Determinación, por PCR, de Salmonella Enteritidis FT 13 A y Salmonella Issatschenko en muestras de pollitos infectados experimentalmente

Determination of Salmonella Enteritidis FT 13 A and Salmonella Issatschenko by PCR in samples of chicks experimentally infected

Israel Monroy Becerra* Néstor Ledesma Martínez* Félix Domingo Sánchez Godoy* Griselda Ruiz Flores** Odette Urquiza Bravo*

*Departamento de Producción Animal: Aves. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

Responsable de correspondencia:
Israel Monroy Becerra,
teléfono: 5622 5868,
correo electrónico:dragonred003@hotmail.com

Recibido el 19 de julio de 2012
aceptado el 20 de noviembre de 2012.

Abstract

The objective of this work was to determine by PCR the presence of Salmonella Enteritidis FT-13A (SE) and Salmonella Issatschenko (SI) in different samples of organs from 4 days old chicks experimentally infected. Four days old chicks were inoculated with SE and SI and their organs were frozen for DNAextraction to perform classic and nested PCR. It was possible to demonstrate the presence of SE and SI after 6 hours after experimental infection (AEI), but as time passed AEI positive results were inconsistent, obtaining negative results until 174 hours AEI. PCR is useful for detecting SE and SI in the early hours AEI. It is recommended to use pre-enrichment of the samples, in order to facilitate the DNA extraction and the detection of Salmonella by PCR.

Key words: Classic PCR, nested PCR, salmonella enteritidis, salmonella Issatschenko, chicks.

Resumen

El objetivo del presente trabajo fue determinar por medio de esta prueba, la presencia de Salmonella Enteritidis FT-13A (SE) y de Salmonella Issatschenko (SI), en diferentes muestras de órganos de pollitos de 4 días de edad infectados experimentalmente. Se emplearon órganos congelados de pollitos de 4 días de edad inoculados experimentalmente con SE y SI, para extraer el ADN y realizar la PCR clásica y anidada. Se logró detectar SE y SI desde las 6 horas posinfección experimental (PIE), pero conforme pasó el tiempo PIE, los resultados positivos fueron inconsistentes, obteniendo resultados negativos hasta las 174 horas PIE. Se concluyó que la PCR es útil para detectar SE y SI en las primeras horas PIE. Se sugiere utilizar pre-enriquecimiento de las muestras, para facilitar la extracción de ADN y la detección de Salmonella por medio de la PCR.

Palabras clave: PCR clásica, PCR anidada, salmonella enteritidis, salmonella Issatschenko, pollitos.

Introducción

El género Salmonella consta de sólo dos especies: Salmonella bongori y Salmonella enterica, esta última está dividida en seis subespecies: S. enterica, subesp. enterica, S. enterica, subesp. salamae, S. enterica, subesp. arizonae, S. enterica, subesp. diarizonae, S. enterica, subesp. houtenae y S. enterica, subesp. indica^2-4 Bourdenche et al.,² mencionan la existencia de 2541 serovariedades para el esquema de Kauffmann-White; sin embargo, como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres se escriben con letras romanas (no itálicas) y con mayúscula como en Salmonella Enteritidis, que corresponde a: "Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad Enteritidis", por lo que para fines prácticos se usa directamente Salmonella Enteritidis (SE).^2-4

Recientemente, en la avicultura se ha registrado un incremento de casos por Salmonella Typhimurium (ST) y por SE. Se ha sugerido que algunas plagas como los roedores son portadores de ambas serovariedades.^3,4

La salmonelosis en ratas puede ser un serio problema porque actúan como reservorio y vectores al tener convivencia estrecha con las aves de corral. A pesar del gran número de estudios que se realizan para la detección de Salmonella, incluyendo SE, existe poca información sobre Salmonella Issatschenko (SI), la cual se ha demostrado que afecta a la familia Muridae y a pollos de engorda;^4,5 sin embargo, estos estudios no han incluido la PCR.³

En la literatura, Salmonella enterica subespecie enterica biovar Issatschenko (SI), se ha conocido también con diversos nombres, como S. Danysz, S. Gaerther, S. Liverpool, S. Ratin, S. Projorov y S. Enterica serovariedad 17 F4, subgrupo I, grupo D, que mata a muridos. Esta Salmonella tiene los mismos antígenos somáticos y flagelares que S. Enteritidis según la clasificación de Kauffmann y White (grupo D, subgrupo I, O: 1, 9,12 y H: g, m) y esta última serovariedad afecta a todas las especies, incluyendo al humano.³

