Interrelaciones entre ureagénesis y gluconeogénesis hepática en rumiantes alimentados con elevado contenido de nitrógeno

Relationships between liver ureagenesis and gluconeogenesis in ruminants fed with a high nitrogen diet

Mirela Noro*, Fernando Wittwer*

* Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile (UACh), Casilla 567.

Responsable de correspondencia:
Mirela Noro,
tel.fax: 5663 221457,
correo electrónico: mirelanoro@gmail.com

Recibido el 28 de febrero de 2011
aceptado el 20 de octubre de 2011

Abstract

Key words: ureagenesis, gluconeogenesis, non protein nitrogen, ruminants.

Resumen

Los rumiantes alimentados con forrajes de elevado contenido de proteína rápidamente degradable en el rumen o suplementados con nitrógeno no proteínico, absorben cantidades sustanciales de amonio en el rumen y muy poca glucosa en el intestino, en circunstancias que requieren mantener una adecuada capacidad ureagénica y gluconeogénesis para sostener su eficiencia productiva. En esta condición se eleva la producción de amonio ruminal, el cual se absorbe y posteriormente se metaboliza por el hígado en urea. Las elevadas concentraciones de amonio en el rumen pueden sobrepasar la capacidad hepática de sintetizar urea, lo que provoca una sobrecarga en el ciclo de la urea y demanda una excesiva cantidad de α–cetoglutarato y oxalacetato para la formación de glutamato y aspartato, metabolitos que también son requeridos en el ciclo de Krebs y en la vía gluconeogénica, alterando con ello la capacidad gluconeogénica del organismo. El trabajo recopila y analiza las interrelaciones entre la ureagénesis y gluconeogénesis hepática en rumiantes en condiciones de pastoreo con forrajes de elevado contenido de proteínas.

Palabras clave: ureagénesis, gluconeogénesis, nitrógeno no proteínico, rumiantes.

Introducción

Las dietas de los rumiantes con elevado contenido de proteína cruda rápidamente degradable en el rumen eleva la producción de amonio ruminal, el cual se absorbe y posteriormente metabolizado por el hígado en urea. La ureagénesis está conectada al ciclo de Krebs y a la gluconeogénesis hepática por medio de metabolitos como aspartato, oxalacetato, cetoglutarato y glutamato. Las elevadas concentraciones de amonio en el rumen generan una sobrecarga en la ureagénesis por la excesiva demanda de intermediarios del ciclo de la urea, los cuales provienen de precursores que son compartidos con el ciclo de Krebs y vía gluconeogénica. Así, el aumento en la producción de amonio ruminal compromete la capacidad hepática ureagénica, interfiriendo negativamente sobre la gluconeogénesis hepática y balance energético del animal.

Degradabilidad proteínica en rumiantes

Cuando existe un desequilibrio entre la ingesta de energía y PRD, producto de un aporte limitado en energía o elevado de PRD, la concentración de NH₄⁺ ruminal se incrementa ya que se excede la capacidad de la microbiota ruminal para utilizarlo; su acumulación alcaliniza el pH ruminal e incrementa la formación del amoníaco (NH₃, [NH₄⁺ + OH^– <–> NH₃ + H₂O]).^4,5 Por otro lado, el pH ruminal interfiere en la absorción del NH₃ producido en el rumen; cuanto más alcalino el pH ruminal (superior a 7.5) mayor es la velocidad de absorción, debido a la mayor conversión de NH₄⁺ en NH₃, que es liposoluble y fácilmente absorbido por la pared ruminal.^1,6 Valores de pH inferiores a 6.7, como sucede en animales alimentados con dietas de moderado a alto contenido de carbohidratos no estructurales, incrementan la formación de NH₄⁺, el cual es hidrosoluble y, consecuentemente, presenta una lenta absorción ruminal.^1,7 Es así que, en condiciones que favorezcan la alcalinización ruminal como ayuno, dietas con elevado contenido de fibra, o con bajo contenido de carbohidratos solubles, o la ingesta de NNP, predisponen al incremento de la absorción del NH₃.⁸

