CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA
LOURDES MARÍA BARRERA RAMÍREZ
Departamento de Biología Molecular. INER.
MA. ELISA DRAGO SERRANO
JULIA PÉREZ RAMOS
Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Xochimilco.
FABIOLA GÓMEZ ARROYO
Departamento de Microbiología e Inmunología. Facultad de Veterinaria, UNAM.
TERESITA DEL ROSARIO SAINZ ESPUÑES
Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Xochimilco.
FELIPE MENDOZA PÉREZ
Departamento de Biología Molecular. INER.
Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Xochimilco
Correspondencia:
M en C. Felipe Mendoza Pérez,
Jefe del Laboratorio de Inmunoquímica.
Departemento de Biología Molecular. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
Calzada de Tlalpan 4502, colonia Sección XVI. México, D.F. 14080.
Teléfono: 5666-4539, extensión 270,
Fax: 5665-4623.
Email: femendo@yahoo.com
Trabajo recibido: 17-II-2004; ]]> Aceptado: 26-III-2004
RESUMEN
La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. Una de las características analíticas más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad de medir múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad y, por supuesto, cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un fluorocromo. Las aplicaciones más relevantes de la citometría de flujo en la práctica médica se relacionan con la hematología e inmunología clínicas, midiendo parámetros como número y clasificación de células sanguíneas. Esta técnica es empleada también en el conteo de subpoblaciones de linfocitos en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de leucemias agudas y síndromes linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos. En los últimos 20 años, el análisis de enfermedades pulmonares de origen inmunológico por citometría de flujo ha jugado un papel importante en el entendimiento y diagnóstico de enfermedades como sarcoidosis, neumonía eosinofílica o neumonitis por hipersensibilidad. Las aplicaciones de la citometría de flujo son numerosas, lo cual ha permitido el empleo de estos instrumentos de manera amplia en los campos, tanto de la investigación biológica como médica. Esta revisión brinda un panorama general de los principios básicos de la citometría de flujo y la muestra como una herramienta reproducible y aplicable a una gran variedad de campos médicos, así como su empleo en el campo de las enfermedades pulmonares.
PALABRAS CLAVE: Citometría de flujo, inmunofenotipificación, lavado bronquioalveolar, enfermedades pulmonares, VIH.
ABSTRACT
Flow cytometry is an analytical method that allows the rapid measurement of certain physical and chemical characteristics of cells or particles suspended in liquid and produce signals when they pass individually through a beam of light. An important analytical feature of flow cytometers is their ability to measure multiple cellular parameters such as cell size, shape and internal complexity and, of course any cell component or function that can be detected by a fluorescent dye. The most prominent uses of flow cytometry in medical practice are in the related fields of laboratory hematology and clinical immunology, for a variety of tasks involving blood cell counting and classification. This technique is also used for counting lymphocyte subpopulations in patients with HIV, characterization of acute leukemias and chronic lymphomas between other diseases. Over the last 20 years, analysis of immunologica lung diseases by flow cytometry has played a major role in the understanding and as tool of diagnosis, such as sarcoidosis, eosinophilic pneumonia or hypersensitivity pneumonitis. So the applications of flow cytometry are numerous, and this has lead to the widespread use of this instruments in biological research and medical fields. Overall this review shows a brief overview of basic principles of and shows this as a reproducible tool applicable to a wide range of medical approaches as well as its use in lung diseases field.
KEY WORDS: Flow cytometry, immunophenotyping, bronchoalveolar lavage, lung diseases, HIV.
INTRODUCCIÓN
]]> En los últimos años, el diagnóstico clínico ha experimentado profundas modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los nuevos métodos cuantitativos de análisis celular. De entre ellos destaca la citometría de flujo, que ha alcanzado gran relevancia, además de la que ya tenía en la investigación básica.La citometría constituye un complemento valioso de las técnicas clásicas utilizadas para el estudio de la morfología, biología y bioquímica celular. Aunque, desde el punto de vista cronológico, la citometría de flujo es una tecnología relativamente reciente, sus características especiales como técnica de análisis celular han hecho que en la última década su uso se haya extendido de forma rápida, desde los laboratorios de investigación básica hasta los laboratorios clínicos 1.