Cabe mencionar que los productos avícolas han sido implicados como fuente de infecciones por las serovariedades de SE hacia especies animales, incluyendo al ser humano.⁵ Por otro lado, experimentalmente se ha demostrado que, cuando no se procede a un control adecuado de plagas, existen numerosas fuentes de infección de Salmonella en las unidades de producción de pollo comercial, como las aves silvestres, los artrópodos y los roedores, que contaminan el agua, el alimento, el material de cama y el equipo a través de sus heces, favoreciendo la permanencia de Salmonella en la naturaleza.^6,7

Respecto al diagnóstico, a la fecha se han desarrollado métodos más rápidos y sensibles en distintos tipos de muestras, como aglutinación en placa (AP),^8-10 prueba de microaglutinación (MA),¹⁰ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA),^11-13 pruebas de anticuerpos fluorescentes (AF),^8,11-13 prueba de inmunofluorescencia (IF),^11,12 y prueba de microantiglobulina,¹⁰ las cuales son capaces de detectar anticuerpos contra Salmonella. Con el aislamiento bacteriológico es posible identificar Salmonella mediante pruebas bioquímicas y de serotipificación. El actual procedimiento de laboratorio estándar para cultivar e identificar las serovariedades de Salmonella es laborioso y puede tardar hasta 7 días;^8,9,14 no obstante, al observar ciertas lesiones histológicas es probable sugerir que dichas lesiones son por Salmonella;¹⁵ la hibridación de ADN^16,17 y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) tardan aproximadamente de 24 a 48 horas, dependiendo del número de muestras que se trabajen.^18,19

La PCR clásica se ha aplicado para identificar varias especies microbiológicas sin previo aislamiento, incluyendo a Salmonella, a partir de muestras clínicas y de alimento.^18,19

La PCR es un método de copiado de ADN que puede emplearse por ser altamente sensible y específico en la detección de microorganismos en un amplio rango de muestras.^18,20

Con base en las pruebas de la PCR de trabajos anteriores sobre la detección de la concentración mínima detectable de Salmonella SPP, se ha mencionado que existen factores que producen resultados falsos positivos o negativos debido a la alta concentración de ADN bacteriano y celular provenientes de las muestras biológicas, y por la presencia de factores inhibitorios provenientes de las mismas muestras, como puede ser la hemoglobina, lactoferrina, polisacáridos, grasas, proteínas, la congelación, entre otros.^21-25

Alva²⁶ mencionó que la sensibilidad de la PCR anidada para detectar SE es desde 10 unidades formadoras de colonia (UFC), considerando que esta prueba es útil para el diagnóstico de Salmonella SPP en muestras provenientes de aves y muestras negativas al aislamiento bacteriano. Para la realización de la PCR para Salmonella se han empleado iniciadores que amplifican un fragmento de 485 a 525 pb del gen inv A.^26-30

Debido a la importancia del género Salmonella en el mundo, es necesario encontrar técnicas de diagnóstico prácticas y rápidas que permitan la detección de Salmonella a partir de diferentes muestras, por lo que el objetivo de este trabajo fue determinar, por medio de la PCR, la presencia de Salmonella Enteritidis FT-13A y Salmonella Issatschenko en diferentes muestras de órganos de pollitos de 4 días de edad infectados experimentalmente, así como su relación con el resultado del aislamiento bacteriológico y las lesiones histológicas descritas en un trabajo previo.³

Material y métodos Muestras

Como parte del estudio de Ruiz, et al.,³ se utilizaron muestras de buche (B), corazón (C), pulmón (P), hígado (H), bazo (B), duodeno (D), yeyuno (Y), íleon (I) y ciegos (Ci) en 6 tiempos: a las 6, 18, 30, 42, 102, 174 horas posinoculación experimental (PIE) vía oral de pollitos (Ross) de 4 días de edad infectados con Salmonella Enteritidis FT 13 y con Salmonella Issatschenko, para obtener un total de 42 muestras de SE y SI que fueron almacenadas a -20°C hasta su empleo.

Las muestras testigo positivas fueron de los mismos órganos de pollitos SPF (aves libres de patógenos específicos) infectados experimentalmente con SE [1 x 10⁸] y SI [1 x 10⁹] / ml por vía oral. Los testigos negativos se obtuvieron a partir de órganos de pollitos de 4 días de edad con una inoculación de 250 ul de solución salina fisiológica (SSF) por vía oral en pollitos SPF.

