Detección de Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis en el tomate del estado de Sonora, México

Detection of Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis in tomato of the state of Sonora, Mexico

Jesús Borboa Flores^1*, Edgar O. Rueda Puente¹, Evelia Acedo Félix², Juan F. Ponce³, Manuel Cruz³, Onécimo Grimaldo Juárez³ y Adrián M. García Ortega⁴

¹ Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos, Universidad de Sonora. Blvd. Luis Encinas y Rosales s/n, Col. Centro. 8300, Hermosillo, Sonora, México. * Autor para correspondencia (jborboa@guayacan.uson.mx)

³ Instituto de Ciencias Agrícolas. Carr. a Delta s/n. 21705, Ejido Nuevo León, Baja California, México.

⁴ Laboratorio de Biología Molecular, Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Baja California. Km 1.5 Carr. a San Felipe s/n, Col. Xochimilco. 21380, Mexicali, Baja California, México.

Recibido: 29 de Julio del 2008.
Aceptado: 12 de Octubre del 2009.

Resumen

El cancro bacteriano causado por Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis (Cmm) es una de las principales limitantes en la producción de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) en el mundo. En México la producción de tomate ocupa 73 % de la producción de hortalizas. En el noroeste de México, específicamente en el Estado de Sonora, su producción se ha visto afectada por la aparición de enfermedades que causan pérdidas hasta de 100 %. El objetivo del presente trabajo consistió en la detección Cmm en tomate en el Estado de Sonora. Se muestreó semilla, hoja, tallo y fruto en nueve localidades del estado, ya sea en invernadero, casa sombra o campo a cielo abierto, previa inspección de surcos a pasos equidistantes, de acuerdo con las dimensiones de los cultivos. Se comprobó la presencia de Cmm mediante la prueba ELISA, cultivo en medio YDC y NBY, e identificación de colonias por medio de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR). Con PCR se aisló un fragmento de 279 pb del espaciador intergénico (16S-23S), del operón ribosómico específico de la subespecie michiganensis, y se secuenció un fragmento de aproximadamente 480 pb del ARNr 16S, el cual mostró una homología de 99 % con las secuencias de Cmm de las bases de datos públicas. La presencia de la bacteria en tomate representa un riesgo para los productores por lo que es necesario se realicen pruebas de diagnóstico en semillas de importación, para evitar su entrada al país.

Palabras clave: Lycopersicon esculentum, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Abstract

Bacterial canker caused by Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis (Cmm) is one of the major limitations of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) production in the world. In México the tomato production represents 73 % of the vegetable production. Northwestern México, specifically the State of Sonora, has been affected by diseases that have caused losses of up to 100 %. The objective of this study was to detect Cmm in tomato in the State of Sonora, México. Seed, leaves, stems and fruits were collected in nine localities of the state, either in greenhouses, shade houses or opencast fields. Cmm was detected through ELISA, by culture in YDC and NBY, followed by identification of colonies by biochemical tests and by PCR. A 279 bp fragment of the intergenic spacer (16S-23S) specific of the ribosomal operon of Cmm was amplified. Another fragment of approximately 480 bp of 16S rRNA was amplified and sequenced, which showed a 99 % homology with sequences of Cmm from public databases. The presence of the bacteria in tomato represents a risk for tomato producers. Therefore, it is necessary to carry out tests on imported seeds, to prevent its introduction to the country.

Key words: Lycopersicun esculentum, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

INTRODUCCIÓN

En México la horticultura es una actividad agrícola de importancia tanto en el plano social como en el económico, por la captación de divisas y la generación de empleos (Sandoval, 2004). Entre los factores limitantes para la producción de hortalizas se encuentran la enfermedades causadas por hongos como Alternaría dauci f. solana (Fritz et al., 2006), Botrytis cinerea (Cotora y Silva, 2005), Fluvia fulva (Pierre et al., 1985), Laveillula taurina (Kasselaki et al., 2006); entre las bacterias fitopatógenas están Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Hadas et al., 2005; Cooksey, 1990), Pseudomonas syringe pv. tomato (Boch et al., 2002), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (OEPP/EPPO, 1992) y Pseudomonas corrugata (Nico et al., 2006); además, hay enfermedades causadas por fitoplasmas (Gungoosingh-Bunwaree et al., 2007), virus (Amari et al., 2008) y nematodos (Cadet y Thioulouse, 1998). Tales enfermedades provocan grandes pérdidas económicas (Polston y Anderson, 1997).

