Detección de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, por medio de PCR–anidada a partir de muestras de heces de ovinos

Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by nested–PCR of ovine fecal samples

Norma G. Jaimes* Marco Antonio Santillán Flores** Oscar A. Hernández Cruz* Dionisio Córdova López**Claudia Celic Guzmán Ruiz*** Beatriz Arellano Reynoso** Efrén Díaz Aparicio** Víctor R. Tenorio Gutiérrez** Alfredo Cuéllar Ordaz*

^*Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Facultad de Estudios Superiores–Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México, Km 2.5, Carretera Cuautitlán–Teoloyucan, San Sebastián Xhala, 54714, Cuautitlán Izcalli, Estado de México, México.

^**Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias–Microbiología, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, carretera México–Toluca, Km 15.5, CP 05110, Col. Palo Alto, México, D. F.

Correspondencia:
Marco Antonio Santillán Flores,
Tel.: (01) 36180005, extensión 49, Fax: 36180008.
correo electrónico: santillan.marco@inifap.gob.mx y mayco1768@yahoo.com.mx

Recibido el 28 de marzo de 2007
Aceptado el 20 de mayo de 2008.

Paratuberculosis is a chronic granulomatous enteritis caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map), which affects wild and domestic ruminants. Map is shed in feces from infected animals. Transmission of the infection takes place by oral ingestion of the bacterium from contaminated food and water with feces. With the objective to establish a paratuberculosis diagnosis in ovine by nested–PCR from fecal samples, 204 fecal and serum ovine samples were studied. Feces were evaluated by nested–PCR and bacterial culture, serum samples were analyzed by agar gel immunodiffusion (AGID). Nested–PCR yielded a 210 bp amplification product that corresponds to Map–IS900, in 61 out of 204 samples. From these, 43 were from AGID positive animals and 18 from negative animals. Seventeen Map strains were isolated by bacterial culture and AGID detected 91 positive animals. Nested–PCR allowed to detect, sooner, greater number of animals shedding bacillus, even when they had resulted negative to the serological test. This result is considered important because generally these animals, while remaining in the farm, constitute the main source of infection for the herd. Nested–PCR should be considered as an alternative, when a prompt result is required to know the health status of the herd with respect to paratuberculosis.

Key words: Bacterial Culture, Serological Study, Mycobacterium avium Subspecies paratuberculosis, Ovine, Nested–PCR.

Resumen

La paratuberculosis es una enteritis granulomatosa de curso crónico ocasionada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map), afecta a rumiantes domésticos y silvestres. Map es excretada en las heces de animales que desarrollan la enfermedad, y la transmisión de la infección se da mediante la ingestión de alimentos y agua contaminados por heces de animales infectados. Con el objetivo de establecer el diagnóstico de paratuberculosis en ovinos por medio de la PCR–anidada a partir de muestras de heces, se trabajaron 204 muestras de heces y sueros de ovinos; las heces se evaluaron por PCR–anidada y cultivo bacteriológico, las muestras de sueros fueron analizadas por medio de inmunodifusión en agar gel (lDGA). Con la PCR–anidada se obtuvo un producto de amplificación 210 pb que corresponde a la IS900 de Map, en 61 de las 204 muestras. De éstas, 43 eran de animales positivos a IDGA y 18 negativos. Mediante cultivo bacteriológico se aislaron 17 cepas de Map; en este contexto, la IDGA detectó a 91 animales como positivos. La PCR–anidada permitió detectar en menor tiempo a mayor cantidad de animales que estaban eliminando al bacilo, aun cuando habían resultado negativos a la prueba serológica; este resultado se considera importante, ya que generalmente estos animales, al permanecer dentro de la granja, constituyen la principal fuente de infección para el rebaño. Se debe considerar a la PCR–anidada como alternativa, cuando se requiera el diagnóstico en breve tiempo, para conocer el estado sanitario del rebaño con respecto a paratuberculosis.

Palabras clave: Cultivo Bacteriológico, Estudio Serológico, Mycobacterium avium Subespecie paratuberculosis, Ovinos, PCR–Anidada.

