Cytotoxicity in hela cells from extracts of three medicinal plants species from Hidalgo, Mexico
M.A. Villavicencio Nieto*, B.E. Pérez Escandón*, E. Mendoza Pérez* y V. Maldonado Lagunas**
* Laboratorio de Etnobotánica. Centro de Investigaciones Biológicas Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Correo electrónico: mavn3@hotmail.com.
** Instituto Nacional de Cancerología.
]]> Recibido: 20 febrero 2008.
Resumen
Se evaluó la citotoxicidad en cultivos de células HeLa de los extractos etanólicos de tres especies de plantas, Juniperus dep-peana, Solanum rostratum y Bidens odorata, que se utilizan tradicionalmente en dos regiones del estado de Hidalgo, México, para el tratamiento de heridas, úlceras, tumores y cáncer de matriz. La citotoxicidad más elevada la presentó el extracto de J. deppeana (CI50 = 4.63 µg/ml), el cual fue separado por cromatografía en placa de gel de sílice y la fracción principal (Rf = 0.28 ) mostró actividad citotóxica (CI50 = 0.79 µg/ ml). Aunque menor, el extracto de S. rostratum también presentó citotoxicidad (CI50 = 127.5 µg/ml). B. odorata fue inactiva.
Palabras clave: Juniperus deppeana, Solanum rostratum, Bidens odorata, plantas medicinales, Hidalgo, México, citotoxicidad, HeLa.
Abstract
Ethanolic extracts of three medicinal plants, Juniperus deppeana, Solanum rostratum and Bidens odorata, which are used in folk medicine in Hidalgo, Mexico, for the treatment of wounds, ulcers, tumors and cancer, were tested in a HeLa cell line to evaluate their cytotoxic activity. The highest cytotoxicity was found in the extract of J. deppeana (IC = 4.63 µg/ml); hence, this extract was separated via chromatography on a silica gel plate, from which the main fraction (Rf = 0.28) showed strong cyto-toxic activity (IC50 = 0.79 µg/ml). Whereas the extract of S. rostratum also exhibited cytotoxicity (IC50 = 127.5 µg/ml), that of B. odorata was inactive.
Key words: Juniperus deppeana, Solanum rostratum, Bidens odorata, medicinal plants, Hidalgo, Mexico, cytotoxicity, HeLa.
]]>INTRODUCCIÓN
En México (INEGI, 2006a) los tumores (neoplasias) son la tercera causa de mortalidad. En esta categoría, en el estado de Hidalgo los tumores malignos del cuello del útero son la primera causa de defunción femenina (INEGI, 2006b). En la medicina alopática los principales medios para tratar a personas con cáncer son la cirugía, las radiaciones y la quimioterapia (Stehman et al., 2003). En los diferentes sistemas de medicina tradicional del mundo, desde la antigüedad se usan plantas para tratar y prevenir distintos tipos de cáncer (U.S. Congress Office of Technology, 1990; Sumner, 2001). Desde 1950 se empezaron a evaluar las propiedades citotóxicas de los extractos de plantas, lo que ha dado como resultado el hallazgo de medicamentos como los alcaloides vinblastina y vincristina, obtenidos de Catharanthus roseus L. (Apocynaceae), que se usan para tratar leucemia infantil, así como el taxol, aislado de Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae), que es empleado para el cáncer de seno, cerebro y ovarios entre otras sustancias (Lee, 2004). Estudios más recientes, como el de Mans et al. (2000), reportaron los efectos citotóxicos que producen in vitro los extractos de aproximadamente 500 especies de la flora brasileña; Betancur-Galvis et al. (2002), encontraron que seis de diez especies de Euphorbia utilizadas en Colombia para tratar cáncer y tumores, presentaron citotoxicidad en HeLa y otras líneas celulares; Suffredini et al. (2007) probaron los extractos de 351 especies de la flora de Brasil en cultivos de células de cuatro tipos de tumores; en México se encontró que los extractos de hexano, acetato de etilo y metanol de Cuphea aequipetala Cav. (Lythraceae), una de las llamadas "hierbas del cáncer", mostraron citotoxicidad ligera en la línea de células de cáncer de cérvix y nula en la de carcinoma nasofaríngeo y la de colon (Waizel-Bucay et al., 2003), mientras que las fracciones de un extracto acetona-agua presentaron una dosis efectiva 50, ED50, de 0.418 y 2.40 µg/ml en la línea DU-145 de carcinoma de próstata (Ávila et al., 2004). En el estado de Hidalgo las plantas medicinales se utilizan para tratar una serie de padecimientos, entre los que se encuentra el cáncer (Pérez Escandón et al., 2003); al estudiar a cinco de estas especies de plantas se encontró que el extracto etanólico crudo de hojas de Cupressus lusitanica Klotzsch (Cupressaceae) resultó citotóxico en un panel de líneas celulares de cáncer y que la muerte celular es por apoptosis (López, 2001; López et al., 2002), el proceso activo de muerte celular dirigido por activación de genes, el cual se encuentra disminuido en distintos tipos de cáncer (Albert et al., 1998). En Omitlán se beben por separado las infusiones acuosas de las ramas de Juniperus deppeana Steud. (Cupressaceae) y de Bidens odorata Cav. (Asteraceae) para tratar el cáncer de matriz, y en Zempoala las infusiones acuosas de ramas de Solanum rostratum Dun. (Solanaceae) se utilizan en lavados vaginales para el tratamiento de este mismo padecimiento (Pérez Escandón et al., 2003). El presente estudio se planteó con el objetivo de evaluar la actividad citotóxica en cultivos de células HeLa de los extractos etanólicos y fracciones cromatográficas de estas tres especies de plantas.
