Prevalencia de Giardia intestinalis y predominio de genotipos zoonóticos en ovinos y bovinos de traspatio de cinco estados de la República Mexicana

Prevalence of Giardia intestinalis and zoonotic genotype predominance in small scale sheep and cattle farms in five states of the Mexican Republic

Juana Jimena Otero–Negrete* Froylán Ibarra–Velarde* Mario Noé Martínez–Gordillo** Martha Ponce–Macotela**

* Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510. México, DF.

Responsables de la correspondencia:
Martha Ponce–Macotela. Tel. (52) 55 10840900–1454,
Correo electrónico:macotelam@yahoo.com
y Juana Jimena Otero–Negrete, Correo electrónico: catjim99_2000@yahoo.com

Recibido el 30 de abril de 2010.
Aceptado el 10 de enero de 2011.

The aim of this paper was to discover the prevalence and assemblages of Giardia intestinalis, harbored in sheep and cows on familiar farms from five states of the Mexican Republic. Stool samples from 265 sheep and 174 cows were analyzed by centrifugation and flotation in zinc sulfate to search for cysts and ova. The samples with Giardia cysts were processed in a Sheather solution in order to isolate them. Afterwards, cultures were established in TYI–S–33, each one of which was the Giardia DNA source. The DNA was obtained and used as a template to amplify a fragment of the glutamate dehydrogenase (gdh) enzyme. The 430 bp amplicons were restricted with Nla IV and Rsa I in order to identify the restriction fragments length polymorphisms (RFLP's) patterns. From the cyst analysis, Giardia cysts in nine cows (5.1%) and 30 sheep (11.3%) were found. Then 10 axenic cultures (5 from sheep and 5 from cows) were set up. From the RFLP's pattern it was found that one cow had assemblage (AI), another two had a mixture of assemblages (AI + BIII) and the other two had (E + BIII). In sheep, it was found that two sheep had assemblage (AI) and the other three had a mixture of assemblages (AI + BIII). This is the first report in which zoonotic assemblages (A–I and BIII) predominance in ruminants from five states of Mexico have been demonstrated. Therefore, it is necessary to carry out further studies aimed at discovering other Giardia genotypes and transmission patterns between animals and humans in Mexico.

Key words: Giardia intestinalis, zoonotic genotypes, glutamate dehydrogenase, sheep, cattle.

Resumen

Con el fin de determinar la frecuencia y genotipos de Giardia intestinalis en ovinos y bovinos de traspatio de algunos estados de la República Mexicana, en este trabajo se colectaron heces de 265 ovinos y 174 bovinos, para la búsqueda de Giardia mediante coproparasitoscópicos (CPS) de concentración flotación. De las muestras fecales que resultaron positivas se obtuvieron los quistes por el método de Sheather. Los quistes se desenquistaron in vitro y los trofozoítos se mantuvieron en cultivo TYI–S–33 axénico. El ADN de los trofozoítos se obtuvo mediante extracciones fenólicas y se amplificó un segmento de ≈ 430 pb del gen de la enzima glutamato deshidrogenasa (gdh) por medio de la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR), el producto se restringió con las enzimas Nla IV y Rsa I y se obtuvieron los polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP). En los CPS se encontró a Giardia en nueve bovinos (5.1%) y 30 ovinos (11.3%). Se establecieron 10 cultivos axénicos (5 de bovinos y 5 de ovinos). En un bovino se encontró el genotipo (AI), dos tuvieron mezcla de los genotipos (AI + BIII) y los otros dos fueron (E + BIII). Un ovino fue genotipo (AI) y tres tuvieron mezcla de los genotipos (AI + BIII). Éste es el primer informe que presenta predominio de genotipos zoonóticos (AI y BIII) en ovinos y bovinos de México. Es necesario investigar los genotipos de Giardia y patrones de transmisión entre animales y humanos en México.

Palabras clave: Giardia intestinalis, genotipos zoonóticos, glutamato deshidrogenasa, ovinos, bovinos.

Introducción

Giardia intestinalis (G. duodenalis, G. lamblia) es un parásito de distribución mundial, que se encuentra en un amplio rango de mamíferos domésticos, selváticos y el hombre.^1–3 Esta parasitosis es muy frecuente en la población infantil, le produce diarrea e impacta negativamente en su crecimiento y desarrollo, por tal motivo, la OMS la incluyó en el grupo de las "enfermedades desatendidas".⁴ En rumiantes, la giardiosis también produce síndrome de malabsorción, pérdida de peso, evacuaciones anormales y por consiguiente, mala conversión alimenticia y pérdidas económicas para el productor.^5,6 En diferentes partes del mundo la prevalencia es variable, en bovinos oscila entre 9 y 73%, y en ovinos entre 1.5 y 38%.⁷

En México, la giardiosis se ha detectado en perros¹² y se han genotipificado muestras procedentes de humanos, perros y de un gato,^13–15 pero no hay registros de esta parasitosis en rumiantes y no sabemos si son portadores de genotipos zoonóticos, por tal motivo, el propósito de este estudio fue conocer la prevalencia de la giardiosis en ovinos y bovinos, así como determinar si son portadores de genotipos zoonóticos, mediante la amplificación de un segmento del gen de la glutamato deshidrogenasa y los polimorfismos de los fragmentos de restricción.