Introducción

La paratuberculosis (ptb) o enfermedad de Johne es una enteritis granulomatosa que afecta a los rumiantes domésticos y silvestres.^1,2 Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis es el agente etiológico, actualmente se encuentra clasificado dentro del complejo Mycobacterium avium–intracellulare (Mai) M. avium subespecie avium, M. avium subespecie silvaticum, M. avium subespecie paratuberculosis (Map), M. intracelullare.^3–5 La enfermedad es de curso crónico y se manifiesta principalmente en animales adultos de dos a tres años de edad; se caracteriza por pérdida progresiva de la condición corporal debido a que las lesiones que produce, localizadas en la mucosa del íleon, válvula ileocecal, ciego, colon proximal y linfonodos mesentéricos, desarrollan hipertrofia difusa de la mucosa del yeyuno e íleon, que adquireren una apariencia rugosa, lo que ocasiona mala absorción de los nutrimentos.⁴ El bacilo se excreta en las heces de animales enfermos. En condiciones de campo, la enfermedad se transmite por la ingestión de alimentos y agua contaminados por las heces de animales infectados, éstos son la principal fuente de infección para el rebaño.^4–8

Otra alternativa en el diagnóstico de la ptb es el uso de pruebas serológicas, como el ensayo inmunoenzimático (ELISA), y la inmunodifusión en Agar Gel (IDGA); una de las limitantes de estas pruebas es que detecta a los animales hasta que presentan la fase clínica de la enfermedad.^5–7 Con los avances en biología molecular, particularmente en el desarrollo de pruebas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se ofrece una alternativa sensible y específica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.^2,5–7

Respecto del diagnóstico de ptb por PCR, los iniciadores que más se han estudiado son los diseñados a partir de la secuencia nucleotídica llamada secuencia de inserción 900 (IS900), específica de Map.^1,2,5,9–13 Erume et al.¹ diseñaron una PCR–anidada a partir de la secuencia IS900, ésta se caracteriza por utilizar dos pares de iniciadores: el primero es diseñado con base en una región de la IS900, con él se obtiene un producto de amplificación mayor a 500 pares de bases (pb); el segundo fue diseñado de una región interna al producto amplificado, con él se obtiene un producto de amplificación más pequeño que el producto original, ello aumenta la sensibilidad y especificidad de la prueba. El objetivo del trabajo fue establecer el diagnóstico de paratuberculosis en ovinos mediante la PCR–anidada a partir de muestras de heces.

Material y métodos

Muestras

Se trabajaron 204 muestras de heces para el cultivo bacteriano y la PCR–anidada, y 204 sueros de los mismos ovinos, que fueron mayores de dos años, provenientes de explotaciones ubicadas en Guanajuato, Jalisco y Estado de México; las muestras de heces se tomaron directamente del recto de los animales. Los sueros fueron recolectados de la vena yugular con tubos Vacutainer* sin anticoagulante.

Diagnóstico serológico

Los sueros se evaluaron por duplicado mediante la prueba de inmunodifusión en agar gel con antígeno protoplasmático de Map (por sus siglas en inglés, PPA–M3**), las lecturas de la prueba se realizaron a las 24 y 48 horas.

Cultivo bacteriano

El cultivo bacteriológico se realizó mediante la técnica descrita por Payeur et al.,¹³ las muestras se inocularon por duplicado en el medio de cultivo Herrold con yema de huevo adicionado con y sin micobactina J** (2 mg/L) y anfotericina B*** (50 ug/mL), y se incubaron a 37°C durante 20 semanas. Se consideró aislamiento positivo a Map por tiempo de crecimiento y desarrollo de colonias bacterianas en medio de cultivo con micobactina y tinción Ziehl–Neelsen positiva.¹³

Obtención de ADN de heces

Obtención de células

La obtención del ADN de heces se llevó a cabo con la técnica descrita por Garrido et al ² Se tomaron 2 g de heces y se disolvieron durante 15 min en 40 mL de cloruro de N–cetylpiridinio*** (HCP) a 0.76%, se dejaron en reposo durante 18 horas, se tomaron 20 mL de la solución, se centrifugó durante 10 min a 300 g. A la pastilla obtenida se le realizaron tres lavados con 5 mL de solución amortiguadora de fosfatos (PBS). La pastilla fue transferida a microtubos y se centrifugó por 5 min a 14 000 g.