MÉTODOS
COLECTAS
En Omitlán, Hidalgo, México, se llevó a cabo la colecta por triplicado de ejemplares de árboles masculinos y femeninos de J. deppeana, así como la colecta de B. odorata; mientras que en Zempoala, Hidalgo, México, en un área con matorral xerófilo, se obtuvieron ejemplares de S. rostratum. La identidad taxonómica de estas especies se confirmó por medio de claves (Rzedowski y Rzedowski, 2001). Los ejemplares están depositados en el herbario del Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo.
PREPARACIÓN DE EXTRACTOS
Las muestras vegetales colectadas se secaron a temperatura ambiente y las ramas, con tallos y hojas, se trituraron en un molino eléctrico. Con este material se prepararon las siguientes muestras: J. deppeana, 50 gr; S. rostratum, 45 gr; B. odorata 45 gr; las cuales fueron extraídas en Soxhlet durante ocho horas utilizando 200 ml de etanol absoluto. Se obtuvieron los extractos etanólicos con las siguientes concentraciones: J. deppeana 0.0185 g/ml; S. rostratum 0.0150 g/ml; B. odorata 0.0010 g/ml.
OBTENCIÓN DE FRACCIONES
]]> El extracto etanólico de J. deppeana se fraccionó mediante cromatografía en placa preparativa de gel de sílice G F254 de 20 x 20 x 0.25 cm, eluyendo con etanol. Al revelar el cromatograma con la luz de una lámpara UV se observaron tres bandas o fracciones. La fracción 3, con Rf = 0.28, fue la mayoritaria, la cual se raspó por separado y se extrajo con etanol, después se redujo el volumen por evaporación del disolvente.CITOTOXICIDAD
Para probar la citotoxicidad de los extractos etanólicos de estas plantas, así como de la fracción obtenida de J. deppeana, se siguió el método empleado por López et al. (2002) en el que se utilizó un cultivo de la línea celular de cáncer cérvico uterino HeLa mantenido en medio DMEM (Dulbecco's Modified Tagle Médium) suplementado con 10% de suero fetal bovino, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37°C. En las pruebas se utilizaron placas de 96 pozos, en donde se sembraron 5000 células HeLa por pozo, en 100 µl de medio, éstas se trataron con los extractos etanólicos de las plantas en diferentes concentraciones (0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µl extracto/100 µl de medio); la fracción de J. deppeana se ensayó en concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6 µl fracción/100 µl de medio. A las células testigo, no tratadas con extractos o fracciones, se les añadieron las mismas cantidades de etanol que a las células tratadas. Los cultivos fueron incubados en las condiciones mencionadas y a diferentes tiempos, 12, 24 y 48 hrs, se determinó la citotoxicidad mediante la estimación de la viabilidad celular utilizando la técnica de cristal violeta, para lo cual se fijaron las células con etanol al 70% durante cinco minutos, luego a cada pozo se añadió cristal violeta al 1% disuelto en agua, diez minutos después se agregó ácido acético al 33%, la lectura de la absorbancia a 570 nm (DO570) se hizo directamente de los pozos colocando las placas en un lector de ELISA. Las pruebas se realizaron con seis a siete concentraciones por triplicado con tres repeticiones.
Con los datos obtenidos al medir la DO570 se calculó el porcentaje de viabilidad como 100B/A donde A y B fueron los valores promedio de DO570 de las células no tratadas y tratadas, respectivamente. Con los valores porcentuales de viabilidad celular y los de las concentraciones probadas se elaboraron gráficas concentración-efecto, sobre las curvas obtenidas se estimó la concentración inhibitoria 50% (CI50), que se definió como la concentración de los extractos y fracciones que redujo la viabilidad de las células tratadas al 50% respecto a las células no tratadas.
