salicílico, metil jasmonato y etileno. En el análisis de arreglos se observaron diferencias en el nivel de expresión de varios EST para cada condición de estrés evaluada.
Palabras clave: Fusarium solani, Phytophthora capsici, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, chile, estrés, PHYVV.
Abstract
]]> The objective of the present work was to analyze the transeriptional expression induced under different types of biotic and abiotic stress in Havana chili pepper (Capsicum chinense BG–3821). The studies of expression of plant genes under different conditions of biotic and abiotic stress are important because they are a strategy for understanding at molecular level, how plants act in phenomena of resistance to pathogen and abiotic growth conditions, which may expand the knowledge about molecular defense mechanisms to this type of stress in plants. For transeriptional analysis, molecular probes of R50 and R100 EST's were employed. Both are differential fragments and possibly implied in the resistance response of C.chineme BG–3S21 to infections by the pepper Huasteco yellow vein virus (PHYVV). Specificity of gene expressions corresponding to R50 and RKH) was confirmed in C. chinense plants infected by PHYVV, as well as by the Xantkomonas campestris pv, vesicatoria bacterium, and Fusarium solani fungus. Plants infected with the Phytophthora capsici nomycete did not induce the expression of these genes. Likewise, it was assessed if the expression of these genes is induced to C. chinense BG–3821 plants by application of salicylic acid (AS), jazmonate methyl, ethylene, or abiotic stress (hydric and thermal). Additionally, analysis of complementary DNA hybridization (cDNA) was conducted, for which various clones from subtractive hanks were selected, containing C. chinense BG–3821 fragments, whose expression was induced in infections of PHYVV. It was demonstrated that the gene expressions corresponding to R50 and R100 fragments are not only induced specifically by PHYVV infection, but also by X. campestris pv. vesicatoria, and F.solani, as well as by application of salicylic acid, jasmonate methyl, and ethyleue. In the analysis of arrangements, differences in the expression level of several EST's were observed for each evaluated stress condition.Key words: Fusarium solani, Phytophthora capsici, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, chili pepper, stress, PHYVV.
INTRODUCCIÓN
El cultivo del chile sufre pérdidas de 20 a 100% debido a enfermedades de etiología viral, entre las que destacan las causadas por geminivirus (Torres–Pacheco et al., 1996; Godínez–Hernández et al., 2001). El virus huasteco vena amarilla del chile (PHYVV, antes PHV) es un geminivirus del género Begomovirus, tiene genoma bipartita, es transmitido por mosquita blanca, e infecta dicotiledóneas, incluyendo chile (Torres–Pacheco et al., 1996; Anaya–López et al., 2005). Dentro de los geminivirus más distribuidos en los cultivos de chile en México están el virus huasteco vena amarilla del chile (PHYVV) y el virus mosaico dorado del chile (PepGMV) (Anaya–López et al., 2003a,b). En México se ha identificado y caracterizado fuentes de resistencia a estos geminivirus en chile (Hernández–Verdugo et al., 2001; Anaya–López et al, 2OO3a,b; Anaya–López et al., 2005), Una colecta de chile habanero resistente a infecciones simples y mixtas por los geminivirus PHYVV y PepGMV es la denominada BG–3821 del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) perteneciente a la especie C. chinense Jacq. (Anaya–López et al., 2003a,b; Anaya–López et al., 2005). En la caracterización molecular de la resistencia se ha obtenido seis bibliotecas de fragmentos de genes expresados diferencialmente (EST) de estas plantas sometidas a infecciones por geminivirus (Anaya–López et al., 2005). Dentro de éstos están el R52 y el R100 que presentan similitud con genes que codifican para proteínas tipo germina (GLP) reportados en otros sistemas como involucrados en mecanismos de resistencia en plantas a patógenos e insectos herbívoros (Schweizer et al., 1999; Lou y Baldwin, 2006), Asimismo, se ha encontrado otros EST como el R50, el R57 y el R70, cuya función se desconoce. Se ha reportado que varios genes (entre ellos GLP) pueden ser inducidos en plantas en respuesta a varios tipos de estrés (Park et al., 2004). La expresión inducible a nivel transcripcional de algunos genes en plantas se ha relacionado fuertemente con el tipo de interacción que realiza con diversos microorganismos (compatible o incompatible) o condiciones abióticas (Park et al., 2004; Eichmann et al., 2005; Restrepo et al., 2006). Con base en lo anterior, se debe estudiar la especificidad de la expresión de los genes correspondientes a los EST identificados en la interacción C. chinense BG–3821–geminivirus, con el objetivo de dilucidar su posible participación en el mecanismo de respuesta de esta planta a diferentes tipos de estrés biótico (geminivirus y otros patógenos) y abiótico, así como la posible ruta de señalización que sigan estos genes en la planta. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue realizar análisis de la expresión a nivel transcripcional de genes de C. chinense BG–3821 inducida por diferentes tipos de estrés biótico (PHYVV, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Phytophthora capsici y Fusarium solani) y abiótico (térmico e hídrico), y mediante ta aplicación de ácido salicílico, metil jasmonato y etileno.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se usaron plantas de chile de la especie Capsicum chinense Jacq colecta BG–3821 proveniente del Banco de germoplastna del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Centro de Investigación de la Región Centro, Campo experimental Bajío, Unidad de Biotecnología, Celaya, México. Componentes A y B del Geminivirus PHYVV clonaitos en el plásmido Bluescript (SK+). La cepa de X. campestris pv, vesicatoria fue proporcionada por el Dr. Ángel Alpuche Solis del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICyT). Las cepas de F. sotani y P. capsici se tomaron del cepario del INIFAP, Unidad de Biotecnología.