Lisis celular y extracción de ADN

La lisis celular se realizó con el método de enfriamiento–calentamiento.² La pastilla obtenida fue transferida a criotubos y resuspendida en 500 µL de TE– Tritón 100X (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8; tritón 50 mM). Las muestras se colocaron tres veces a –80°C en nitrógeno durante 5 min y en horno**** a 100°C por 5 min. Para la extracción de ADN se agregaron 450 µL de isotiocianato de guanidina*** (5M) y 250 µL de acetato de amonio*** (7.5 M pH 6.3), y se colocaron en hielo durante 15 min. Las muestras se transfi rieron a microtubos y se les adicionó en dos ocasiones 500 µL de cloroformo,*** –alcohol isoamílico (24:1), se centrifugó durante 5 min a 14 000 g, y a la fase acuosa obtenida se le agregaron 450 µL de isopropanol*** y se colocó a –20°C durante toda la noche. Se centrifugó durante 15 min a 14 000 g, se realizaron dos lavados con 1 mL de etanol a 70% y se centrifugó durante 5 min a 14 000 g, el ADN se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en 100 µL de agua miliQ.

PCR anidada

Se utilizaron los iniciadores*****descritos por Erume et al.,¹ ptb1 (5' TGA TCT GGA CAA TGA CGG TTA CGG A 3') y ptb4 (5'CGC GGC ACG GCT CTT GTT 3') con los que se obtiene un producto de amplificación de 563 pb; para la segunda reacción de PCR se usaron los iniciadores ptb2 (5' GCC GCG CTG CTG GAG TTA A 3') y ptb3 (5' AGC GTC TTT GGC GTC GGT CTT G 3'), con los que se obtuvo un producto de amplificación de 210 pb.

Para la primera reacción se utilizaron 3 µL (10 ng/ µL) de ADN proveniente de heces de ovinos, 5 µL de amortiguador de PCR (67 mM/µL), 3 µL MgCl2*** 2mM (30 mM/µL), 1 µL dNTP´s****** 200 mM c/u, 1 µL (25 pMol) de los iniciadores Ptb 1 y Ptb 4 y 0.2 µL (1 U) de ADN polimerasa*** termoestable (5 U/µL) y 35.8 µL de agua miliQ, en un volumen final de 50 µL. Las muestras se trabajaron en un termociclador******* con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95°C por 5 min, seguido de 35 ciclos a 95°C por 1 min, 65°C por 1 min y 72°C por 1 min, así como extensión final a 72°C por 5 min.

Para la segunda amplificación, 3 µL de la primera amplificación fueron transferidos a microtubos de PCR que contenían la misma cantidad y concentración de reactivos descritos anteriormente, excepto que los iniciadores Ptb1 y Ptb4 fueron sustituidos por los iniciadores Ptb2 y Ptb3. Se utilizó el mismo programa del termociclador.******* Se incluyó como testigo positivo el ADN de una cepa Map (ATCC 19698). Los productos de amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio.***

Resultados

Las muestras trabajadas procedían de rebaños en los que no se había realizado el diagnóstico de Ptb. En estas explotaciones se tenía como antecedente la presentación de casos de ovinos mayores de dos años con adelgazamiento crónico sin respuesta al tratamiento con antibióticos, hembras que después del parto adelgazaban y no recuperaban peso, además de que se observó aparición de edema submandibular sugerente de desnutrición, y heces pastosas en algunos animales. Los resultados de los animales que fueron positivos a las pruebas se muestran en los Cuadros 1 y 2.