Diseño de investigación

Cada muestra por separado fue procesada de la siguiente manera:

Se maceró 0.1 gramo de cada muestra anteriormente mencionada. Cada muestra fue homogeneizada mediante el uso de un agitador tipo vortex en 1 ml de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) estéril (0.324% de KH₂PO₄,* 1.08% de Na₂HPO₄* y 16.1% de NaCl*), posteriormente se agregan 4 μl de lisozima** [20 mg/ml] para tener un volumen final de 1004 μl (80 μg), se incubó a 4°C durante 45 minutos; se dejó sedimentar la muestra 5 minutos y se tomaron 250 μl de la mezcla inicial para depositarla en otro tubo al cual se adicionaron 12.5 μl de proteinasa K*** [20 mg/ml] y 250 μl de solución STEP (10 % de SDS,† TRIS**** [1M] pH8, EDTA***** [0.5M] pH 8), se incubó por 2 horas a 37°C; del volumen resultante (512.5 μl) se realizó la purificación de ADN con fenol-cloroformo isoamílico (FCI) (Fenol,****** Cloroformo, † Alcohol Isoamílico******) y se precipitó con etanol. Posteriormente, la muestra se centrifugó a 10 205 x g durante 15 minutos a 4°C y se secó la pastilla de ADN a temperatura ambiente durante dos horas. Finalmente, el ADN fue resuspendido en agua bidestilada y se incubó entre 55 y 60°C‡ durante 10 minutos.

PCR clásica

Se tomaron 5 μl de ADN del proceso anterior y se pasaron a un tubo de PCR con 2 μl de solución amortiguadora‡ para PCR [1X], 0.4 μl de desoxinucleótidos trifosfatados^• (dNTP's) [0.2 mM], 2 μl de iniciadores ^••[1 mM], 1.2 μl de MgCl^• [1.5 mM], 0.5 μl de Taq polimerasa^• [2.5 unidades] y 8.9 μl de agua bidestilada.³⁰

En la PCR se utilizaron los siguientes iniciadores: inv1F: 5'-CGT CAT TCC ATT ACC TAC CT-3' e inv1R: 5'- CAA TAG CGT CAC CTT TGA TA-3', que amplificaron un segmento del gen invA de 525 pb,^26,30con el siguiente protocolo: un ciclo de 95°C durante 5 minutos, 30 ciclos de 93°C durante 45 segundos, 59°C 45 segundos, 72°C 45 segundos, seguida de una extensión final a 72°C por 4 minutos.♦³⁰

PCR anidada

Se tomaron 5 μl de la PCR anterior y se suspendieron con 2 μl de solución amortiguadora para la PCR^• [1X], 0.4 μl de dNTP's [0.2 mM] 1 μl de iniciadores♦♦ [0.5 mM] 1.2 μl de MgCl^• [1.5 mM] , 1 μl de Triton♦♦ [0.10%], 0.3 μl de BSA‡ [0.15 mg/ml Albúmina Sérica Bovina], 0.5 μl de Tap polimerasa• [2.5 unidades] y 8.6 μl de agua bidestilada. Para este proceso se utilizaron los siguientes iniciadores: inv2F: 5'-TGG TGTTTA TGG GGT CGT TCT A 3' e inv2R: 5'-CCT TCA AAT CGG CAT CAA TAC TC-3', que amplificó un segmento del gen invA de 329 pb.^26,30

Después de la realización de la PCR clásica y anidada, a las muestras de 3 μl se les agregó 1 μl de Azul de Bromofenol******* y se depositó cada una por separado en geles de agarosa al 2%; se colocó en cada gel un marcador de tamaño molecular******** de 622 pb (pares de bases) para llevar a cabo la electroforesis********* durante 30 min a 80 voltios. Posteriormente, los geles se tiñeron con Bromuro de etidiof y se visualizaron mediante luz ultravioleta.‡

Análisis estadístico

Se elaboraron tablas de contingencia 2 x 2, para SEF-T13A y SI, para calcular sensibilidad y especificidad de la PCR de este trabajo con respecto de la bacteriología⁴ y para histopatología⁴ con respecto de la bacteriología.⁴ Para determinar la relación entre las pruebas se usó el método de Ji².³¹

Resultados

Salmonella Enteritidis FT 13 A

PCR clásica

La prueba de la PCR utilizando los iniciadores inv1F e inv1R que amplifican un fragmento de 525 pb del gen invA, resultó negativa para Salmonella Enteritidis FT 13 A en todos los órganos y tiempos de muestreo.