Inducción de estrés biótico
]]> La metodología para las inoculaciones en chile de la bacteria X. campestris pv. vesicatoria y el oomiceto P. capsici, fue la reportada por Shin et al. (2002). La inoculación de F. solani se realizó colocando tres discos (1 cm diámetro) del medio PDA con micelio del hongo. Todas las plantas tenían cuatro hojas verdaderas al momento de la inoculación y se mantuvieron incubadas en invernadero durante marzo y abril de 2006, con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad, y una temperatura de 26 a 28 °C. De cada patógeno se verificó su presencia en las plantas inoculadas, mediante PCR con oligonucleótidos específicos para PHYVV (Anaya–López et al., 2005), reacción en la planta y recuperación en medio de cultivo para X. campestris pv, vesicatoria, y recuperación en medio de cultivo papa dextrosa agar (Difco) para F. solani. Adicionalmente, F, solani y P. capsici se detectaron mediante PCR usando oligonucleótidos específicos (Rico–Guerrero et al, 2004). Las extracciones de ADN se hicieron de acuerdo al protocolo de Dellaporta et al. (1983).Inducción de estrés abiótico
Estrés térmico
Se colocaron 20 plantas de chile en una incubadora (Biotronette, Lab Line Instruments, Melrose Park, II.) con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad a 41) °C, y otras 20 plantas se colocaron a 10 °C. Las plantas se mantuvieron en observación 48 h. A las 30 h se recolectó el tejido cortando las hojas apicales y básales, congelándolas inmediatamente en nitrógeno líquido, y se conservaron a — 80 °C hasta su utilización. Los experimentos se realizaron en tres ocasiones independientes.
Estrés hídrico
Se realizó según el procedimiento de Castillo et al. (2000). Para la condición de exceso de humedad, las plantas se incubaron en macetas y se colocaron en una charola con exceso de agua durante una semana a 28 °C en una incubadora (Biotronette, Lab Line Instruments, Melrose Park, II.) con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. Los experimentos se realizaron en tres ocasiones independientes.
Aplicación de elicitores abióticos (ácido salicílico, metil jasmonato y etefon)
Con la finalidad de aportar elementos para conocer la posible ruta de señalización en la que participan los genes correspondientes a los EST R50 y R10O, se hizo un análisis de su expresión transcripcional en respuesta a tratamientos con reguladores de crecimiento: ácido salicílico, metil jasmonato y etileno (etefon), que son moléculas que participan en la rutas de transducción de la señalización en respuestas de defensa en plantas (Park et al., 2004). La aplicación de ácido salicílico (SIGMA–ALDRICH, St. Louis, Mo, USA), metil jasmonato (SIGMA–ALDRICH, St. Louis, Mo, USA) y ETEFÓN (SIGMA–ALDRICH, St. Louis, Mo, USA) se hizo según Park et al. (2001).
Aislamiento del ARN
En todos los casos el ARN se obtuvo a las 72 h post–inoculación mediante el protocolo de RNEASY (QIAGEN, Hilden, Alemania), La integridad y tamaño del ARN se analizó por electro fore sis en geles de agarosa con formaldehído. La cuantificación y pureza se midió espectrofotométricamente mediante la relación de absorbancia (260/280 nm).