Serología

Cultivo bacteriológico

Se obtuvieron 17 aislamientos de Map de 204 muestras analizadas. Se observó crecimiento de colonias bacterianas a partir de la quinta semana de incubación; únicamente en los medios que fueron adicionados con micobactina y con la tinción Ziehl–Neelsen se observaron bacilos ácido–alcohol resistentes (BAAR). Estos aislamientos correspondieron a 17/91 muestras de animales con serología positiva.

PCR–anidada

Se visualizó un producto de amplificación de 210 pb que corresponde a la IS900 de Map (Figura 1), en 61 de las 204 muestras evaluadas. De éstas, 43 correspondían a animales positivos a IDAG y 18 animales negativos a la serología (Cuadros 2 y 3).

Diversas técnicas diagnósticas se han desarrollado y evaluado con el propósito de lograr mejor identificación de los animales infectados con Ptb. Aquí se probaron muestras de heces de ovinos usando el cultivo bacteriológico, la PCR–anidada y la IDAG. De los 204 animales con los que se trabajó, 61 fueron positivos a PCR anidada, y con el cultivo bacteriológico se lograron aislar 17 cepas de Map. Este resultado coincide con lo descrito por Erume et al.¹ y Dimareli y Sarris,¹⁴ quienes detectaron mayor cantidad de animales positivos a Ptb a partir de heces, utilizando la PCR–anidada, y menor cantidad mediante el cultivo. El cultivo bacteriológico de heces es considerado como prueba confirmatoria para el diagnóstico de Ptb, pero presenta diversas limitantes, pues el procedimiento requiere de medios de cultivo enriquecidos con micobactina y ocho a 16 semanas de incubación como mínimo para obtener el aislamiento de Map.

Otro problema que se presenta con el cultivo a partir de heces es la contaminación de la muestra con otros microorganismos, así como la dificultad con la que crecen las cepas de origen ovino,^5–8,15 por ello fueron pocos los ovinos detectados con este método (Cuadros 1 y 2), además de requerir de por lo menos 103 bacilos por mL de muestra procesada para asegurar el crecimiento,^16–19 por lo que su sensibilidad puede llegar a 25.4%.¹⁴ La PCR–anidada es capaz de detectar bacterias viables y no viables, lo cual se hizo evidente en el trabajo, ya que se lograron detectar 43/91 (47.25%) animales con serología positiva y 18/113 (15.9%) fueron negativos a IDAG, mientras que con el cultivo bacteriano sólo se obtuvieron 17/204 (8.33%) aislamientos; este resultado se atribuye a que con la bacteriología solamente se detectaron las bacterias viables capaces de desarrollarse en el medio de cultivo. A lo anterior se debe añadir el hecho de que los resultados con la PCR–anidada se pueden obtener en tres o cuatro días,^{1–3,5,6,11–26} lo que representa ventaja de tiempo en comparación con el aislamiento bacteriológico.

El diagnóstico serológico de ptb en ovinos se realiza con la prueba IDAG, con sensibilidad que puede variar de 70% a 80% y especificidad de 100%.^6,21,22,24 La IDAG tiene la ventaja de ser sencilla y rápida para probar rebaños completos, por lo que en este trabajo constituyó la prueba utilizada para determinar la presencia de anticuerpos contra Map, en la que 44.6% (91/204) de los animales evaluados resultaron positivos a la IDAG. El 47.25% (43/91) de los animales resultaron positivos a IDGA y a PCR–anidada, y sólo en 17/91 (18.68%) se logró aislamiento de Map (Cuadro 2). Estos datos reflejan que los ovinos, además de presentar anticuerpos detectables por IDAG, al mismo tiempo estaban eliminando el bacilo en heces; debido a que la presencia y cantidad de anticuerpos contra los antígenos de Map están directamente relacionados con el número de bacterias presentes y con su eliminación.^1,2,6,10

También se considera que la excreción del bacilo es de forma intermitente, así como existen animales que eliminan grandes cantidades de bacilos por heces, otros animales son excretores esporádicos,^20,27–29 por lo que 52.75% (48/91) de los ovinos positivos a serología, que resultaron negativos a PCR–anidada (Cuadro 2), podrían ser excretores esporádicos de la bacteria, por tal razón, al momento de la toma de la muestra no se encontraban excretando el microorganismo, o lo hacían en baja cantidad.^2,7,21,23