Los problemas fitosanitarios se han acrecentado debido, en parte, a la falta de un diagnóstico certero y oportuno que permita a los productores manejar apropiadamente el impacto de las enfermedades. Tradicionalmente, la observación de síntomas por el técnico de campo o el propio productor ha sido la estrategia para diagnosticar y tratar las enfermedades, lo cual no es lo más apropiado ya que diferentes patógenos pueden provocar enfermedades con sintomatología similar, o bien ésta puede deberse a la conjunción de un patógeno con algún factor biótico, como toxicidad de agroquímicos o deficiencia/exceso de ciertos minerales del suelo. Es decir, el diagnóstico correcto del agente causal del problema es clave para el manejo integrado de enfermedades (Sandoval, 2004).

Un diagnóstico preciso requiere del auxilio de técnicas bioquímicas, microbiológicas y moleculares (Barnes, 1994). El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es afectado por el cancro bacteriano (OEPP/EPPO, 2005), el cual se encuentra en todas las zonas productoras de tomate del mundo y se considera una enfermedad poco frecuente pero severa y de gran importancia económica (Chang et al., 1991). El agente causal de esta enfermedad fue conocido hasta 1983 como Corynebacterium michiganensis, pero actualmente se clasifica como Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis (Cmm) (Gleason et al., 1993). Esta bacteria en un bacilo Gram positivo, no móvil, aeróbico, productor de cápsula, que en agar nutritivo desarrolla colonias de color amarillo claro a naranja, mucoide, cuya temperatura óptima de crecimiento in vitro es de 25 a 28 °C (Schaad et al., 2000; Jones et al., 2001).

La bacteria se transmite por semilla infectada y posteriormente penetra a los tejidos vasculares a través de heridas, estomas, tricomas e hidátides de la hoja (Gleason et al., 1993). El marchitamiento marginal de foliolos es uno de los primeros síntomas en plantas de todas las edades. Posteriormente aparecen estrías necróticas que se extienden desde la parte inferior del peciolo hasta el punto que se une con el tallo, ya que la bacteria es un invasor sistémico de tejidos del floema, médula y corteza. Finalmente la planta se necrosa y se marchita, y es característico que los bordes de foliolos inferiores aparezcan secos y curvados hacia abajo, y que luego adquieran un color castaño y necrótico con el peciolo unido al tallo. Bajo ciertas condiciones, las manchas necróticas se abren y forman cancros, como fuente de infecciones secundarias.

A pesar de que la enfermedad se consideraba confinada en los estados del noroeste de los EE. UU., en Sinaloa, México se detectó e identificó el cancro bacteriano en el Valle de Culiacán, y de 1994 a 1996 se extendió rápidamente y se estableció en las principales áreas hortícolas de exportación de los Estados de Jalisco, San Luis Potosí, Baja California Sur y Baja California Norte (Holguin-Peña et al., 2006). Hasta la fecha, se han presentado daños en 200 ha en sistemas de producción protegida, con pérdidas de comercialización estimadas en 40 millones de dólares. En el 2006 la producción nacional de tomate fue de aproximadamente 995 000 t, y el Estado de Sonora tiene el décimo lugar con 2.7 % de la producción total, después de Sinaloa (28 %), Michoacán (11.3 %), San Luis Potosí (10.8 %), Zacatecas (9.8 %), Morelos (7.0 % en invernadero), Nayarit (4.7 %), Baja California Sur (2.9 %), Jalisco (3.8 %) y Baja California (2.7 %) (SIAP, 2008). Sonora cuenta con 1705 ha de tomate: 15 % en invernadero, 75 % en casa sombra y 10 % a cielo abierto (SIAP, 2008). El objetivo del presente trabajo fue determinar si Cmm está presente en el tomate del Estado de Sonora.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitios de muestreo