Metabolismo del amonio

La concentración de NH₄⁺ en el plasma se eleva rápidamente después de la ingestión del alimento, alcanzando un máximo a las 2 o 3 horas después de la alimentación, tiempo que varía según el tipo de alimento.^9,10 Los rumiantes suplementados con NNP, como urea, presentan un pico en la producción de NH₄⁺ ruminal en la primera hora posterior a la ración.¹¹ El efecto tóxico del NH₄ ⁺ en los mamíferos es controlado mediante un mecanismo de conversión por el hígado, a productos no tóxicos y de excreción.^6,7,12 Después de la absorción, el NH₄⁺ llega al hígado vía vena porta, donde gran parte se convierte en urea, compuesto 40 veces menos tóxico.¹ El NH₄⁺ restante, no metabolizado a urea, es incorporado a glutamina, que por contener dos grupos aminos sirve como transportador no tóxico del NH₄⁺, favoreciendo su excreción en la orina.¹³

El hígado, por su heterogeneidad en morfología y características bioquímicas, presenta algunas particularidades en relación con el metabolismo del NH₄⁺. Los hepatocitos periportales, que primeramente reciben la sangre de la vena porta aferente, contienen las cinco enzimas ureagénicas, y la glutaminasa mitocondrial (glutamina glutamato); además, son los responsables de la gluconeogénesis. Los hepatocitos perivenosos, que se distribuyen en torno a la vena eferente hepática, no presentan las enzimas ureagénicas ni la glutaminasa mitocondrial. Sin embargo, ellos poseen la enzima glutamina sintetasa citosólica (GS), que convierte glutamato en glutamina, y el transportador X_ag para el ingreso a la célula del glutamato y aspartato.^14–16

Esta organización secuencial permite una eficiente metabolización y remoción del NH₄⁺ circulante, ya que el NH₄⁺ no metabolizado en los hepatocitos peri–portales llega a los hepatocitos perivenosos, donde es incorporado a glutamina. En términos funcionales, la ureagénesis y la síntesis de glutamina presentan diferencias; la ureagénesis es un sistema de baja afinidad y con alta capacidad desintoxidante para NH₄⁺, mientras que la síntesis de glutamina presenta alta afinidad, pero baja capacidad para desintoxicar el NH₄⁺. En concentraciones fisiológicas de NH₄+ (200–300 µM/l), cerca de 2/3 del NH₄⁺ es convertido en urea y 1/3 en glutamina.¹⁶ Estudios con la adición de NH₄⁺ en hepatocitos ovinos demuestran una liberación semejante de N vía urea o glutamina.¹⁵

En rumiantes, la efectividad de la remoción del NH₄⁺ como urea o como glutamina, asegura que aproximadamente 98% del NH₄⁺ presente en la vena porta sea removido durante su paso por el hígado. De modo que esos sistemas son considerados vitales para la manutención de una baja amonemia en la sangre periférica.¹⁵

Ureagénesis

En los rumiantes de pastoreo, la ureagénesis es de particular importancia, ya que más del 60% de la urea plasmática puede ser originada del NH₄⁺ ruminal, y hasta 98% del N dietético puede ser transformado en NH₄ ⁺ en el rumen.^17,18

La síntesis de la urea involucra una secuencia de reacciones bioquímicas, controladas por las enzimas ureagénicas. En mamíferos, el hígado es el único órgano que posee todas las enzimas necesarias para la ureagénesis, utilizando distintas fuentes de N para la formación de la urea por medio de condensación, deaminación y transaminación.^12,17,19

La síntesis de urea es un proceso cíclico donde la ornitina es consumida en la 2ª reacción y regenerada en la 5ª, propiciando que no ocurra pérdida neta o ganancia de citrulina, arginosuccinato o arginina. Entretanto, el NH₄⁺, CO₂ y aspartato son consumidos (Figura 1).^12,19

El primer paso para la síntesis de urea es la condensación de CO₂, NH₄⁺ y ATP para formar carbamoil fosfato (CbP), en la que un ATP sirve como fuente de energía. Esa reacción es catalizada por la CPS–I. La acción coordinada de la enzima auxiliar de la ureagénesis, glutamato deshidrogenasa (GD; EC: 1.4.1.2) junto con la CPS–I, transfiere el N para formar CbP producto intermediario, con elevado potencial de transferencia del NH₄+ para el ciclo de la urea.^12,19 Cuando la fuente del N (primer N) para la ureagénesis proviene del NH₄⁺ ruminal sin formación de glutamato el costo energético es de 1 ATP, a su vez cuando proviene del glutamato el balance es positivo, de 2 ATP.

