Evaluación de la capacidad inmunogénica y protectora de antígenos de Pasteurella multocida, obtenidos de aislados de casos clínicos
Immunogenic evaluation and protection of Pasteurella multocida antigens isolated from clinical cases
Germán Guadarrama Cruz* Lemuel León Lara* María Uxúa Alonso Fresán* Roberto Montes de Oca Jiménez* Pomposo Fernández Rosas*
* Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México, Km. 15.5, Carretera Toluca–Atlacomulco, 50200, Toluca, México. Trabajo de tesis de maestría en ciencias agropecuarias y recursos naturales del primer autor.
]]> Autor responsable de correspondencia:
Recibido el 22 de abril de 2009.
Aceptado el 5 de noviembre de 2009.
Abstract
The immunogenic protection response to four P. multocida isolations obtained from clinical cases and a reference strain was studied. Isolations were proven as three different immunogens: complete antigen (Ag), washed Ag and culture supernatant. They were subcutaneously administered in SPF light White Leghorn hens. Immune response was evaluated using ELISA test and challenge test evaluated protection response. The ANOVA and Tukey test did not show statistical differences between groups. All isolations using different vaccines induced high protection levels ranging from 87 to 100%. This study indicates that immunization using these three immunogens induce an effective response against P. multocida challenge with the best protection when culture supernatant is used.
]]> Key words: Evaluation, P. multocida, isolations, immunogenic, protection.
Resumen
Se investigaron los niveles de anticuerpos y la capacidad protectora de cuatro diferentes aislados de P. multocida, obtenidos de casos clínicos y de una cepa de referencia. Los aislados se evaluaron como tres inmunógenos diferentes: antígeno completo (Ag), Ag lavado y el sobrenadante del cultivo. Se administraron en aves ligeras de la raza White Leghorn (SPF) por vía subcutánea. Los niveles de anticuerpos se determinaron mediante el ensayo de ELISA y la protección, desafiando las aves con los respectivos aislados utilizados para vacunación. ANDEVA y la prueba de Tukey no mostraron diferencias estadísticas entre grupos. Todos los aislados en los diferentes tipos de preparación de la vacuna indujeron altos niveles de protección, entre el 87% y 100%. Este estudio indica la efectividad de los diferentes aislados clínicos en la protección de las aves desafiadas.
Palabras clave: Evaluación, P. multocida, aislados, inmunógenos, protección.
Introducción
Pasteurella multocida (P. multocida) es una bacteria gramnegativa, aerobia y no móvil, agente causal del cólera aviar en aves domésticas y pasteurelosis aviar en otras especies. Produce septicemia hemorrágica en bovinos y rinitis en los cerdos.1 La enfermedad ocurre generalmente en dos formas, como una enfermedad septicémica aguda con alta morbilidad y mortalidad o como una infección crónica localizada en articulaciones y senos infraorbitarios.2 P. multocida está clasificada en cinco serogrupos capsulares denominados A, B, D, E, F y serovares 1–16, basados en antígenos de lipopolisacáridos o antígenos somáticos.2,3 Con fundamento en estudios de homología de ADN, la especie ha sido dividida en tres subespecies denominadas multocida, septica y gallicida, las subespecies pueden ser diferenciadas por sus características fisiológicas.4 Las tres subespecies han sido aisladas de brotes de cólera aviar.5 La subespecie multocida es la más comúnmente aislada de pollos y pavos y en menor porcentaje la subespecie septica;6 la subespecie multocida es predominante en aves raptoras;7 la subespecie gallicida está relacionada principalmente con aves palmípedas.8
La virulencia de P. multocida es compleja y variable dependiendo de la cepa, especies hospederas y condiciones de contacto entre ambas. La habilidad de P. multocida para invadir y reproducirse en el hospedero se incrementa por la presencia de una cápsula, ya que le permite evadir al sistema inmune debido a su actividad antifagocítica.9 La disminución de la habilidad de una cepa virulenta para producir una cápsula da como resultado la disminución de su virulencia.10 Muchos aislamientos de casos de cólera aviar tienen cápsulas grandes, pero son de baja virulencia;11 por tanto, la virulencia está aparentemente relacionada con algunas sustancias químicas asociadas con la cápsula, más que con su presencia física.