PCR anidada

Se encontraron resultados positivos con los iniciadores inv2F e inv2R que amplifican un fragmento de 329 pb del gen invA desde las 6 horas PIE hasta las 174 horas PIE en las diferentes muestras (Cuadro 1 y Figura 1).

Salmonella Issatschenko

PCR clásica

La prueba de PCR para el fragmento de 525 pb fue positivo a partir de las 6 horas hasta la hora 30 posinfección; sin embargo, las demás muestras y tiempos resultaron negativos (Figura 2).

PCR anidada

Se observaron resultados positivos al fragmento de 329 pb a partir de las 6 horas PIE en las diferentes muestras de los órganos hasta las 174 horas. No obstante, los resultados positivos fueron variables entre los diferentes órganos del presente estudio y los tiempos PIE (Cuadro 2 y Figura 3).

Coincidencias de las pruebas

Salmonella Enteritidis FT 13 A

En el caso de Salmonella Enteritidis, a las 6 horas PIE hubo 29% de coincidencia entre la PCR anidada y el aislamiento bacteriano. A partir de las 18 horas PIE: entre la PCR y la bacteriología, 14%; la bacteriología y la histopatología, 43%. A las 30 horas PIE la histopatología obtuvo 0% de coincidencia con la PCR, mientras que con la bacteriología y la PCR se obtuvo 86% de coincidencia.

Salmonella Issatschenko

Relación de los resultados de las pruebas

La tabla de contingencia 2 x 2, para SE FT 13 A, al comparar la PCR con la bacteriología se obtuvo 25% de sensibilidad y 54% de especificidad (Cuadro 3). Al comparar el estudio histológico con el bacteriológico se encontró una sensibilidad de 100% y 12% de especificidad (Cuadro 4), y en la tabla de contingencias de la histopatología con respecto a la PCR, la sensibilidad fue de 33% y la especificad, de 0% (Cuadro 5).

Los resultados para SI en la tabla de contingencias de 2 x 2, comparando la PCR con la bacteriología, fue de 13% para la sensibilidad y de 44% para la especificidad (Cuadro 6). Al comparar la histopatología con respecto de la bacteriología se encontró sensibilidad de 100% y 12% de especificidad (Cuadro 7). En la tabla de contingencias de Salmonella Issatschenko, para los estudios histopatológicos y la PCR, se registró una sensibilidad de 47% y una especificidad de 50% (Cuadro 8).

Estadístico Ji²

En la prueba de Ji² se encontró que la PCR y la bacteriología fueron heterogéneas en el caso de Salmonella Enteritidis FT 13 A (P < 0.05). La histopatología y la PCR fueron homogéneas (P < 0.05).

Para Salmonella Issatschenko, en la prueba de Ji² se encontró que la PCR y la bacteriología fueron homogéneas (P < 0.05). La histopatología y la PCR fueron heterogéneas (P < 0.05).

Discusión

Con los avances en biología molecular, particularmente con el desarrollo de pruebas como la PCR, se ofrece una alternativa sensible y específica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Los resultados de la PCR clásica para SE y SI fueron negativos, debido probablemente a diversos factores, como la presencia de sustancias inhibitorias: la hemoglobina, la lactoferrina, los polisacáridos, las grasas o proteínas,^21-25 debido a que pueden ocasionar problemas al detectar organismos patógenos de muestras clínicas o ambientales. Otro factor que pudiera complicar la PCR es el grupo heme y sus metabolitos.²⁵ Aunque ello no indica que no se hayan detectado muestras positivas en la PCR clásica, y tampoco implica que no haya habido amplificación, simplemente que no fue detectada por este método, ya que la PCR anidada sí dio resultados positivos.

La PCR anidada, usualmente, incrementa la sensibilidad 1000 veces, comparada con los resultados de una sola amplificación;¹⁹ sin embargo, en ese estudio, después de estandarizar el protocolo para la PCR de heces, decidieron probarlo en muestras de carne. La sensibilidad de la PCR clásica sólo fue de 10 veces, comparada con los resultados del método de cultivo estándar para la detección de Salmonella.