La investigación se efectuó en el ciclo agrícola 2006 en terrenos de siembra de tomate en modalidad invernadero, casa sombra y campo a cielo abierto en el Estado de Sonora, México, estado que se ubica en el noroeste de México, entre 32° 29' y 26° 18' LN y entre 108° 25' y 115° 03' LO (INEGI, 2000).

Muestreo de semilla

La semilla aquí utilizada fue donada por la Confederación Nacional de Productores Hortícolas del Estado de Sonora, o adquirida en casas comerciales de agro-insumos de la región. Las semillas recolectadas fueron depositadas en bolsas de papel previamente identificadas y trasladadas al Laboratorio de Fitopatología del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Mexicali, Baja California.

Muestreo en plantas (plántula, hoja desarrollada y fruto)

Las localidades de muestreo fueron: San Luis Río Colorado, Imuris, Sáric, San Ignacio, Benjamín Hill, Costa de Hermosillo, Valle de Empalme, Valle del Yaqui y Valle del Mayo. El muestreo se hizo en sistemas de siembra de: invernaderos, casa sombra y campo a cielo abierto, previa inspección de surcos a pasos equidistantes, de acuerdo con las dimensiones de los sitios de cultivo. Este sistema permite obtener un intervalo de confianza mínimo de 95 % en la detección, en niveles de infección de 0.1 % y con 5 % de confiabilidad en el muestreo (IPFSAPH, 2001). Los síntomas buscados fueron los atribuibles a la bacteria Cmm, descritos anteriormente (Chang et al., 1992; Gleason et al., 1993; Blancar, 1996). Cada muestra colectada se identificó, y se envolvió con papel húmedo, luego se colocó en una hielera para ser trasladada al laboratorio para los análisis fitopatológicos.

Se obtuvo savia de las plantas colectadas mediante macerado en mortero de porcelana, y una porción se sembró en tres cajas de petri con diferentes medios de cultivo: YDC (extracto de levadura 1 %, D-glucosa 2 %, C_aCO₃ 2 %, agar 1.2 %); agar B de King (peptona 2 %, K₂HPO₄-3H₂O 0.15 %, MgSO₄,-7H2O 0.15 %, agar 1.5 %, glicerol 1.5 %) y NBY (Caldo nutritivo 0.8 %, extracto de levadura 0.2 %, K₂HPO₄ 0.2 %, KH₂PO₄ 0.025 %, agar 1.5 %). Las cajas se incubaron a 29 °C por 48 h, y a las colonias resultantes se les hicieron pruebas morfológicas y bioquímicas de acuerdo con las recomendaciones de OEPP/PEPO (2005) y de Schaad et al. (2000).

Detección serológica

Una porción de savia se empleó para la detección serológica de Cmm, con un juego comercial (DAS-ELISA, Agdia®, Inc.), que consiste en un ensayo de doble anticuerpo, conforme a las instrucciones del fabricante. Una vez terminada la reacción, durante 1 h se observó el desarrollo de color cada 15 min a 405 nm en un lector (Bio-Rad®).

Extracción del ADN genómico total a partir de tejido vegetal

Las partes de la planta que se utilizaron para la extracción de ADN genómico fueron: semilla, tallo, follaje y fruto. El ADN genómico total se obtuvo mediante la metodología descrita por Chomczynski et al. (1997), que utiliza el reactivo DNAzol-ES® (MRC, Inc.). Para la obtención del ADN genómico a partir de cepas aisladas de Cmm, se utilizó la técnica reportada por Ausubel et al. (2002) y por Sambrook y Russel (2001).