Respecto del 15.9% (18/113) de los ovinos que resultaron positivos a la PCR–anidada y que no fueron detectados por la IDAG (Cuadro 2), se considera que pudo deberse a la falta de anticuerpos detectables, ya que las pruebas de inmunodifusión en agar necesitan la presencia de gran cantidad de anticuerpos para expresar la precipitación en el gel. En ocasiones, los animales negativos a inmunodifusión pueden resultar positivos a PCR o al cultivo bacteriológico, debido a que en estos animales la respuesta inmune humoral disminuye cuando la respuesta celular aumenta; esto sucede en la etapa subclínica de la infección. Otra razón por la cual la producción de anticuerpos resulta afectada es la pérdida de respuesta inmune ante la infección; esta actividad supresora, llamada anergia, se presenta cuando los animales son viejos o la infección está en su etapa final. Sin embargo, se considera que tales animales pueden estar eliminando el bacilo y no son detectados con el diagnóstico serológico.^21,24,29

Se sabe que cuando se utiliza una prueba de PCR con ADN obtenido de cepas bacterianas puras, la sensibilidad es de 100%, pero al utilizar ADN de muestras biológicas, en este caso heces, la sensibilidad puede verse reducida por la presencia de inhibidores, como las células epiteliales, la sangre, las sales biliares, componentes de vegetales y los carbohidratos complejos, cuya remoción aún representa el mayor reto para mejorar la sensibilidad.^{1,2,5–7,14,17,20–27}

Un punto que se considera importante para el diagnóstico por la PCR a partir de heces, es obtener ADN libre de inhibidores de la reacción, por lo que se han evaluado diversas técnicas de extracción con enzimas y paquetes comerciales,^5,6,12,26,27 que si bien presentan ventajas para obtener ADN de buena calidad, el costo por muestra es alto. La técnica de extracción utilizada en este trabajo (Garrido et al.)² se puede considerar como técnica de bajo costo por muestra y fácil de adaptar y aplicar en el laboratorio, donde la primera parte consiste en concentrar las células y romperlas mediante un método físico, para luego extraer y purificar el material genético por medio de un método químico.

Lo anterior permitió obtener ADN de buena calidad para ser empleado en la PCR–anidada, con lo que se logró identificar a 61 animales que estaban eliminando el bacilo por heces. Los resultados confirman que el diagnóstico de ptb por medio de PCR–anidada se debe considerar como alternativa de utilidad cuando se requiere de un diagnóstico rápido, que servirá para conocer el estado sanitario del rebaño, ello es útil cuando se instrumenta un programa de control de la enfermedad dentro del hato; también es adecuado antes de introducir nuevos animales a una explotación en la que representan un riesgo sanitario. La prueba de PCR utilizada en este estudio permite detectar animales que excretan el bacilo por heces y que, al resultar negativos a la prueba serológica, permanecerían dentro de la granja, convirtiéndose en la principal fuente de infección para el rebaño.

Para fines de control de la enfermedad en los rebaños, será conveniente realizar el diagnóstico por lo menos con dos técnicas, una prueba serológica como la IDGA y otra prueba que detecte a Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en las heces, como la PCR–anidada, de esta forma se identificará más eficientemente a los animales con paratuberculosis.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por Fondos Sectoriales del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, de México, así como por la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Alimentación y Pesca, con clave 2003–002–140.

Se agradece al Dr. Manuel Delgado Estrella, al MVZ Fernando Miranda y a los técnicos de los grupos GGAVATTS–ovinos de Guanajuato, las facilidades que proporcionaron para la toma de muestras en los rebaños.

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Notas

*Becton Dickinson, Estados Unidos de América.

**Allied Monitor Inc., Estados Unidos de América.

***Sigma Chemical Co., Estados Unidos de América.

*****Accsesolab, S.A. de C.V., México.

******Gibco BRL Co., Estados Unidos de América.

*******PCR Sprint1, Termo Electron, Co., Estados Unidos de América.