]]> Análisis tipo NorthernSe realizó según Anaya–López et al. (2005). Aun cuando las variables de este estudio son cualitativas, se hicieron tres réplicas independientes de los tratamientos.
Preparación y marcaje de sondas de ADNc e hibridación de membranas
Con la finalidad de explorar si algunos otros EST diferentes a R50 y R100, también son inducidos en plantas de C. chinense BG–3821 por algunos de los factores bióticos y abióticos evaluados en este trabajo, se hizo un estudio de hibridación de arreglos del ADNc de 66 EST de un banco obtenido por SSH en interacción incompatible entre C. chinense BG–3821 y PHYVV. Se hibridaron réplicas de la biblioteca de los genes de C. chinense BG–3821 por la infección del PHYVV obtenidas por SSH, mediante análisis tipo Southern (Sambrook et ai., 1989) con sondas obtenidas de ADNc problema o testigo, o bien con los fragmentos de los ESTs R50 (317 pb, número de accesión DQ864754) ó R100 (635 pb, número de accesión DQ677335), según el caso. Estas sondas se generaron incorporando dUTP–11–fluoresceína mediante un protocolo rutinario (Gene Images CDP–Star Random prime labeling module; Amersham Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ, USA). La detección de la sonda se hizo mediante el conjugado amifluoresceína–fosfatasa alcalina y el reactivo de detección CDP–Star (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA). Para construir los arreglos de clones se usó un dispositivo multicopiador conectado a una bomba de vacío (Hoefer PR 648, Amersham Biosciences, Buckinhamshire, UK).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Síntomas de plantas de C. chinense BG–3821 a los diferentes tipos de estrés
Se evaluó la expresión de síntomas en plantas de C. chinense BG–3821 inoculadas de forma independiente con el PHYVV, X. campestris pv. vesicatoria, F. solani y P, capsici. En la Figura 1 se muestra la presencia de! PHYVV detectada por PCR en las plantas inoculadas. Las plantas se mostraron asintomáticas a este virus como se esperaba, según lo reportado por Godínez–Hernández et al. (2001). En la Figura 2 se observa la necrosis causada por la inoculación de X. campestris pv. vesicatoria; las plantas mostraron una respuesta hipersensible en la zona de inoculación (tallo y hoja). La presencia de F. solani en las plantas se comprobó mediante reaislamiento del hongo en medio PDA y por PCR, un mes post–inoculacíón ya que las plantas de C. chinense BG–3821 no mostraron síntomas para F. solani al menos hasta el tiempo mencionado. Finalmente, P. capsici fue muy agresivo y en 3 d post–inoculación las plantas murieron, por lo que al segundo día post–inoculación se tomó la muestra respectiva.
Estos resultados sugieren que la recolecta BG–3821, además de ser resistente a PHYVV, también lo es a cepas de X. campestris pv. vesicatoria y F. solani usadas en este trabajo. Así, es posible suponer que algunos de los genes cuya expresión es aumentada por el PHYVV en las plantas de C. chinense BG–3821, pueden también serio por X. campestris pv. vesicatoria y F. solani, pero no por la cepa de P. capsici, como se ha sugerido para las respuestas de defensa de plantas a virus, bacterias, hongos y oomicetos (Lee et al., 2001; Park et al., 2004), Las plantas de C. chinense BG–3821 no soportaron el estrés térmico a 10 °C ya que a las 8 h las plantas estaban muy estresadas; por tanto, a las 24 h se hizo la recuperación del tejido. A 40 °C las plantas no presentaron alteraciones a simple vista, siempre y cuando tuvieran suficiente agua, el tejido se recolectó a las 24 h para su análisis. Para el estrés hídrico las plantas se mantuvieron a 28 °C y las sometidas a exceso de agua no presentaron estrés aparente; sin embargo, !as plantas sometidas a déficit de agua, presentaron señales de marchitez (flacidez de la planta) a los 10 d de incubación.
Análisis de la expresión de R50 y R100 en plantas de C. chinense BG–3821 sometidas a estrés
En la Figura 3 se muestran los resultados del análisis tipo northern realizado para la expresión de los genes correspondientes a los EST R50 y R100. Para R50 se observó la inducción específica por PHYVV y además una leve inducción por infecciones con F. solani (Figura 3, panel A, número 5). Para R100 se confirmó la inducción específica por el PHYVV, y además inducción por infecciones con X. campestris pv. vesicatoria (Figura 3, panel B, número 3), Tanto R50 (Figura 3, panel A) como R100 (no mostrado) no fueron inducidos por infecciones por P. capsici; además, ninguno de los genes para R50 y R100 fueron inducidos en las condiciones de estrés abiótico evaluadas (Figura 3).