La citometría de flujo ha encontrado amplia utilidad en ciencias como la inmunología, hematología, oncología, anatomía patológica y biología celular 2 . La conjugación de marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o policlonales ha hecho posible los estudios de la densidad y la distribución de determinantes y receptores de la superficie y del citoplasma celular, permitiendo identificar subpoblaciones celulares 3.
Por otra parte, en comparación con los métodos bioquímicos de análisis celular, en los que se obtiene un resultado promedio para toda la muestra, la citometría de flujo es capaz de proporcionar una información cuantitativa sobre cada célula en particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están escasamente representadas.
¿QUÉ ES LA CITOMETRÍA DE FLUJO?
La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión.
El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora (Figura 1) 4.
Figura 1. Principio general de la citometría de flujo
]]> CONCEPTOS SOBRE INMUNOFLUORESCENCIA
El término inmunofluorescencia se usa para describir las técnicas en que se emplea un fluorocromo para marcar un anticuerpo. Ya en 1941, Coons 5 informó de la aplicación de esta técnica para localizar antígenos y anticuerpos en secciones de tejido. El descubrimiento de los anticuerpos monoclonales por Kohler y Milstein en 1975 6 , incrementó dramáticamente el uso de la inmunofluorescencia para la identificación de antígenos de superficie celular.
La fluorescencia ha sido usada para visualizar ciertas moléculas y estructuras por medio de la microscopia óptica durante muchos años. Esta ha encontrado una extensa área de aplicación en la citometría de flujo. La capacidad para detectar simultáneamente la fluorescencia de dos, tres, cuatro o actualmente hasta 13 fluorocromos de diferentes longitudes de onda, abre completamente el campo del análisis multiparamétrico.
Cuando una molécula absorbe luz, y por tanto energía, algunos de sus electrones pueden alcanzar una órbita de mayor energía. Se dice entonces que la molécula ha alcanzado un estado de excitación, y puede volver a su estado basal cuando estos electrones vuelven a su órbita de menor energía. En algunos compuestos el electrón excitado cae rápidamente, usualmente en nanosegundos, al estado basal, emitiendo un cuanto de luz o fotón y desprendiendo energía. Esta transición radiante se denomina fluorescencia 7 . A este tipo de compuestos se les denomina fluorescentes o fluorocromos.
El objetivo del análisis por inmunofluorescencia en citometría de flujo es asignar a cada célula a un grupo específico de células que compartan propiedades comunes. El primer paso es identificar las células de interés. Por ejemplo, para el análisis de subpoblaciones linfocitarias se requiere seleccionar un área de trabajo distinguiendo los leucocitos por sus propiedades de dispersión de luz (tamaño contra complejidad celular). Una vez que las células de interés han sido distinguidas de los otros tipos celulares, se puede usar la inmunofluorescencia para determinar la proporción o el número de células que poseen un determinado marcador, por ejemplo, del marcador CD4 para monitorear el progreso de la enfermedad por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 8 , entre muchas otras aplicaciones clínicas.
PARÁMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos se dividen en (Figura 2):
Figura2. Parámetros medibles por citometría de flujo
]]>En la Tabla I se resumen los parámetros que pueden ser medidos por medio de esta técnica. Un aspecto importante y que representa una ventaja de ella, es la posibilidad de medir tantos parámetros como anticuerpos se dispongan para ello, marcados con distintos fluorocromos. Así, es posible caracterizar una célula por su fenotipo de superficie (Figura 3) y, al mismo tiempo, conocer el estado intracelular que guarda la célula como su patrón de secreción de citocinas, o bien, la etapa del ciclo celular en la que se encuentra.
Figura 3. Procedimiento regular de marcaje o tinción fenotípica para células humanas
]]>
Tabla I. Parámetros que se pueden analizar por citometría de flujo.