El próximo paso del ciclo es la catálisis del CbP, el cual se adiciona a la ornitina, por la enzima L–ornitina transcarbamoilasa (OTC; EC: 2.1.3.3), para formar citrulina. Esa reacción ocurre en la matriz mitocondrial, de donde emigra la citrulina al citosol. La citrulina se une al aspartato, vía el grupo amino, para formar arginosuccinato, reacción catalizada por la arginosuccinato sintetasa (AAS; EC: 6.3.4.5). En esa reacción, el aspartato dona el segundo N para la síntesis de urea, reacción que requiere un ATP.^12,19 Por otro lado, el costo para la formación del aspartato es de 3 ATP cuando proviene de alanina (2 alanina + CO₂ + 3ATP — 2 piruvato + urea + 2 ADP + 2Pi + AMP + PPi) o glutamina (glutamina + CO₂ + NADH + 3 ATP — oxoglutarato + urea + NAD + 2 ADP + 2Pi + AMP + PPi).²⁰

La reacción subsiguiente es un quiebre reversible, catalizado por la arginino succinasa, la cual retiene el N del arginosuccinato y libera el esqueleto del aspartato formando fumarato y arginina. La reacción final del ciclo de la urea es la división hidrolítica de la arginina catalizada por la arginasa (EC: 3.5.3.1) hepática, y la consecuente liberación de urea.^19,22 El fumarato liberado queda disponible para formar oxalacetato en el ciclo de Krebs (Figura 1), ruta que forma 3 ATP.

Cuando ocurren desbalances en la disponibilidad de intermediarios del ciclo de la urea, disminuye la remoción del NH₄⁺ y éste se acumula en los tejidos.^7,12,23 Existen mecanismos específicos para reducir el riesgo de acumulación de NH₄⁺, por ejemplo, en los hepatocitos periportales, la K_eq de la GD mitocondrial favorece fuertemente la síntesis de glutamato a partir de NH₄⁺ y de oxoglutarato. En la ureagénesis vía NH₄⁺, el N amoniacal puede ingresar al ciclo de la urea tanto a través del N del CbP como del aspartato.²¹ Esta última vía de ingreso depende de la síntesis de glutamato a partir de NH₄+, oxoglutarato, cetoglutarato y NADH. El glutamato probablemente es el principal donador del N–intermediario para aspartato.²⁴ Esa acción de la GD, cuando se acopla al aspartato, vía AST (aspartato aminotransferasa; EC: 2.6.1.1), transfiere el NH₄+ al aspartato mitocondrial, ruta importante cuando la extracción de éste excede al catabolismo aminoacídico. Lo anterior probablemente ocurre en circunstancias fisiológicas de rumiantes alimentados con forrajes frescos y ensilajes de elevado contenido de N amoniacal.^15,25,26

En estudios donde se utilizaron hepatocitos ovinos incubados con ¹⁵NH₃ se demostró la posibilidad de producción de ¹⁵N–urea, determinando que el ¹⁵NH₃ puede ser transferido al aspartato.^24,27 Durante una sobrecarga por NH₄⁺ 32% del aspartato puede ser derivado del NH₄⁺;²⁸ otros estudios con hepatocitos incubados con ¹⁵NH₃ indican que el glutamato y el aspartato se enriquecen similarmente con ¹⁵NH₃, confirmando que las enzimas auxiliares de la ureagénesis, GD y AST, están involucradas en la desintoxificación del NH₄+ en los rumiantes.¹⁵

Como se sabe, los aspectos que diferencian a los rumiantes de los monogástricos es la actividad enzimática más elevada de la OTC, arginasa y GD, sugiriendo que tienen una mayor capacidad de desintoxicar NH₄⁺ vía el ciclo de la urea.²⁹