Asimismo, para detectar cambios citológicos, los cultivos se observaron en un microscopio invertido Zeiss y se fotografiaron usando una película Kodak Plus X-Pan.
RESULTADOS
EFECTOS CITOTÓXICOS
Se encontró que los extractos etanólicos de J. deppeana y de S. rostratum redujeron la viabilidad de las células HeLa, lo que significa que produjeron citotoxicidad. Respecto de J. deppeana, como se muestra en la figura 1, la pérdida de viabilidad se presentó a partir de 0.05 µl; extracto/100 µl de medio en los tres tiempos medidos, 12, 24 y 48 hrs. El tratamiento de 12 hrs produjo el menor decremento de la viabilidad y el efecto máximo se alcanzó en la concentración del extracto de 2 µl/100 µl de medio, mientras que a 24 y 48 hrs el decremento fue mayor. En el tratamiento de 24 hrs la reducción máxima de la viabilidad llegó a 25%, este efecto se alcanzó al aplicar 0.1 µl del extracto y luego se mantuvo estable; a 48 hrs la viabilidad se redujo hasta el 10% con 0.4 µl del extracto y en adelante se estabilizó. La pérdida de viabilidad celular dependió tanto de la concentración del extracto como del tiempo de exposición.
]]>
El extracto etanólico de S. rostratum también causó pérdida de viabilidad de las células HeLa, que dependió de la concentración y del tiempo de exposición (Fig. 2). La pérdida fue gradual y los máximos alcanzados con 2 µl del extracto fueron de 80, 39 y 40% a 12, 24 y 48 hrs, respectivamente, y el extracto de B. odorata no redujo la viabilidad de las células HeLa.
A partir de las curvas concentración-efecto obtenidas (Figs. 1 y 2) se calcularon las CI50. Los resultados se presentan en la tabla 1, donde se observa que el extracto de J. deppeana presentó los valores de CI50 más bajos, a 24 y 48 hrs fueron de 4.625 µg/ml, es decir, que éste fue el más citotóxico de los tres extractos ensayados; a 48 hrs la CI50 del extracto de S. rostratum fue de 127.5 µg/ml.
Puesto que el extracto de J. deppeana fue el que produjo la mayor citotoxicidad, se decidió fraccionarlo para rastrear la actividad. Se obtuvieron tres fracciones, siendo la 3 la mayoritaria (Rf = 0.28), por lo que se optó por ensayarla en cultivos de células HeLa para comprobar si ésta era la que produjo el efecto citotóxico.
Se encontró que la fracción 3 (Rf = 0.28) de J. deppeana produjo una reducción de la viabilidad celular. Como se observa en la figura 3, esta reducción fue dependiente de la concentración y del tiempo de exposición. En el tratamiento de 24 hrs se observó un decremento continuo de la viabilidad hasta llegar a 48% con 0.6 µl fracción/100 µl medio, la concentración más alta ensayada. En el tratamiento de 48 hrs la viabilidad se redujo hasta 20% con 0.3 liI fracción/100 liI medio, desde donde se mantuvo estable. Las CI50 de la fracción se presentan en la tabla 1, donde se observa que los valores son de los mismos órdenes de magnitud que los del extracto completo a 24 y 48 hrs, por lo que se supuso que el compuesto contenido en la fracción 3 le confiere las propiedades citotóxicas a J. deppeana.
]]>
En la figura 4 se presentan las imágenes obtenidas al microscopio de los cultivos de las células HeLa testigo expuestas al vehículo (etanol) (A) y al exponer el cultivo a la fracción 3 de J. deppeana durante 24 hrs a una concentración de 0.3 (B) y de 0.6 li! fracción/100 li! medio (C), en ambas imágenes se observan células con forma redonda y en la última algunas con núcleos fragmentados y protuberancias celulares.
DISCUSIÓN
Las tres especies de plantas estudiadas se seleccionaron considerando su uso tradicional en varias regiones del estado de Hidalgo, las cuales se emplean para el tratamiento de cáncer de matriz (Pérez Escandón et al. , 2003). En el estudio se demostró que los extractos de dos de estas especies, J. deppeana y S. rostratum, causaron efectos citotóxicos en cultivos de células HeLa de cáncer cérvico uterino con lo cual se contribuye a corroborar las propiedades medicinales que tradicionalmente se atribuyen a estas plantas.