Los resultados anteriores indican que al menos los genes correspondientes a los ESTs R50 y R100 no sólo son inducidos por PHYVV en las plantas de BG–3821, sino también por las cepas de F. solani y X. campestris pv, vesicatoria. Sólo agentes etiológicos, contra los cuales las plantas presentaron interacción incompatible, pudieron inducir alguno o ambos genes estudiados ya que la cepa de P. capsici usada contra la cual C. chinense BG–3821 fue susceptible, no indujo la expresión de ninguno de los genes evaluados. Estos resultados sugieren que algunas de las rutas de señalización de la interacción planta–patógeno respectiva son compartidas, como se ha demostrado en otras plantas de chile infectadas por virus, bacterias, oomicetos u hongos (Lee et al., 2001; Shin et al., 2002; Kim et al., 2006a,b). Además, las condiciones evaluadas de estrés abiótico (térmico e hídrico) en estas plantas, no indujeron la expresión transcripcional de estos genes.
Park et al. (2004) aislaron y caracterizaron un gen que codifica para una proteína tipo germina (GLP) a partir de plantas de C. annuum cv, Bugang resistente al patotipo P0 del virus mosaico del tabaco (TMV) y a una cepa de X. campestris pv, vesicatoria. Ellos encontraron que este gen era específicamente inducido en interacciones incompatibles pero no en compatibles, así como en respuesta al tratamiento con moléculas involucradas en rutas de señalización relacionadas con defensa en plantas (ácido salicílico, metil jasmonato y etileno). Este fue el primer reporte que involucra a una GLP en la respuesta de una planta a virus fitopatógenos. Dicha proteína fue la base para crear una nueva familia de proteínas relacionadas con patogenicidad (PR–16). La clona R100 estudiada en el presente trabajo presentó homología con una proteína tipo germina; además fue inducida por un geminivirus y también por X. campestris pv, vesicatoria. Por ello se puede sugerir que este gen debe ser considerado como un posible miembro de la familia PR–16.
En cuanto al R50 (Figura 3), aunque no se identificó en la base de datos homología con algún gen involucrado en mecanismos de resistencia en plantas, presentó un patrón de expresión donde se indujo por PHYVV y por F. solani. Por tanto, se debe considerar como un gen que posiblemente esté involucrado en algún mecanismo de resistencia de C. chinense BG–3821 contra estos patógenos. Respecto a la nula inducción de los genes R50 y R100 ante los tipos de estrés abiótico evaluados, posiblemente estos genes no son parte de una ruta de respuesta importante de la planta a estos tipos de estrés, a diferencia de lo sugerido para genes como piruvato cinasa 1 de C. annuum, que sí responde a estrés biótico por TMV y aplicaciones de reguladores de crecimiento como ácido salicílico, etileno y metil jasmonato (Kim et al., 2006a).
]]> Expresión de R50 y R100 como respuesta a tratamientos con reguladores de crecimientoEn la Figura 4 se muestran los resultados de la expresión transcripcional de los genes correspondientes a R50 y R100 con respecto al tiempo de aplicación de ácido salicílico en las plantas de C. chinense BG–3821. Los mismos experimentos se realizaron con aplicaciones de metil jasmonato y etefon, pero se presentó sólo una leve inducción de los dos EST a las 6 h y después desapareció la señal de inducción. Respecto a la inducción por ácido salicílico, se observó que aunque tenue, comenzó desde las 6 h post–aplicación en las plantas para ambos EST (Figura 4). Para R50 el nivel de expresión fue creciente desde 6 a 18 h, y se mantuvo en un nivel similar hasta las 48 h (Figura 4). Para RfOO el nivel de expresión presentó una tendencia creciente de 6 a 30 h y a las 48 h mostró una ligera disminución (Figura 4).