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
Inmunofenotipificación
La citometría de flujo es una técnica que permite un análisis celular multiparamétrico de forma rápida, sensible y específica. La disponibilidad de amplios paneles de reactivos de gran calidad facilita la aplicación de este método analítico en el diagnóstico, clasificación, evaluación pronóstica y valoración de enfermedad mínima residual. La citometría de flujo permite el análisis de un gran número de células (habitualmente entre 10,000 células por muestra y, más de un millón en los estudios de enfermedad mínima residual). La aplicación de la citometría de flujo al análisis celular permite conocer aspectos físicos de la célula (tamaño y complejidad) y determinar la presencia o ausencia de determinados antígenos (habitualmente entre 3 y 4) en los diferentes compartimentos celulares (superficie celular, citoplasma, mitocondria y núcleo) lo que contribuye a aumentar, tanto la especificidad como la sensibilidad de la prueba. En otras áreas como en el diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiencias primarias, en el monitoreo de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple 9 , el lupus eritematoso sistémico 10 y la artritis reumatoide 11 , la citometría de flujo ha demostrado su utilidad. También se ha demostrado útil en el seguimiento de la recuperación inmune tras el trasplante de médula ósea 12 , en la identificación precoz del rechazo en pacientes que han recibido un trasplante alogénico 13 , o en el monitoreo terapéutico de los enfermos con anemia aplásica 14 . En la Tabla II se condensan algunas de las aplicaciones clínicas más importantes y con mayor empleo en la actualidad.
Tabla II. Aplicaciones clínicas generales de la citometría de flujo.
APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA INVESTIGACIÓN BÁSICA
Son innumerables las aplicaciones de la citometría de flujo a la investigación básica, desde campos como la microbiología, hematología, inmunología, citología, patología, biología celular y molecular, entre otros. Sin embargo, es posible intentar clasificar dichas aplicaciones según el área específica en la que es posible utilizar la citometría de flujo como herramienta de investigación (Tabla III). La citometría de flujo ha sido utilizada en el monitoreo del contenido de ADN 15 , expresión fenotípica, transporte de drogas, flujo de calcio 16 , proliferación y apoptosis 17 . Virtualmente es posible marcar cualquier molécula que sea de interés siempre que se disponga de un anticuerpo acoplado a un fluorocromo que pueda ser detectado por el citómetro de flujo, esto hace posible que las aplicaciones del citómetro de flujo se adapten prácticamente a cualquier necesidad de investigación. Actualmente, la relación entre la aplicación básica y clínica es cada vez más estrecha dando la oportunidad a su vez a la aplicación diagnóstica, pronóstica y de tratamiento en múltiples enfermedades.
Tabla III. Aplicaciones generales de la citometría de flujo a la investigación básica
CITOMETRÍA DE FLUJO Y LA INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES PULMONARES
]]> En los últimos 20 años, la citometría de flujo ha jugado un papel primordial en el avance del entendimiento y habilidad para diagnosticar una variedad de desórdenes linfoproliferativos 18 . Una de las aplicaciones nuevas más interesantes es en la evaluación de pacientes con enfermedades inmunológicas del pulmón 19 . Una muestra típica es aquella que es recolectada a partir de lavados bronquioalveolares (LBA), cuya utilidad diagnóstica ha quedado ampliamente demostrada 20-25 . Cuando el lavado es realizado en pulmones normales, la célula presente más predominante es el macrófago, el cual está en un porcentaje de aproximadamente 90% o más de celularidad. Los linfocitos usualmente representan menos del 10% de la población celular, los granulocitos representan la población celular minoritaria con el 1-2%26. En fumadores, el porcentaje de linfocitos es aún menor 27 . En muchos pacientes con enfermedades pulmonares inmunológicas, el LBA puede estar acompañado por un incremento en linfocitos o eosinófilos. Cuando las células que están incrementadas son los linfocitos, resulta importante saber qué subpoblación se encuentra elevada. La citometría de flujo es ideal para esta evaluación. La proporción relativa de linfocitos, macrófagos y granulocitos se determina fácilmente a partir de gráficas de tamaño (Forward scatter FSC) contra complejidad celular (Side scatter SSC). Los estudios de fluorescencia empleando diferentes fluorocromos permiten determinar fácilmente la composición de subconjuntos de linfocitos (CD4+ y CD8+). De esta manera, es posible ensayar hasta siete colores, con citómetros modernos, que representan siete marcadores diferentes sobre poblaciones celulares, requiriéndose sólo una pequeña cantidad de muestra (250,000 células en 50uL) a partir de un LBA.Por ejemplo, un incremento en el número de células inflamatorias en un LBA sugiere una alveolitis 28 . El tipo de células en el lavado puede correlacionar con el tipo de inflamación visto en las paredes alveolares de la biopsia. Aunque esas correlaciones no son diagnósticas, pueden ayudar en el diagnóstico cuando son combinadas con otros datos.