Éste es el primer reporte acerca del efecto citotóxico de J. deppeana. Al comparar la CI50 obtenida a 48 hrs con el extracto de esta planta en células HeLa con el valor reportado en otras especies, se observó que la cifra (4.625 Mg/ml) fue unas quince veces menor que la encontrada por Betancur-Galviz et al. (2002) con el extracto de Euphorbia arenaria (74.6 Mg/ml) y de unas 40 a 400 veces menor que las CI50 producidas con los extractos metanólicos (200 µg/ml) y acuosos (2000 Mg/ml) de Matricaria chamomilla (Srivastava and Gupta, 2007).
Otras especies de Juniperus ya se utilizaban en Roma en el siglo I dC. para detener el crecimiento de tumores (Koulman et al., 2004). En la actualidad ya se ha comprobado la citotoxicidad de extractos y sustancias de J. bermudiana (Cole et al., 1977), J. phoenicea (Carines et al. , 1980), J. sabina (San Feliciano et al., 1990), J. przewalskii (Wang et al., 2002) y J. communis (Bayazit, 2004) en distintas líneas celulares de tumores humanos.
Las células HeLa tratadas con la fracción 3 de J. deppeana adquirieron una morfología redonda (Figs. 4B, C) que es típica de células arrestadas en la fase G2/M del ciclo celular (Albert et al. 1998). A una concentración de 0.6 µl fracción/100 µl medio durante 24 hrs algunas células mostraron núcleos fragmentados y protuberancias celulares (Fig. 4C) que son características de células apoptóticas (Albert et al., 1998, López, 2001, López et al., 2002), lo que sugiere que la citotoxicidad producida por la fracción 3 de J. deppeana, y probablemente del extracto de esta planta, es por apoptosis. Sin embargo, para comprobar este efecto sería necesario realizar otro tipo de pruebas, como la tinción de núcleos con bromuro de etidio para observar si se condensan y fragmentan, así como la técnica de TUNEL para detectar fragmentación de ADN, características que se presentan en el proceso apoptótico (Albert et al. 1998).
]]> También es el primer reporte de la citotoxicidad de S. rostratum; en el género Solanum se han reportado especies como S. crinitum y S. jabrense, cuyos alcaloides fueron citotóxicos en diferentes cultivos de células tumorales (Esteves-Souza et al. 2002).En este estudio el extracto de B. odorata fue inactivo; sin embargo, en otra especie del género, Sundararajan et al. (2006) encontraron que la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de Bidens pilosa produjo una reducción de la viabilidad de las células HeLa al 50% (CC50 de 965.2 µg/ml) en 24 hrs.
Con el efecto citotóxico mostrado en células HeLa, J. deppeana y S. rostratum acrecientan la lista mundial de plantas con potencial para casos de neoplasia de cuello uterino publicada por Moura et al. (2002), los resultados obtenidos en el estudio contribuyen a corroborar las propiedades que tradicionalmente se atribuyen a estas plantas y destacan a estas dos especies de la flora medicinal mexicana como fuente de sustancias para el tratamiento del cáncer.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio se realizó con apoyo del Programa Institucional de Investigación de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Proyecto UAE-DIP-ICBI-AA06.
LITERATURA CITADA
Albert, B.; D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter, 1998. Essential cell biology. Garland Publishing, Inc. New York. 710 pp. [ Links ]
]]>Ávila, E.V.; R.T. Aguilar, M.J. Estrada, M.L. Ortega y R.R. Ramos, 2004. "Cytotoxic activity of Cuphea aequipetald". Proc. West. Pharmacol. Soc., 47: 129-33. [ Links ]
Bayazit, V, 2004. Cytotoxic effects of some animal and vegetable extracts and some chemicals on liver and colon carcinoma and myosarcoma. Saudi Med. J., 25(2): 156-163. [ Links ]
Betancur-Galvis, L.A.; G.E. Morales, J.E. Forero & J. Roldan, 2002. "Cytotoxic and antiviral activities of Colombian medicinal plant extracts of Euphorbia genus". Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, 97(4): 541-546. [ Links ]
Carines, D.A., O. Ekundayo & G.I. Kingston, 1980. "Lignans from Juniperus phoenicea". J. Nat. Prod., 43: 495-497. [ Links ]