Detección de C. michiganensis subespecie michiganensis por PCR

Se amplificó el espaciador intergénico situado entre los genes ribosomales 16S y 23S, mediante los iniciadores PSA-4: 5' -TCA-TTG-GTC-AAT-TCT-GTC-TCC-C-3' y PSA-R: 5' -TAC-TGA-GAT-GTT-TCA-CTT-CCC-C-3', de acuerdo con las especificaciones de Pastrik y Rainey (1999), y se amplificó un fragmento de 270 pb. También por PCR se amplificó un fragmento de ADNr 16S, de 480 pb, con los iniciadores fD1 y rP2 y las condiciones de PCR desarrolladas por Weisburg et al. (1991). Los fragmentos de PCR se enviaron a secuenciar a la Universidad de San Diego, Cal. EE. UU., y mediante BLAST los resultados se compararon con las bases de datos públicas disponibles, en el GenBank (Benson et al., 2008).

El volumen total de la reacción fue de 25 μL y como testigo positivo se utilizó ADN genómico extraído de una cepa de referencia. Como testigo negativo se utilizó agua grado biología molecular. Los componentes de la mezcla de reacción fueron: amortiguador para la reacción 1X, iniciadores PSA-4 y PSA-R (2 ng μL^-1), MgCl₂. (1.5 mM), dATP, dCTP, dCTP, dGTP (200 μM), 1 unidad de Taq polimerasa y 50 ng de ADN genómico. La reacción se llevó a cabo en un termociclador PTC-100 (MJ Research®) y las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94 °C/2.5 min, seguido de 40 ciclos con 3 segmentos: 94 °C/30 s, hibridación a 63 °C/20 s, y extensión a 72 °C/45 s; la polimerización final se hizo a 72 °C por 5 min.

La electroforesis se hizo en gel de agarosa 2 %. Se utilizó amortiguador TBE (0.5 M, pH 8.3) y al preparar el gel se adicionó bromuro de etidio a una concentración de 0.5 μg mL^-1 (Sambrook y Russell, 2001). Se mezclaron 10 μL del producto de PCR con 2 μL de buffer de carga 5X (xilencianol 0.125 %, azul de bromofenol 0.125 %, glicerol 50 %, en TBE 1X) y se cargaron en el gel. Se utilizó el marcador de peso molecular de 0.1 a 2.0 kpb (Invitrogen®). Se aplicó una carga de 100 volts por 40 min; al terminar el gel se colocó sobre un transiluminador UV y los resultados se registraron con el sistema digital BioDoc-it® (UVP, Inc.)- El árbol de homología se obtuvo de la comparación de las secuencias en el programa DNAMAN® versión 6.0 (Lynnon Corp.).

Preparación del inóculo. Un cultivo bacteriano de 24 h en caldo NBY, se centrifugó por 15 min a 3900 g y el precipitado se resuspendió en solución salina a 0.85 % estéril, para eliminar los fragmentos del medio de cultivo; se centrifugó nuevamente y se estandarizó el inóculo a una turbidez del tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland. Se tomó una alícuota de 1 mL para hacer diluciones seriadas hasta 10^-4 y así conocer el número aproximado de células viables. Las diluciones se sembraron en placas con medio NBY por difusión, en volumen de 0.1 mL sobre agar, la solución bacteriana se diseminó con una varilla de arrastre, y se incubaron a 30 °C por 48 h (Madigan et al., 2006). Este inóculo de 1 x 10⁶ UFC mL^-1 se utilizó para las pruebas de patogenicidad en semilla, plántula y fruto del tomate cv. 'Pony Express F1'.

Pruebas de patogenicidad en semilla. Se utilizaron 20 semillas previamente desinfestadas en solución de hipoclorito de sodio 1.0 % (v/v) y fueron embebidas en 200 mL de la suspensión bacteriana por 30 min; posteriormente se sembraron en vasos térmicos que contenían un sustrato estéril tipo peat-moss (Sunshine®, Sun Gro Horticulture. Canada, Ltd.). Otras 20 semillas se consideraron como testigo negativo al pasar por el mismo proceso, pero con uso de agua destilada estéril.