En otro ejemplo, un número elevado de eosinófilos sugiere una neumonía eosinofílica 29 , asma 30,31 , toxicidad por drogas o aspergiliosis broncopulmonar alérgica. Los números más altos de cuentas de eosinófilos son vistas en una neumonía eosinofílica. Esos pacientes tienen típicamente también un incremento moderado de linfocitos con células plasmáticas ocasionales. El cuadro típico del lavado insertado en el contexto clínico adecuado es altamente sugerente de neumonía eosinofílica y podría evitar que al paciente se le practicara una biopsia a cielo abierto. La linfocitosis en un LBA se puede asociar con varias enfermedades pulmonares inflamatorias. La distribución relativa de subpoblaciones de células T puede suministrar información adicional útil. Un número elevado de linfocitos T CD4+ da como resultado que la relación CD4/CD8 sea mayor que uno, y esto es visto en pacientes con sarcoidosis 32 y otras enfermedades que producen granulomas, entre las que se encuentran la tuberculosis 33 , asbestosis 34 y artritis reumatoide 35 . En general, una enfermedad pulmonar activa está asociada con una relación CD4/CD8 elevada. Aproximadamente un 90% de los pacientes con sarcoidosis tienen una alveolitis linfocitaria. En el caso de la sarcoidosis, aproximadamente el 60% de los pacientes tienen una relación CD4/CD8 mayor de 3.5. Para relaciones CD4/CD8 mayores de 5 y cercanas a 10 la especificidad de un diagnóstico de sarcoidosis es mayor 36 . Es característico de la alveolitis alérgica extrínseca un incremento importante en la proporción de linfocitos, siendo ésta de al menos el 50% del total de las células presentes en el LBA 37,38 . En algunos casos los neutrófilos y eosinófilos pueden verse incrementados. Dicha linfocitosis es predominantemente CD8 (+) dando como resultado una disminución de la relación CD4/CD8 39 . Los trabajos publicados al respecto son contradictorios 40-43 y en nuestro laboratorio hemos observado que pacientes alveolíticos a diferentes etapas de la enfermedad (subagudos y crónicos), muestran diferentes relaciones de CD4/CD8 (datos no publicados). Las células NK pueden también estar presentes y se observa asimismo evidencia clara de activación de células T por medio de marcadores como CD69 y HLA-DR 44-46 . En este mismo sentido, cabe aclarar que la evaluación de las muestras de LBA de los diferentes tipos de alveolitis no permite distinguir entre los diferentes cuadros clínicos, pero puede ayudar a excluir otros. Las aplicaciones en el área de las enfermedades pulmonares de origen inmunológico se extienden aún más, se ha estudiado con el auxilio de la citometría de flujo el papel que juegan ciertas citocinas en enfermedades como neumonitis por hipersensibilidad 47 . O la expresión de ciertos receptores de quimiocinas y sus ligandos asociados con algunos padecimientos como rechazo a trasplantes pulmonares 48 , asma 49 , alveolitis 50 o sarcoidosis 51 , así como la incidencia y función de las células NK 52,53 en estas mismas enfermedades intersticiales. Asimismo, la prevalencia de las subpoblaciones de linfocitos T gamma-delta ha mostrado ser importante para algunas enfermedades como la sarcoidosis 54 , neumonitis por hipersensibilidad 55 o fibrosis pulmonar idiopática 56.
Actualmente, están en proceso protocolos de investigación en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER) que contemplan la determinación de un amplio perfil fenotípico que proporciona información fundamental sobre el estado celular de la neumonitis por hipersensibilidad inducida por antígeno aviario, la de mayor incidencia en México, en sus diversas etapas clínicas, así como en la fibrosis pulmonar idiopática. Mediante esta técnica hemos realizado también mediciones de carácter funcional sobre la actividad celular, como detección intracelular y secreción de citocinas (datos no publicados). La caracterización de estas enfermedades intersticiales en México, permitirá visualizar los mecanismos inmunes que se establecen y que como consecuencia determinan los distintos estados de dichas enfermedades pulmonares.