Myint et al. ³² indicaron que el pre-enriquecimiento de las muestras, tanto de carne molida y excretas como de órganos, mejoran significativamente el desempeño de la prueba. En el presente estudio no se utilizó el pre-enriquecimiento al buscar una alternativa de diagnóstico que fuera más rápida, ya que el pre enriquecimiento demora al menos 24 horas.^17-19,32-36

Salmonella Enteritidis FT 13 A

En este trabajo se obtuvieron resultados positivos a la PCR anidada de muestras de diferentes órganos desde las 6 horas PIE; sin embargo, a partir de las 30 horas PIE los resultados obtenidos fueron muy variables entre los diferentes órganos y tiempos. Lo anterior coincide con los resultados de los estudios histopatológicos obtenidos en el trabajo de Ruiz et al.,³ que reflejaron lesiones desde las 6 horas PIE, mientras que el aislamiento bacteriano resultó negativo.

Similares resultados obtuvieron Deng et al.,³⁷ quienes realizaron la PCR en tiempo real y utilizaron muestras de duodeno, yeyuno, íleon y ciego, incluidos también en el presente trabajo. Estos autores revelaron que a partir de las 8 horas PIE comenzaron a presentar resultados positivos por medio de la PCR en tiempo real, y a las 36 horas PIE fue donde se obtuvo mayor cantidad de SE a partir de los órganos anteriormente mencionados.

En el estudio bacteriológico de Ruiz et al.,³ se obtuvieron aislamientos positivos a partir de las 18 horas PIE, dependiendo del tejido, similar al trabajo de Turnbull y Snoeyenbos,³⁸ en el que se utilizaron aves de diferentes edades (1 día de edad, 2 semanas, 6 y 9 meses), inoculadas con 10⁶ células de SE, a las 24 horas de su llegada a la granja. Se tomaron muestras de sangre, hígado, bazo, duodeno, yeyuno, íleon, unión íleon-cecal y ciegos, a diferentes tiempos según el grupo, que, en promedio, fueron de 3,5,10,24,48 y 72 h. PIE. En las primeras horas PIE, los resultados de los aislamientos fueron variables dentro de los grupos y los órganos recolectados, pero hubo coincidencias en los aislamientos después de 3 horas PIE.

Salmonella Issatschenko

Coincidencias entre la PCR anidada y el aislamiento bacteriológico y lesiones histológicas

Salmonella Enteritidis FT 13 A

Las coincidencias entre las pruebas de la PCR anidada y los estudios bacteriológicos indicaron que hubo una relación de 29% en las muestras a las 6 horas posinfección, además de la sensibilidad de 25% y una específicidad de 54%, respectivamente, lo que refleja una relación baja entre las dos pruebas según las condiciones de este estudio. Al respecto, Whyte et al.¹⁸ mencionaron que al utilizar las dos técnicas anteriores es posible lograr una evaluación más precisa de muestras contaminadas.

La sensibilidad y especificidad resultaron bajas en el presente estudio, en comparación con el trabajo de Pérez et al.,⁴³ en el que, utilizando el mismo método estadístico de tabla de contingencias de 2 x 2, obtuvieron una sensibilidad de 70.83% entre dos pruebas de PCR, y una especificidad de 100%, en comparación con el trabajo de Myint et al.,³² quienes, utilizando pruebas de PCR anidada con y sin pre-enriquecimiento, obtuvieron resultados diferentes; la sensibilidad de la PCR sin pre-enriquecimiento fue de 0% y la especificidad de 100%, pero al usar el pre-enriquecimiento en las muestras obtuvieron una sensibilidad desde 79 a 100%, y una especificidad de 100% para los tres medios de enriquecimiento: agua peptonada amortiguada, medio Rappaport Vassiliadis y caldo tetrationato-Hajna.

Salmonella Issatschenko

En el presente estudio, las coincidencias de la PCR anidada comparada con los análisis bacteriológicos para SI fueron diferentes a SE. El pico de resultados positivos para SI en el caso de la PCR anidada fue a las 30 horas. Conforme fue pasando el tiempo PIE, los resultados positivos de la PCR anidada fueron disminuyendo hasta llegar a ninguna muestra positiva. En contraste, el trabajo realizado por Ruiz et al.,³ donde utilizaron SI, presentó aislamientos positivos a las 42, 150,174 y 222 horas PIE, mientras que en las observaciones de lesiones histológicas, el pico fue desde las 30 horas PIE.