Cole, J.R., B. Tammami & J. Torrance, 1977. "Antitumor agent from Juniperus bermudiand". Phytochem., 1100-1103. [ Links ]
]]>Esteves-Souza, A., T.M. Sarniento da Silva, C.C. Fernandes Alves, M.G. de Carvalho, R. Braz-Filho & A. Echevarria, 2002. "Cytotoxic activities against Ehrlich carcinoma and human K562 leukaemia of alkaloids and flavonoids from two Solanum species". J. Brazilian Chem. Soc., 13(6): 838-842. [ Links ]
INEGI, 2006a. Anuario estadístico de los Estados Unidos Mexicanos. Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática. Aguascalientes. 727 pp. [ Links ]
----------, 2006b. Anuario estadístico. Hidalgo, Tomo I. Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática. Aguascalientes. 739 pp. [ Links ]
Koulman, A.; W.J. Quax & N. Pras, 2004. "Podophyllotoxin and related lignans produced by plants". In: Ramawat, K.G. (Ed.). Biotechnology of medicinal plants. Science Publishers Inc. Enfield. pp. 9-35. [ Links ]
Lee, K.H., 2004. "Current development in the discovery and design of new drug candidates from plant natural product leads". J. Nat. Prod., 67: 273-283. [ Links ]
]]>López, L., 2001. Inducción de apoptosis en células HeLa por extractos de Cupressus lindleyi Klotzsch. Tesis de maestría. Facultad de Ciencias, UNAM. 35 pp. [ Links ]
López, L.; M.A. Villavicencio, A. Albores, M. Martínez, J. de la Garza, J.Meléndez-Zajgla & V. Maldonado, 2002. "Cupressus lusitanica (Cupressaceae) leaf extract induces apoptosis in cancer cells". J. Ethnopharmacol., 80: 115-120. [ Links ]
Mans, D.R.A.; A.B. de Rocha & G. Schwartsmann, 2000. "Anti-cancer drug discovery and development in Brazil: targeted plant collection as rational strategy to acquire candidate anti-cancer compounds". The Oncologist, 5: 185-198. [ Links ]
Moura, M.D.; J.S. Silva, R.A.G. Oliveira, M.F.F.M. Diniz & J.M. Barbosa-Filho, 2002. "Natural products reported as potential inhibitors of uterine cervical neoplasia". Acta Farm. Bonaerense, 21(1): 67-74. [ Links ]
Pérez Escandón, B.E.; A. Ramírez y M.A.Villavicencio Nieto, 2003. Lista de las plantas útiles de Hidalgo. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Pachuca. 147 pp. [ Links ]
]]>Rzedowski, G.C. y J. Rzedowski, 2001. Flora fanerogámica del Valle de México. Instituto de Ecología A.C., Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad. Pátzcuaro. 1406 pp. [ Links ]
San Feliciano, A.; J.M. Miguel del Corral, M. Gordaliza & A. Castro, 1990. "Lignans from Juniperus sabina". Phytochem., 29: 1135-1138. [ Links ]
Srivastava, J.K. & S. Gupta, 2007. "Anti-proliferative and apoptotic effects of chamomile extract in various human cancer cells". J. Agric. Food Chem., 55(23): 9470-9478. [ Links ]
Stehman, F.B.; P. Rose, B. Greer, M. Roy, M. Plante, M. Penalver, A. Jhingran, P. Eifel, F. Montz & J.T. Wharton, 2003. "Innovations in the treatment of invasive cervical cancer". Cancer, 98(9): 2052-2065. [ Links ]
Suffredini, I.V.; M.L.B. Paciencia, A.D. Varella y R.N. Younes, 2007. "In vitro cytotoxic activity of Brazilian plant extracts against human lung, colon and CNS solid cancers and leukemia". Fitoterapia, 78: 223-226. [ Links ]
]]>Sumner, J., 2001. The natural history of medicinal plants. Timber Press. Portland. 235 pp. [ Links ]
Sundararajan, P.; A. Dey, A. Smith, A.G. Doss, M. Rajappan & S. Natarajan. 2006. "Studies of anticancer and antipyretic activity of Bidens pilosa whole plant". African Health Sci., 6(1): 27-30. [ Links ]
U.S. Congress Office of Techology Assessment, 1990. Unconventional cancer treatments. U.S. Government Printing Office. Washington. 300 pp. [ Links ]
Waizel-Bucay, J.; G. Martínez-Porcayo, M.L. Villarreal-Ortega, D. Alonso-Cortés y A. Pliego-Castañeda, 2003. "Estudio preliminar etnobotánico, fitoquímico, de la actividad citotóxica y antimicrobiana de Cuphea aequipetala Cav. (Lythraceae)". Polibotánica, 15: 99-108. [ Links ]
Wang, W.S.; E.W. Li & Z.J. Jia, 2002. "Terpenes from Juniperus przewalskii and antitumor activities". Pharmazie, 57(5): 343-345. [ Links ]
]]>