Todavía no está completamente esclarecido si la ureagénesis es activa o pasivamente controlada, y cuáles son todos los factores involucrados. Se sabe que las concentraciones y actividades de las enzimas del ciclo de la urea pueden controlar la ureagénesis, por ejemplo el aumento de la actividad de la AAS después de un corto tiempo con alimentación elevada en proteína, aparentemente disminuye la toxicidad por urea, y que la acidosis metabólica reduce la ureagénesis.¹⁵

El glucagón conduce a una disminución de la retención de N y consecuente síntesis de urea. A su vez, la insulina desvía los aminoácidos en dirección al anabolismo de tejidos periféricos, no obstante, las acciones de la insulina sobre el ciclo de la urea no están esclarecidos in vivo.^7,15

La hiperamonemia ocurre cuando el flujo portal de NH₄⁺ excede la capacidad de captación hepática. Como consecuencia de una elevada ingesta de proteínas, se produce una rápida acumulación de NH₄⁺ en el rumen, aumentando su absorción. Cuando los animales no están previamente adaptados a dietas con alto contenido de proteínas o cuando los aminoácidos del ciclo de la urea son limitados, se sobrepasa la capacidad hepática de metabolización a urea, por lo que se produce una hiperamonemia con acumulación de NH₄+ en los tejidos, donde ejerce toxicidad, ya que las concentraciones tisulares de éste son unas 50 veces superiores a las sanguíneas.⁷

La hiperamonemia está caracterizada por una elevación de las concentraciones de NH₄⁺ sanguíneas e hiperglucemia.^30,31 Se ha demostrado que la hiperglucemia debido a la hiperamonemia en rumiantes está asociada con una glucogenólisis hepática, reducción de la utilización periférica de glucosa, y disminuida secreción pancreática de insulina.^30,32 La intoxicación subclínica por NH₄⁺ reduce la concentración plasmática de insulina en ovinos³⁰ y novillos,³³ probablemente por inhibición de la secreción de insulina.^31,34

Los límites fisiológicos de las concentraciones plasmáticas de NH₄⁺ en bovinos están entre 7 y 95 u M/l^33,35 y de 76 a 164 µM/l en sangre periférica de ovinos.³⁶ Se considera una intoxicación subclínica por NH₄⁺ en bovinos, cuando las concentraciones de NH₄⁺ arterial son superiores a 190 µM/l.³²

La máxima capacidad hepática de la vaca lechera en lactancia para metabolizar NH₄⁺ está poco estudiada in vivo. Aparentemente, la máxima capacidad de extracción de NH₄⁺ es aproximadamente 1.84 mM de NH₃/min/kg de hígado,³⁷ cantidad equivalente a la ingesta de 29 g de N/d para un ovino de 40 kg (1.05 g N/kg^0.9) y de 435 g de N/día, para un bovino de 600 kg (1.37 g N/kg^0.9).^25,38

La capacidad hepática para metabolizar el NH₄⁺ a urea puede ser sobrepasada en animales alimentados con alto suministro de PRD, en los que se producen fluctuaciones diarias en la producción de NH₄⁺, o bien por excesiva absorción de los aminoácidos.²⁶ El organismo requiere de una semana para realizar sus ajustes metabólicos enzimáticos que permitan que el aumento del NH₄⁺ se traduzcan en aumento de las concentraciones de urea en sangre.³⁵

Gluconeogénesis en el rumiante

Gluconeogénesis es el término que incluye todos los mecanismos y vías responsables de la conversión de sustancias no originarias de carbohidratos a glucosa o glucógeno. El hígado y los riñones son los dos tejidos capaces de realizar gluconeogénesis, pues contienen todas las enzimas gluconeogénicas.³⁹

La importancia de la gluconeogénesis en rumiantes de pastoreo alimentados principalmente con forrajes ricos en fibra, se debe a que su organismo absorbe cantidades insignificantes de glucosa por el tracto digestivo y su capacidad de almacenamiento de glucógeno en el hígado es limitada.⁴⁰ Cuando se compara la necesidad de glucosa en rumiantes para el sistema nervioso central, gestación y lactación, con la de los monogástricos, se comprueba que no es inferior, sino incluso mayor, como en el caso de vacas de elevada producción. Aproximadamente 60% de la glucosa del rumiante en lactancia es utilizada para la síntesis de la lactosa.^3,40,41 Como ejemplo, para sintetizar 30 litros de leche se necesitan 2200 g de glucosa,⁴² de ello se deduce que a medida que se eleva la productividad, la gluconeogénesis adquiere mayor importancia.