Material y métodos

Obtención y procesamiento del material biológico

Se realizó un muestreo por conveniencia, colectando muestras de heces directamente del recto (aproximadamente 100 g) de 439 animales de pequeños rebaños de traspatio, pertenecientes a cinco estados de la República Mexicana: Hidalgo (93 ovinos y 69 bovinos), Estado de México (12 ovinos y 30 bovinos), Morelos (160 ovinos y 5 bovinos), Querétaro (6 bovinos) y Veracruz (64 bovinos). Las muestras se colocaron en contenedores de plástico y se almacenaron a 4°C hasta su análisis. Para la búsqueda de quistes de Giardia se hicieron coproparasitoscópicos de concentración flotación (Faust).¹⁶

Desenquistamiento y cultivo de trofozoítos de Giardia in vitro

Las muestras positivas a Giardia se procesaron para concentrar los quistes por el método de Sheather.¹⁷ Los quistes se desenquistaron in vitro, incubándolos en solución salina balanceada de Hank (SSBH) pH 2.0 a 37°C durante 45 minutos; posteriormente, la muestra se amortiguó con SSBH pH 7.2, se centrifugó y los quistes activados se colocaron en medio de cultivo TYI–S–33 complementado con 10% de suero fetal bovino y 1.0 mg/1.0 ml de bilis bovina, y se incubaron a 37°C. Para corroborar que los cultivos de Giardia estuvieran axénicos, se obtuvieron alícuotas y se sembraron en gelosa sangre y Sabouraud.¹⁸

Purificación del ADN

Los trofozoítos axénicos se lavaron con solución salina fosfatos (PBS) pH 7.0, se concentraron e incubaron en solución de lisis (Tris–HCl, 10mM (pH 7.4); EDTA, 10mM; NaCl, 150mM; SDS, 0.4% y proteinasa K, 0.2 mg/ml) durante toda la noche a 42°C. Posteriormente se realizaron tres extracciones fenólicas con fenol:cloroformo (1:1) y una con cloroformo. Se obtuvo la fase acuosa y para precipitar los ácidos nucleicos se incubó a –20°C toda la noche con acetato de sodio 3M (pH 7.0) y etanol –20°C. Los ácidos nucleicos se disolvieron en amortiguador de TE (Tris, EDTA) (Tris–HCl, 10mM, pH 7.0; EDTA, 1mM). Para eliminar el ARN, los ácidos nucleicos se incubaron con 20yg/ml de RNasa a 37°C durante 60 minutos, se repitió una extracción fenólica y el ADN se precipitó con etanol–acetato de sodio y se disolvió con amortiguador de TE.

El ADN de Giardia de los aislados que se obtuvieron se utilizó para la amplificación de un segmento de ≈430 pb del gen de la enzima glutamato deshidrogenasa (gdh) mediante la PCR.¹¹

La mezcla de la reacción contenía: MgCl₂, 1.5 μM; dNTP, 200μM; oligonucleótidos, 12.5μM; ADN taq polimerasa,* 0.625 unidades; y ADN de Giardia, 100 ng, todo en un volumen final de 25 μL. El testigo negativo consistió en la mezcla de la reacción sin el ADN de Giardia y el testigo positivo fue el ADN de un aislado de Giardia previamente obtenido de un niño (INP–H12).

Se realizó una primera amplificación con los oligo–nucleótidos: externo GDHef: TCA ACG TYA AYC GYG GYT TCC GT, reverso GDHiR: GTT RTC CTT GCA CAT CTC C y la segunda amplificación fue con el interno GDHiF: CAG TAC AAC TCY GCT CTC GG y el reverso GDHiR.

Las condiciones de la PCR fueron: una etapa de desnaturalización a 95°C por 10 min, 2 ciclos a 95°C por 30 seg, 56°C por 1 min y 72°C por 2 min; seguido de 55 ciclos a 95°C por 15seg, 56°C por 30 seg y 72°C por 45 seg, y un ciclo de extensión a 72°C por 7 min. Los productos generados se identificaron en geles de agarosa a 1.0% en amortiguador de tris boratos EDTA (TB) y teñidos con 0.5yg/ml de bromuro de etidio.

Para los RFLP, se incubaron 10 μL de los productos de la PCR toda la noche a 37°C, con 5 unidades de las enzimas Nla IV o Rsa I** en los amortiguadores correspondientes. Los fragmentos de las restricciones se identificaron en geles de agarosa de alta resolución a 1.5% en amortiguador de tris boratos EDTA (TB) y teñidos con 0.5μg/ml de bromuro de etidio.