Pruebas de patogenicidad en plántula. Se tomaron 200 semillas previamente desinfestadas como se mencionó anteriormente, que se germinaron en placas con sustrato estéril (mismas características anteriores), a 25 °C; el riego se hizo con agua estéril. Después de 30 d de la emergencia, se inocularon 10 plántulas con la suspensión bacteriana de 1 x 10⁶ UFC mL^-1 de Cmm, de las siguientes cuatro maneras: 1) Por aspersión directa sobre la planta; 2) Por punción en tallo; 3) Por punción en el peciolo; 4) Por lijado de hoja e inoculadas con un cotonete de algodón. En cada tratamiento se utilizaron 10 plántulas como testigo negativo, que pasaron por los mismos procesos mencionados anteriormente pero con agua destilada estéril. Todo el material utilizado durante el muestreo y las pruebas de patogenicidad, así como el material biológico y peat-moss empleado en las pruebas de patogenicidad, fueron esterilizados para su desecho y posteriormente se enviaron a un incinerador, para asegurar que no hubiese diseminación al ambiente y la contaminación de otros sistemas de cultivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las 237 muestras analizadas, de las cuales 8 fueron de raíz, 11 de tallo, 189 de hojas, 15 de frutos y 14 de semilla, provenían de nueve localidades. De éstas se obtuvieron resultados diferentes en función de la técnica utilizada. Se detectó crecimiento de colonias sospechosas de Cmm en dos localidades (San Ignacio y Benjamín Hill), con sistemas de siembra en casa sombra e invernadero respectivamente, lo que correspondería a una incidencia de 0.27 y 0.11 %, respectivamente. En ambos casos las plantas presentaron un grado de severidad leve en etapa inicial, y sólo algunas un grado de severidad avanzado (Figura 1).

La presencia de la enfermedad en cualquier sistema de cultivo del tomate, representa un foco de alerta roja, debido a que la bacteria se transmite por semilla y plántulas, y sobrevive en el suelo por dos o tres años, lo que puede facilitar que se disemine y provoque pérdidas en la cosecha, como ha ocurrido en otras regiones (Gleason et al., 1993). La presencia de la enfermedad se ha reportado más comúnmente en siembra en invernaderos, y se atribuye a la alta humedad relativa en estos sistemas de siembra, situación similar a la observada en el presente trabajo. También se ha observado que en sistemas donde se carece de protección bactericida contra el patógeno, la enfermedad es más común y más severa. En la región Mediterránea de Turquía, Basim et al. (2004) reportaron la aparición de la enfermedad en sistema de producción de tomate en invernadero con una incidencia que varió de 26 a 65 %, que provocó grandes pérdidas económicas y con una amplia variedad de síntomas como marchitamiento, coloración marrón oscuro a negro en las lesiones de los márgenes de las hojas, y en las fases avanzadas con tejido vascular de color marrón claro, síntomas que concuerdan con los observados en este trabajo.

Detección, aislamiento e identificación

Detección serológica. Por medio de la técnica de ELISA se detectaron cinco muestras positivas de Cmm, tres de tallo, una de hoja y una de semilla (Cuadro 1), mediante el juego comercial recomendado por las normas OEPP/EPPO (2005) para la detección presuntiva de la enfermedad en tomate. Esta técnica es la recomendada cuando se va a analizar un número grande de muestras, ya sea de material vegetal o bien de colonias aisladas. En este trabajo únicamente se utilizó para la detección directa en el material vegetal, por lo que sólo se puede concluir que esta técnica fue útil en la detección primaria de la bacteria; es decir, dio idea de la presencia del patógeno en las plantas, pero sin analizar colonias aisladas.