Las cápsulas son polisacáridos altamente hidratados localizados externamente y adheridos a la pared celular.12 La localización de los polisacáridos extracelulares en la superficie más externa de la célula es importante porque ellos son el primer portal de entrada y la última barrera para la excreción de sustancias dentro y fuera de la célula.13 Varias hipótesis han sido postuladas acerca de la función de la célula bacteriana: incluyen protección contra la desecación en el ambiente,14 fagocitosis15 y la actividad bactericida del complemento del suero.8
]]> Las endotoxinas son producidas por cepas de P. multocida virulentas o avirulentas, pueden contribuir con la virulencia, la invasión y la multiplicación de la bacteria. Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS) que recubren la membrana externa de la pared celular de las bacterias gramnegativas y son consideradas el principal componente responsable para la inducción del choque séptico que frecuentemente acompaña a las infecciones graves que ocasiona esta bacteria.9 Los signos clínicos de cólera aviar han sido inducidos con inyección de cantidades pequeñas de endotoxina.16Es claro que los LPS de P. multocida estimulan la inmunidad humoral y están considerados como antígenos protectores. Las cepas de P. multocida están definidas de acuerdo con los serotipos de Heddleston, que, a su vez, están basados en la respuesta de anticuerpos inducidos contra vacunas de P. multocida dirigidos primariamente contra los LPS y protegen al hospedero contra las cepas del mismo serotipo.17
La vacunación juega un papel importante en la prevención de esta enfermedad. Para la inmunización contra P. multocida se emplean bacterinas preparadas con hidróxido de aluminio o aceite mineral como adyuvante, preparadas de serotipos selectos. Por lo menos se requieren dos dosis administradas vía subcutánea o intramuscular con intervalo de dos semanas entre cada inmunización para la protección contra esta enfermedad.18
Material y métodos
Preparación del antígeno
Se utilizaron cuatro aislamientos denominados SD, UC, JO y MO de Pasteurella multocida obtenidos de casos clínicos de diferentes granjas avícolas de México y una cepa de referencia ATCC 1662 (A: 4). Los cuatro aislamientos y la cepa de referencia de P. multocida, se inocularon por separado en caldo infusión cerebro corazón,* adicionado con 5% de extracto de levadura.** El pH del medio se ajustó previamente a 7.2, y se incubaron a 37°C durante 24 h; posteriormente se realizaron pruebas de control de calidad, como: viabilidad, pureza y título de unidades formadoras de colonia (UFC). Se ajustó la concentración bacteriana de los cultivos a 5 × 109 UFC/mL, aproximadamente,19 y se inactivaron con formaldehído a 0.25% (v/v) para preparar tres diferentes tipos de antígeno: a) Antígeno de cultivo completo de P. multocida, en el que se utilizó el cultivo completo de la cepa después de ser incubado e inactivado; b) antígeno de cultivo completo de P. multocida lavado. Después de cultivar e inactivar la bacteria, se centrifugó a 3 776 g por 7 min y se realizaron tres lavados del concentrado bacteriano (pellet) con PBS pH 7.2; c) antígeno obtenido del sobrenadante del cultivo. Una vez inactivada la bacteria, se centrifugó a 3 776 g por 7 min y se tomó el sobrenadante.
Inmunización
Se emplearon 270 aves de la raza White Leghorn,*** de seis semanas de edad, libres de patógenos específicos (ALPES), clínicamente sanas. Todas las aves se identificaron en forma individual, se mantuvieron en adaptación durante siete días y se alojaron bajo condiciones de laboratorio, con agua y alimento ad libitum. Se formaron tres grupos de 90 aves cada uno de acuerdo con el inmunógeno empleado (sobrenadante, completo o lavado). Cada grupo quedó conformado por cinco tratamientos de acuerdo con la procedencia del aislado (SD, UC, JO, MO o A4). Quince aves se mantuvieron como testigos en cada uno de los grupos. Todas las aves se inmunizaron en la séptima y novena semanas de edad con 0.5 mL del inmunógeno preparado por vía subcutánea (excepto los testigos), en donde se utilizó 25% de hidróxido de aluminio****(v/v) como adyuvante.
]]>Desafío
Todas las aves se desafiaron por instilación nasal con 0.2 mL de un cultivo vivo de P. multocida (5×105 UFC/mL, aproximadamente)20 dos semanas después de la última vacunación. Se observaron durante una semana y se registró la mortalidad dentro de los grupos de aves.
Determinación de protección
Se empleó la prueba de ELISA indirecta para determinar el nivel de anticuerpos IgG en los grupos experimentales.
Preparación del antígeno para sensibilizar la placa de la prueba de ELISA
El paquete celular para la extracción de LPS crudo se preparó en medio de infusión cerebro corazón***** inoculado con la cepa de referencia ATCC1662 (A: 4). El cultivo se centrifugó a 8 496 g por 12 min y se lavó tres veces con PBS pH 7.2, posteriormente se resuspendió el pellet en 160 mL de NaCl† a 0.85% y se conservó en agitación durante 30 h a 4°C. La concentración de carbohidratos se determinó por el método de Dubois et al.,21 y se utilizó glucosa‡ como estándar.