Resultados

Prevalencia de Giardia y cultivos axénicos

La prevalencia de Giardia en bovinos fue de 5.17% y en ovinos de 11.3% (Cuadro 1). Se obtuvieron cultivos axénicos de Giardia procedentes de cinco ovinos: INP–O6, INP–O45, INP–O11, INP–O14 e INP–O3. También fueron cinco de bovinos: INP–B43, INP–B47, INP–B438, INP–B704 e INP–BVD3. No se obtuvieron otros aislados de Giardia porque la cantidad de quistes fue insuficiente, se contaminaron después del des–enquistamiento o fueron refractarios al cultivo.

En todos los casos la amplificación del gen de la gdh generó una banda de ≈ 430 pb. La restricción con Nla IV de los cinco aislados de ovinos y tres de bovinos generó las bandas de 90, 120 y 150 pb características del genotipo AI. En dos aislados de bovinos las bandas fueron de 80, 100 y 220 pb que corresponden al genotipo E (Figura 1).

La restricción con la enzima Rsa I de tres muestras procedentes de ovinos y cuatro de bovinos generaron bandas de ≈ 130 y ≈ 300 pb características del genotipo BIII. La presencia de una banda de ≈ 240 pb (carriles 5, 7–9) sugiere un componente adicional a lo publicado (Figura 2).

Dos aislados de bovinos (INP–B438 e INP–BVD3) y tres aislados de ovinos (INP–O6, INP–O45, INP–O11 e INP–O14) tuvieron mezcla de los genotipos AI + BIII. Dos aislados de bovinos (INP–B704 e INP–B47) tuvieron mezcla de los genotipos AI + E (Cuadro 1).

Discusión

En un estudio que se realizó en Italia, se registró una prevalencia menor: de 325 ovinos, de 20 granjas, se encontraron cinco infectadas (1.5%), pero concuerda con los datos del presente estudio, ya que ellos también encontraron el genotipo "AI".²¹ Prevalencias mayores se registraron en Canadá, 38% de 89 ovinos²² y en Bélgica, de 137 muestras, 25.5 % tuvo Giardia, el análisis molecular demostró mayor prevalencia del genotipo "E" (6), dos tuvieron el genotipo "A" y dos presentaron mezcla de los genotipos E+A.²³ En otro estudio, el análisis de 63 muestras reflejó mayor sensibilidad con la PCR (25.4%) que con la inmunofluo–rescencia (12.7%). Prevaleció el genotipo "E", pero también tuvieron una muestra con genotipo "A".²⁴

Por otro lado, en este trabajo se encontró baja prevalencia de Giardia en bovinos (9 de 174), pero el resultado es fundamental, ya que por primera vez se informa del genotipo "E" (característico de rumiantes) en muestras de bovinos en México, los dos procedían de una granja del estado de Hidalgo; otros tres bovinos, incluido el del estado de Querétaro, registraron el genotipo "AI" (zoonótico). Hasta donde se sabe, no había registros de estos genotipos en muestras de bovinos en México. Adicionalmente, se encontró mezcla del genotipo especie–específico con genotipo zooótico E+BIII (2) y mezcla de genotipos zoonóticos AI+BIII (2). Se debe secuenciar el amplicón de los aislados BVD3, O45, O14 y O6, porque presentaron una banda adicional de ≈240 pb (Figura 2). Pocos estudios en otras partes del mundo también muestran mezclas de genotipos especie específicos con genotipos zoonóticos (E+A) o (E+B). Por ejemplo, en granjas de Bélgica, de 101 muestras de bovinos con Giardia, el 53% tuvo genotipo "E", 16% genotipo "A" y 31% mezcla de genotipos (E+A).²⁵ En Italia, 12 muestras de bovinos fueron genotipo "A", cinco "B", tres "E", y cuatro tuvieron mezcla de los genotipos A+B (2) y A+E (2).²⁶ En el estudio de tres granjas de Georgia, USA, se registró 83% con el genotipo "E", 14% con el genotipo "A" y 3% con mezcla de los genotipos (E+A).²⁷ En otras partes del mundo predomina el genotipo "E" en ovinos y bovinos;^28–30 sin embargo, en este trabajo se encontró mayor prevalencia del genotipo "AI" que es zoonótico.

Los resultados de este trabajo muestran que los animales de producción, sobre todo en producciones de traspatio, como los ovinos y bovinos, son portadores de genotipos zoonóticos de G. intestinalis y son una fuente de diseminación de quistes para los propietarios, debido a que regularmente son los que manejan al ganado. Adicionalmente, se ha observado que la giardiosis impacta negativamente en la ganancia de peso del ganado, por lo tanto, es necesario evaluar las consecuencias en la producción de ovinos y bovinos de granjas de traspatio mexicanas, establecer medidas de control y prevención para evitar su diseminación, así como también el desarrollo de estudios epidemiológicos integrales que esclarezcan el flujo de los genotipos zoonóticos entre animales de producción, animales de compañía y humanos.

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Notas

Producto de la tesis de Doctorado de Juana Jimena Otero–Negrete.

* AmpliTaq Gold ADNpolimerasa (Roche).