Cuantitativamente, la mayor fuente de energía absorbible en rumiantes son los ácidos grasos volátiles acetato y butirato, no gluconeogénicos, y propionato, principal precursor gluconeogénico. A su vez, el glicerol, el lactato y el valeriato, también son gluconeogénicos, pero su producción es insuficiente para cubrir los requerimientos gluconeogénicos.^40,41 Sin embargo, en periodos de carencia alimentaria, el glicerol y los aminoácidos glucogénicos son los principales precursores de glucosa.^40,43

El papel de los aminoácidos en la gluconeogénesis en vacas y ovinos puede representar entre 5 y 30% de la producción total de glucosa.^40,46–48 La conversión de aminoácidos a glucosa ocurre en el hígado del rumiante, y en menor extensión, en el riñón. La mayoría de los aminoácidos derivados del músculo esquelético no son transportados directamente al hígado como tal, sino que inicialmente son convertidos a aminoácidos de transporte como alanina y glutamina en el músculo. La glutamina y la alanina son los dos aminoácidos mayormente responsables por la producción de glucosa en los ovinos, y en las vacas se suma el aspartato.^40,49

El costo energético medio de la gluconeogénesis es próximo al de la ureagénesis (4–5 moles de ATP por mol de glucosa formado, partiendo de una proporción de 70% de propionato, 10% de lactato y 20% de aminoácidos como sustratos gluconeogénicos).²⁰

Relaciones entre ureagénesis y gluconeogénesis hepática

Los hepatocitos periportales son responsables de la ureagénesis, gluconeogénesis y glucogenólisis, y los perivenosos lo son de la glucólisis, lipogénesis y síntesis de glutamina.¹⁶ Las enzimas gluconeogénicas fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK, EC: 4.1.1.32), glucosa–6–fosfatasa (EC:3.1.3.9), 1,6 fructosa bifosfatasa (FBPasa, EC: 3.1.3.11) y glucoquinasa (EC:2.7.1.2) se localizan predominantemente en la zona periportal hepática.^14,50–52

La ureagénesis hepática está controlada por las enzimas ureagénicas, los intermediarios del ciclo de la urea, y por la disponibilidad de aspartato. Los procesos de gluconeogénesis y ureagénesis en los hepatocitos periportales,^14,16 se integran, vía ciclo de Krebs, por medio de aminoácidos específicos (aspartato, glutamato, alanina) y oxalacetato (Figura 1).² Lo anterior hace suponer que una mayor demanda ureagénica puede alterar la eficiencia gluconeogénica.

El exceso de NH₄⁺ puede afectar la gluconeogénesis aminoacídica, así como del propionato.²⁷ Ensayos in vitro con hepatocitos ovinos tratados con florizina, sustancia que provoca glucosuria aumentando la demanda de glucosa, demuestran que el cloruro de amonio (NH₄Cl) disminuye la velocidad máxima de conversión de propionato a glucosa, afectando la capacidad de los hepatocitos para utilizar propionato en la oxidación y gluconeogénesis.⁴⁸ La conversión de propionato a glucosa in vitro disminuye 30% en hepatocitos ovinos tratados con NH₄ (0.25–0.5 mM).⁵³ Otro estudio indica que la síntesis de urea, estimulada por NH₄⁺, puede reducir la gluconeogénesis hepática 25 por ciento.²¹

El NH₄Cl inhibe la conversión de alanina a glucosa en hepatocitos aislados de ovinos, pero el mecanismo involucrado en esa inhibición no se conoce. En hepatocitos de ratas el efecto primario de NH₄Cl es la conversión del oxalacetato mitocondrial a malato y de éste a aspartato, con la finalidad de contribuir con un átomo de N para la ureagénesis,⁵⁴ disminuyendo consecuentemente el oxalacetato mitocondrial y su flujo para PEPCK y, por lo tanto, la gluconeogénesis.