La sensibilidad y especificidad de las pruebas de la PCR y los estudios bacteriológicos de este trabajo fueron de 13 % y 43%, respectivamente, mientras que Schrank et al.⁴⁵ registraron sensibilidad de 47%. En estas dos pruebas se compararon diferentes medios de pre-enriquecimiento para Salmonella Typhimurium y SE.

Se ha observado que con la prueba de PCR se obtienen resultados inconsistentes cuando se trabaja con el género Salmonella, por lo que Poppe et al.³⁵ sugirieron llevar a cabo otras pruebas como la microaglutinación, que otorga 81% de sensibilidad y 24% de especificidad.

Salmonella Enteritidis FT 13 A

En el presente estudio, al comparar la histopatología y la PCR anidada, la sensibilidad fue de 33% y la especificidad, de 0%, por lo que esta prueba fue más sensible que la bacteriología para determinar la presencia de Salmonella SPP en los órganos a diferentes tiempos, pero menos específica. Ruiz et al.³ encontraron lesiones histológicas desde las 6 horas PIE en pollitos, sobre todo en la porción de íleon y ciegos, corroborando mediante microscopía electrónica la presencia de SE FT 13 A. Kinde et al.,⁴⁴ a partir de órganos de gallinas infectadas con SE FT 4, por vía oral e intravenosa, concluyeron que la aves inoculadas con una cepa de campo mostraron positividad de los tejidos por un corto periodo, y que Salmonella desapareció en la mayoría, ocho días después de la inoculación. Los aislamientos de SE fueron más frecuentes cuando las lesiones eran evidentes, además se demostró que el porcentaje de aves positivas al cultivo no presentó diferencias significativas (P > 0.05).

En contraste con los resultados positivos del presente estudio por la PCR anidada, al relacionarlos con los hallazgos bacteriológicos e histopatológicos, se observó que es más sensible la histopatología, pero poco específica. En tanto que la bacteriología es menos sensible y más específica.

En el caso de SI y basado en el trabajo de Kinde et al.,⁴⁴ los hallazgos de Ruiz et al.,³ y lo obtenido en el presente estudio, muestran que las observaciones de las lesiones histológicas fueron más sensibles que los estudios bacteriológicos para detectar el daño del microorganismo en los tejidos, y gracias a la PCR anidada realizada en el presente trabajo, se detectó Salmonella en las primeras horas PIE, reflejado en mayor cantidad de muestras positivas que la bacteriología.

La técnica de la PCR anidada detectó Salmonella, pero sólo durante las primeras horas posinfección.

La relación entre los resultados de la PCR anidada, histopatología y bacteriología, presenta variaciones en función del tiempo posinoculación y la bacteria estudiada.

Se sugiere realizar el pre enriquecimiento de las muestras para obtener resultados con la PCR clásica.

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Notas

Este trabajo es resultado de la tesis, PCR SE y SI muestras de pollitos.

†Research Organics, Inc, Cleveland, Ohio 44125, Estados Unidos de América.

†Caledon Laboratories, Otn., Canada L7G 4R9.

‡Labnet International, Inc, Woodbridge, NJ 07095, Estados Unidos de América

•Fermentas International Inc, Ontario L7N 3N4, Canadá.

••Bio Synthesis Lewisville, TX, Estados Unidos de América.

♦♦Sigma Chemical CO St. Louis, Estados Unidos de América.

†Sigma Chemical Co. St. Louis. Mo 63178, Estados Unidos de América.

‡Upland, CD 9178, Estados Unidos de América.

*J.T.Baker 55320, Xalostoc, Edo de Méx. México; (KH₂PO₄ Cat. 3246-01), (Na₂HPO₄ Cat. 3828-01), (NaCl CaT. 3625-01).

**Sigma,St. Louis, MO63103, Estados Unidos de América.

***Fermentas International INC, Ontario L7N 3N4, Canadá.

****GIBCO, Life Technologies, Grand Island, N.Y. 14072, Estados Unidos de América.

*****Research Organics, Inc, Cleveland, Ohio 44125, Estados Unidos de América

******J.T. Baker Phillipsburg, NJ 08865, Estados Unidos de América.

*******Biogenica, Miami, FL 33186, Estados Unidos de América.

*********Cleaver Scientific Ltd, Rugby, Warwickshire, Reino Unido.