CITOMETRÍA DE FLUJO Y VIH
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y los linfocitos CD8+ aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología 57 . En la actualidad, representa una técnica de rutina en muchos laboratorios, ante la necesidad de establecer controles periódicos del número de células CD4+ en estos pacientes 58 . El antígeno CD4 es el receptor para el VIH. Cuando éste infecta humanos, las células que con más frecuencia infecta son las CD4+, que se multiplican para combatir infecciones y producir más copias del VIH. El número absoluto de linfocitos T CD4+ es el parámetro celular asociado más estrechamente a la progresión de la enfermedad causada por el VIH y al pronóstico del paciente 59 . La relación entre los linfocitos T CD4+ y CD8+ (CD4/CD8), se conoce como la relación cooperador/supresor. En personas sanas esta relación se encuentra entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay una a dos células CD4 por cada célula CD8 60 . A partir de 1992, en los países desarrollados, se ha establecido una serie de lineamientos para la realización correcta del conteo de células CD4/CD8. Se propone el uso de citometría de flujo y un panel de 12 anticuerpos monoclonales combinados: CD45/CD14 (para enmarcar una ventana); CD3/CD4 (para medir linfocitos T cooperadores); CD3/CD8 (para medir linfocitos T supresores); CD3/CD19 (para separar la población de linfocitos T y B); CD3/CD56 (para separar las células NK); y, el control de anticuerpos de isotipo. Asimismo, en México se han publicado trabajos donde se sugiere la conveniencia de utilizar un panel semejante para el conteo de células CD4+, considerando un mínimo de seis anticuerpos 61 . En el INER, el SIDA es la principal causa de mortalidad hospitalaria en personas de 18 a 45 años de edad y ocupa, desde hace varios años, una de las cinco primeras causas de mortalidad general de los pacientes hospitalizados. Desde hace cinco años la citometría de flujo se utiliza en el INER para realizar el conteo de linfocitos T, tanto en los pacientes internados en el hospital como a los que se presta este servicio de manera extrahospitalaria como seguimiento de la enfermedad (Figura 4). Se atienden un promedio de 300 pacientes mensuales, lo cual muestra la importancia clínica, tanto diagnóstica como pronóstica que la citometría de flujo tiene en este renglón dentro del INER.
Figura 4. Estudio de conteo total de linfocitos T CD4/CD8 en un paciente con VIH
en estado temprano de la infección (A) con una cuenta de linfocitos T CD4+ de 17% y en estado tardío,
(B) con una cuenta de linfocitos T CD4+ de 3%. Estudio de rutina realizado en el laboratorio de VIH del INER.
LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA VANGUARDIA EN EL INER: FACSAria
Actualmente se cuenta ya con el citómetro de flujo que ha revolucionado la era moderna de la citometría, el FACSAria de Beckton Dickinson. Gracias a la fundación Gonzalo Río Arronte, IAP, el INER adquirió el primer FACSAria que llega a nuestro país y, el primero también en América Latina y que se pone al servicio del Instituto en el área de investigación básica. Se trata de un separador celular de alta velocidad y desempeño, capaz de medir hasta 11 parámetros de manera simultánea. Este instrumento cuenta con alineación automática de láser y una nueva plataforma de análisis en sistema Windows. Cuenta con un sistema de limpieza automático entre muestras, así como limpieza general del instrumento. Gracias a su sistema totalmente digital es capaz de adquirir 70,000 eventos (células o partículas) por segundo y es posible separar 25,000 células con una pureza al menos del 98%.
Las aplicaciones en investigación básica del FACSAria son innumerables, van desde la caracterización fenotípica de siete colores, hasta análisis de parámetros intracelulares, análisis de cromosomas, organelos celulares, apoptosis, estudios funcionales, así como separación celular altamente específica con fines de clonación. Así, el INER se encuentra ya a la vanguardia en citometría de flujo a nivel mundial y con la capacidad científica para desarrollar investigación básica en enfermedades pulmonares con calidad internacional.
Agradecimientos
A la química Edna Hannia Rodríguez Aguirre por facilitarnos la imagen característica de un paciente con VIH en estado avanzado y tardío tratado en el INER.
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