]]> Prueba de ELISA (modificada por Alonso22)
Las microplacas con 96 pozos de poliestireno fueron sensibilizadas con 100 uL de antígeno P. multocida (40 ug/mL)19 en una solución fijadora de carbonatos (carbonato de sodio, 1.59 g; bicarbonato de sodio, 2.93 g; agua destilada, 1 000 mL; pH, 9.6). Las microplacas se incubaron toda la noche a 4°C. El sobrenadante de cada microplaca se eliminó y las placas se lavaron tres veces de forma manual con PBS pH 7.2 con 0.05% de Tween 20****** (v/v). Cuando las placas se secaron, se bloquearon con albúmina sérica bovina******* a 10% y se incubaron a 4°C toda la noche, posteriormente se lavaron y después de secarse se cubrieron con 100 μL de los sueros diluidos a probar de las aves inmunizadas 1:100 en PBS pH 7.2, y se incluyeron sueros positivos y negativos como testigos de placa. Las placas con el antisuero se incubaron toda la noche a 4°C.
Las microplacas se lavaron con PBS–Tween (0.05%) y se secaron. Posteriormente se adicionaron 100 μL (1:1 000) de conjugado anti IgG******** de gallina elaborado en ovino, marcadas con peroxidasa; las microplacas se incubaron a 37°C de 30 a 90 minutos.
Posteriormente se adicionaron 100 μL de ABTS†† (2,2'–Azino–bis,3–ethylbenzthiazoline–6–sulfonic acid) como sustrato para la peroxidasa, se incubaron durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente y se detuvo la reacción mediante la adición de 100 μL de SDS‡‡ (dodecil sulfato de sodio) a 10%. Después, las microplacas se leyeron con lector de ELISA° a 490 nm. Para encontrar la dilución de trabajo se llevó a cabo una titulación de los sueros negativos.23 Los resultados se expresaron como absorbancia (densidad óptica, DO) en la dilución trabajada a 490 nm.
Análisis de resultados de ELISA
Las lecturas en absorbancia (densidad óptica, DO) obtenidas mediante la prueba de ELISA se compararon con un diseño de bloques completamente al azar y un ANDEVA para evaluar el efecto del tratamiento. Para evaluar la diferencia de medias de las DO entre los grupos, se empleó la prueba de Tukey (P < 0.05).24
Resultados
Los sueros positivos que expresaron una densidad óptica mayor fueron aquellos en donde se utilizó como inmunógeno el antígeno lavado, aunque al realizar el análisis estadístico no se encontraron diferencias significativas (P > 0.05) entre las densidades ópticas de los sueros de las aves inmunizadas (Cuadro 1).
]]> La cepa de referencia ATCC 1662 (A: 4) fue la que produjo mayor respuesta (DO) con el sobrenadante del cultivo (0.276 ± 0.178), seguida de la respuesta producida por el aislamiento UC del antígeno lavado (0.221 ± 0.038) (Cuadro 1). Es importante mencionar que los niveles de anticuerpos obtenidos fueron compatibles con una baja respuesta de anticuerpos frente al antígeno.Las aves desafiadas con P. multocida (desafío homólogo) presentaron protección del 86% al 100% en los tres tipos de antígeno, con los cuatro aislados y la cepa de referencia con respecto al grupo testigo (Cuadro 2).
Discusión
En el presente trabajo se investigaron los niveles de anticuerpos y la protección inducida por la inmunización utilizando aislados de P. multocida de origen aviar, mediante inmunógenos preparados de antígeno completo, antígeno lavado y sobrenadante de cultivo administrados en forma parenteral en aves ligeras de la raza White Leghorn (SPF). Los niveles de anticuerpos fueron evaluados mediante la prueba de ELISA y la protección ante el desafío homólogo.
En el presente estudio se comprobó que el inmunógeno libre de células (sobrenadante) de diferentes aislados y cepa de referencia de P. multocida administrado en dichas aves, de 11 semanas de edad, es capaz de inducir una respuesta inmune efectiva ante el desafío con un cultivo vivo de P. multocida, posiblemente por la presencia de proteínas de alto peso molecular y de proteínas de membrana externa. En un estudio realizado por Boyce et al.,25 con P. multocida, se identificó que la bacteria tiene la capacidad de producir proteínas de membrana externa de alto peso molecular durante su crecimiento in vivo en hospederos, así como in vitro, y que puede estimular la respuesta inmune y conferir protección. Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, se piensa que en el sobrenadante existen elementos inmunogénicos.
Los resultados de este estudio también son similares a los de Uchida et al.,26 quienes informaron que un antígeno libre de células (sobrenadante) de P. multocida administrado en ratones, es suficiente para inducir una respuesta inmune y de protección ante el desafío.