Estos resultados sugieren que la inducción de ambos genes es rápida y sostenida al tratamiento de las plantas con ácido salicílico, y por tanto, se espera que sean genes que participan en respuestas de defensa de C. chinense BG–3821 contra los patógenos estudiados por la ruta de señalización del ácido salicílico. Esto se sugiere con base en resultados de interacciones planta–patógeno de plantas de C. annuum con virus y bacterias (Lee et al., 2001; Park et al, 2001; Kim et al., 2006a,b). Estos resultados indican que al menos los genes correspondientes a los EST R50 y R100 deben estar participando en la respuesta de defensa de C. chinense BG–3821 a los patógenos estudiados, mediante la ruta de señalización por el ácido salicílico principalmente, pero también por las rutas mediadas por metil jasmonato o etileno. Las rutas de señalización para respuestas de defensa en plantas hacia algún estrés biótico 0 abiótico pueden o no ser compartidas por lo que los resultados mostrados en este trabajo son consistentes con otros reportes (Hong et al., 2005; Kim et al., 2006 a,b).
Análisis de hibridación de arreglos de cDNA
Se evaluó el perfil de expresión de 66 EST de C. chinense BG–3821 en respuesta a X. campesina pv. vesicatoria, F. solani y aplicación de ácido salicílico. Se usaron como testigo negativo plantas sin tratar (Figuras 5 y 6). Las clonas de R50 y R100 se incluyeron como testigos positivos, y en todos los casos se volvió a reflejar el patrón de expresión descrito en las secciones anteriores para estos genes en cada condición evaluada (Figura 6). Respecto a los niveles de expresión de los EST colocados en los arreglos, fue evidente que varios de ellos que no son R50 ó R100, respondieron con una inducción a diferentes niveles a los tratamientos por X. campestris pv. vesicatoria y a la aplicación del ácido salicílico en las plantas de C. chinense BG–3821 (Figuras 5 y 6), Para el caso de F. solani se observó un nivel inducción bajo (Figura 5)
Estos resultados se pueden explicar con base en el comportamiento que tuvieron las plantas a los diferentes tipos de estrés evaluados en esta sección, donde, para la inoculación con X. campestris pv. vesicatoria, presentaron una fuerte reacción de hipersensibilidad en el sitio de inoculación. En las inoculaciones con F, solani las plantas no presentaron sintomatología evidente, por lo que su respuesta se podría considerar ligera, manifestando un bajo nivel de inducción.
CONCLUSIONES
]]> Los EST R50 y R100 fueron inducidos en interacciones incompatibles entre C. chinense BG–3821 y PHYVV, X. campestris pv. vesicatoria o F. solani, mientras que no presentaron inducción en interacciones compatibles como la observada con P. capsici. Asimismo, estos EST respondieron con una inducción rápida al tratamiento con ácido salicílico, y en menor intensidad a metil jasmonato o etileno, sugiriendo que las rutas de señalización mediadas por estos compuestos son importantes en el sistema estudiado. Varios EST diferentes a R50 y R100, que también provienen de una colección de fragmemos de genes inducidos en C. chinense BG–3821 por infecciones con el PHYVV, mostraron patrones de inducción en respuesta a la inoculación con X. campestris pv. vesicatoria y la aplicación de ácido salicílico. El hecho de que varios de los EST evaluados en este trabajo (diferentes a R50 y R100) fueron inducidos en plantas de C. chinense en interacciones incompatibles por infecciones por el PHYVV, X. campestris pv. vesicatoria y F. solani, sugiere que estos genes pueden estar involucrados en la respuesta de defensa a estos patógenos, por lo que se deben caracterizar a mayor detalle posteriormente.Los resultados sugieren la presencia de una respuesta sistémíca adquirida en las plantas evaluadas, debido a que el ácido salicílico resultó un fuerte inductor de la expresión de estos genes en interacciones incompatibles, de la misma manera como se ha reportado en otros sistemas de interacción planta–patógeno. Sin embargo, no se puede descartar que algunos de los genes estudiados diferentes a R50 y R100 tengan participación por alguna otra ruta de señalización adicional.
Con este trabajo se presentan varios genes candidatos a estar involucrados en mecanismos de resistencia en plantas de C. chinense a varios patógenos. Así, es factible que al estudiar la regulación de la expresión estos genes se encuentren rutas de señalización comunes para la protección de estas plantas contra patógenos que pudieran ser útiles en el diseño futuro de estrategias de protección de estas platas (y quizá otras) a infecciones por virus, hongos y bacterias.
AGRADECIMIENTOS
El presentó trabajo se realizó con apoyo del Fondo mixto CONACYT–Gobierno del Estado de Guanajuato (FOMIX–GTO–2005–C02–52) y el apoyo a PRECI 99999 del INIFAP. Alberto Barrera–Pacheco y Ahuizolt de Jesús Joaquín Ramos, agradecen el apoyo de beca de maestría a CONACYT y CONCYTEG.
LITERATURA CITADA
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