Detección e identificación por técnicas moleculares. Se detectó la presencia de Cmm por la amplificación mediante PCR de un fragmento de ADN específico de 270 pb. Las siete muestras positivas fueron dos de tallo, dos de hoja y tres de semilla (Figura 2). La presencia de Cmm se corroboró una vez que fueron aisladas las colonias mediante PCR, con los mismos resultados de amplificación del fragmento de 270 pb (datos no mostrados). La identificación de las colonias se hizo mediante la secuenciación del fragmento de 480 pb, amplificado por PCR del ADNr. Se encontró que los fragmentos obtenidos pertenecen a cepas de Clavibacter michiganensis subsp michiganensis, ya que al compararlas con las secuencias de las bases de datos públicas mostraron una homología de 99 %. La Figura 3 muestra el árbol de similitud de las secuencias de dos de las cepas aisladas (D y H); la cepa D pertenece a los aislamientos de la localidad de San Ignacio, con sistema de siembra en casa sombra, mientras que la cepa H proviene del sitio Benjamín Hill con sistema de invernadero.

La homología de secuencias de las bases de datos con las cepas D y H aisladas es alta, con 99 % entre ellas, así como con las secuencias de cepas obtenidas de las bases de datos con las que se compararon (AB29958, EU686335 y DSM 46364), mientras que con Micobacterium spp., que pertenece al mismo grupo taxonómico, la homología es de 87 %, y sólo comparte 36 % de homología con Escherichia coli. Li y De Boe (1995) compararon la secuenciación casi completa de los genes 16S rRNA de las cepas tipo de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, C. m. subsp. insidiosus, C. m. subsp. sepedonicus y C. m. subsp. nebraskensis, y las cuatro especies mostraron una disimilitud de apenas 1 % en sus genes ribosómicos, la cual es mayor que para otras especies y subespecies del mismo género.

Pruebas de patogenicidad

Las semillas de ambas variedades susceptibles y tolerantes que fueron tratadas con la solución bacteriana germinaron a las 48 h, y a los 7 d alcanzaron un altura de 5 cm; la plántulas fueron marchitándose progresivamente hasta morir totalmente por efecto de la solución bacteriana, mientras que la semilla tratada con agua destilada no manifestó síntoma alguno y continuó su crecimiento (Figura 4).

Las plantas que fueron tratadas con el inóculo bacteriano mediante aspersión directa sobre la planta, mostraron síntomas a los 3 d de incubación, mientras que las inoculadas por punción en tallo y peciolo, lijado de hoja e inoculadas con la ayuda de un cotonete de algodón, mostraron síntomas a los 5 d después de la inoculación; a los 17 d las plantas estaban completamente secas, en contraste con las plantas testigo inoculadas con agua estéril, en las que no se observaron síntomas de marchitez. Esto confirma que los aislamientos obtenidos corresponden al agente causal de la enfermedad y que se trata de una cepa fuertemente virulenta, por lo que es necesario se busque la forma de controlarla en los sistemas agrícolas aislados, y de evitar su diseminación.

CONCLUSIONES

No fue posible determinar la procedencia de la infección, ya que no se encontró algún otro caso en plantaciones de tomate ni tampoco en semilla muestreadas.

En el Estado de Sonora, México, la enfermedad conocida como marchitez bacteriana en tomate, inducida por la bacteria Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis, está presente en sistemas de producción bajo invernadero y casa sombra, así como en semilla, y fue detectable tanto por técnicas de aislamiento en medios de cultivo y ELISA, como por la reacción en cadena de la polimerasa. Sin embargo, no se encontraron síntomas de la enfermedad en plantaciones de tomate en campos a cielo abierto.

AGRADECIMIENTOS

Al Comité Estatal de Sanidad Vegetal por el apoyo en instalaciones, equipo, reactivos y conocimientos: Armando Pulido Herrera, Gabriela Juárez López, Enrique Montaño Quintana, y al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., a Rosalva Pérez Morales y al Ing. Ernesto Rascón Rascón, por su ayuda en el muestreo de las plantas. Al CONACYT por la beca asignada a Jesús Borboa para la realización de sus estudios de doctorado. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación por el proyecto aprobado 12067 "Detección de bacterias de importancia cuarentenaria en la zona noroeste de México".

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