Uno de los aspectos más importantes de P. multocida constituye su capacidad para producir proteínas toxigénicas y no toxigénicas; las infecciones causadas por el tipo A de P. multocida son responsables de producir el cólera aviar en las aves.27
Mena–Rojas et al.28 demostraron que Avibacterium paragallinarum secreta proteínas RTX de alto peso molecular durante el crecimiento en caldo infusión–cerebro–corazón, algunas de estas proteínas son reconocidas por el suero de pollos, y son importantes inmunógenos en el control de la coriza infecciosa aviar; por tanto, se infiere que P. multocida secreta este tipo de proteínas durante su crecimiento en caldo. En el presente trabajo, en el que se utilizó el sobrenadante de cultivo de P. multocida como antígeno, posiblemente se encuentran proteínas secretadas durante el crecimiento de esta bacteria, que estimulan al sistema inmune de las aves lo suficiente como para protegerlas ante el desafío.
Mukkur29 realizó un estudio en ratones en donde administró un cultivo completo de P. multocida inactivado con formol y adyuvado con hidróxido de aluminio, además de dos inmunizaciones y durante el desafío obtuvo 80% de protección. En el presente estudio se utilizaron dos aplicaciones del antígeno completo inactivado con formaldehído y adyuvado con hidróxido de aluminio, en el desafío se obtuvo 96% de protección. En ambos estudios se observó un porcentaje de protección alto.
]]> En el presente estudio el inmunógeno elaborado con antígeno lavado protegió en promedio 97.33%. Brown et al.30 prueban la efectividad de varias fracciones celulares lavadas de P. multocida (P–1 059) utilizadas como inmunógenos y demuestran que el filtrado de un cultivo, la pared celular y el citoplasma de P. multocida utilizados de manera individual y preparados con diferentes vehículos para su administración en pollos son capaces de conferir protección hasta de 77% con respecto a una bacterina comercial (66%). En el presente estudio se demuestra que el antígeno lavado de P. multocida es capaz de inducir 97.33% de protección en aves inmunizadas. Marshall et al.31 realizaron un estudio en donde evalúan la eficiencia de un inmunógeno de P. multocida, cepa 1 059, administrado en pavos, que protegió en 83% a estos últimos, en ambos estudios se utilizó hidróxido de aluminio como adyuvante; sin embargo, la diferencia en el porcentaje de protección en el presente trabajo puede deberse al poder antigénico de las cepas, así como a la edad de la inmunización.Jarvinen et al.27 estudiaron la respuesta inmune inducida por un extracto lavado de P. multocida aplicado de forma subcutánea en conejos, y concluyen que el extracto lavado confirió una protección parcial; es decir, solamente 50%. Es probable que en dicho inmunógeno se hayan perdido antigenos de superficie o fracciones inmunogénicas durante su preparación; por ende, la protección fue parcial. En el presente estudio se encontró que al administrarse el Ag lavado de P. multocida vía subcutánea en aves, indujo 97.33% de protección ante el desafío.
Avakian et al.32 evaluaron la inmunidad inducida por varias vacunas contra el cólera aviar y concluyen que las vacunas inactivadas confieren 86% de protección en aves de 42 semanas de edad; sin embargo, en el presente trabajo se demuestra que el inmunógeno elaborado a partir de un cultivo completo inactivado de P. multocida es capaz de proteger a pollas de 11 semanas de edad hasta en 96%.
Ganfield et al.33 estudiaron las propiedades inmunogénicas de un complejo purificado de lipopo–lisacáridos–proteína de P. multocida, la estudiaron y demostraron que un inmunógeno elaborado con un complejo purificado de lipopolisacáridos–proteína, administrado en ratones y pavos, protegió, en 70% a pavos y en 83% a ratones, después de realizar el desafío. En el presente estudio se administró un inmunógeno completo que protegió en 96% ante el desafío. De esta manera, es posible que los componentes contenidos en los inmunógenos formen complejos de lipopolisacáridos–proteína con propiedades inmunogénicas.
Los tres inmunógenos utilizados en este estudio proporcionan protección en niveles no significativamente diferentes. Al considerar lo anterior, se infiere que los tres tipos de inmunógenos elaborados probablemente contengan proteínas capsulares de alto peso molecular, capaces de inducir la producción de anticuerpos y la protección en aves de 11 semanas de edad, y que el sobrenadante de cultivo completo confirió mayor protección de acuerdo con la mortalidad observada.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Autónoma del Estado de México (UAEM) el financiamiento del proyecto de investigación "Utilización de inmunógenos de Pasteurella multocida administrado por vía nasal y parenteral en gallinas de postura comercial" con clave UAEM–1848/2004, así como al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt), de México, por la beca otorgada, también al Consejo Mexiquense de Ciencia y Tecnología (Comecyt) por otorgar el apoyo de beca–tesis para estudios de posgrado a Germán Guadarrama Cruz, y finalmente al Centro de Investigación en Salud Animal (Ciesa) y a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México (FMVZ–UAEM), por facilitar las instalaciones necesarias para la realización del presente trabajo.
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