La hiperamonemia disminuye la producción y liberación de glucosa hepática en ovejas⁵⁵ y vacas.³² Los análisis de los flujos netos hepáticos de NH₄+ y urea para un rango amplio de consumo y dietas, indican que el cociente de síntesis N ureico por NH₄⁺ se aproxima a 2, sugiriendo que la síntesis de urea requiere una contribución adicional de N aminoacídico, el que es entregado por aspartato. Este aporte, si bien permite equilibrar el ingreso de NH₄⁺ al ciclo de la urea como CbP,⁵⁶ reduciría la disponibilidad de aminoácidos para la gluconeogénesis.

A su vez corderos suplementados con alto contenido de NNP en la dieta⁵⁷ o vacas en pastoreo de praderas con alto contenido de proteínas y suplementadas con NNP⁵⁸ presentan un incremento en la capacidad gluconeogénica vía propionato,⁵⁹ una mayor actividad de la PEPCK y un balance energético más positivo.⁵⁷

El NH₄ puede alterar el metabolismo energético, además de llevar a la depleción de cetoglutarato y de ATP.⁶⁰ Los ovinos alimentados con urea poseen 36% menos cetoglutarato, 14% de piruvato y 32% de glucosa 6–P, respectivamente, que los alimentados con proteína de soya.⁶⁰

Por otro lado, el costo de la desintoxicación de la urea y, probablemente otros gastos energéticos de mantenimiento hepático asociados, son mayores con el incremento de la ingesta de N.⁶¹ Sin embargo, algunos ATP pueden ser recuperados de las células cuando los cetoácidos formados durante la deaminación aminoacídica se oxidan a través del ciclo de Krebs.⁶² No obstante, cualquier requisito para la ureagénesis provocada por una baja eficiencia de utilización de N, no sólo representa una pérdida de N sino también potencialmente de energía útil.

Además, se describe una disminución en la actividad de la isocitrato deshidrogenasa (isocitrato cetoglutarato), en presencia de NH₄⁺. Las mayores actividades enzimáticas ureagénicas en ovinos suplementados con urea se traducen en un mayor potencial de conversión y de consumo de cetoglutarato con la finalidad de conservar ornitina. El glutamato ocupa un papel central en el metabolismo N y su síntesis aparentemente es un prerrequisito para la máxima formación de urea.⁶⁰ Del glutamato procede aproximadamente 8% de la glucosa corporal,⁴⁰ de modo que ambos, glutamina y glutamato, son sustratos que comparten la ureagénesis y gluconeogénesis.⁶³

Los antecedentes presentados señalan que tanto la ureagénesis como la síntesis de glutamina operan efectivamente, ejerciendo importantes implicaciones para la productividad del rumiante. A su vez, ambas rutas pueden ser excedidas en condiciones de hiperamonemia periférica y el catabolismo aminoacídico puede ser estimulado para suplir la necesidad adicional de N–aspartato, produciendo un desequilibrio con el ciclo de Krebs. De esa información se supone que la manutención de una adecuada biotransformación de NH₄⁺ depende de la disponibilidad de aspartato y glutamato, generados vía oxalacetato y cetoglutarato.

Como el metabolismo proteínico en rumiantes está íntimamente relacionado con el metabolismo energético, un desequilibrio metabólico proteínico o energético puede conducir a un menor desempeño productivo. Todavía no se ha contabilizado la magnitud de los efectos del exceso de amonio sobre el metabolismo energético; sin embargo, su exceso parece interferir en la máxima expresión productiva, resultando en un desempeño menor al esperado, situación de importancia en vacas de elevada producción láctea a pastoreo o suplementadas con PRD, las cuales requieren de una plena capacidad gluconeogénica, o en animales en crecimiento que necesitan de un gran aporte aminoacídico. De la relación entre la ureagénesis y gluconeogénesis, se sugiere que el aumento de PRD o NNP podrían afectar negativamente la gluconeogénesis, lo que sería crítico durante periodos de elevados requerimientos.

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