Genética poblacional del ostión de placer Crassostrea corteziensis en el Golfo de California

Population genetics of the oyster Crassostrea corteziensis in the Gulf of California

R Pérez-Enríquez^*, S Ávila, AM Ibarra

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. (CIBNOR), Mar Bermejo 195, Col. Playa Palo de Sta. Rita, CP 23090, La Paz, Baja California Sur, México. * E-mail: rperez@cibnor.mx

Recibido en julio de 2007.
Aceptado en junio de 2008.

Resumen

El ostión de placer Crassostrea corteziensis es una especie que se cultiva en las costas del Pacífico mexicano con amplio potencial de desarrollo. Por ello, CIBNOR está realizando estudios para profundizar en su conocimiento para el futuro desarrollo de un programa de reproducción selectiva. Con el fin de indagar la potencial utilización de múltiples poblaciones para el cultivo, se llevó a cabo un análisis de diversidad y estructura genética de la población natural. Se obtuvieron muestras de cinco localidades entre Sonora y Nayarit, en el Golfo de California. El análisis con alozimas mostró un amplio flujo genético en el área de estudio que indica que la población no se encuentra estructurada. La gran diversidad genética observada indica un importante potencial de manejo tanto para la selección como para la recuperación de los stocks naturales. Los análisis basados en alozimas y ADN mitocondrial revelaron la presencia de una especie simpátrica, presumiblemente C. columbiensis. Se recomiendan estudios ecológicos y moleculares para entender las relaciones entre estas dos especies, así como las de éstas con las variables ambientales.

Palabras clave: alozimas, Crassostrea corteziensis, diversidad genética, ostión.

Abstract

The native oyster Crassostrea corteziensis is a cultured species along the Mexican Pacific with considerable growth potential. For this reason CIBNOR is working towards obtaining greater knowledge that can be used in the future to begin a selective breeding program. To take advantage of the potential of using multiple populations, the genetic diversity and structure of the wild population was analyzed. Samples were obtained from five sites from Sonora to Nayarit in the Gulf of California (Mexico). Allozyme analysis showed high gene flow in the area, indicating no genetic structure. High genetic diversity was also observed, indicating an adequate potential for selective breeding and species recovery management. Allozyme and mitochondrial DNA analyses revealed the presence of a sympatric species, presumably C. columbiensis, which was found at one of the collection sites instead of C. corteziensis. Further ecological and molecular studies on both species are recommended to understand the relationships between them and the environment.

Introducción

El ostión de placer Crassostrea corteziensis (Hertlein 1951) es una especie que se cultiva a nivel semi-extensivo en la región noroeste de México desde hace varios años y, por sus características (Chávez-Villalba et al. 2005), representa una especie con alto potencial acuícola para el Pacífico tropical, no sólo de México sino también de Centroamérica.

Aun cuando los cultivos que se realizan en los estados de Sinaloa y Nayarit dependen de la captación natural de semilla, diversos estudios han mostrado la factibilidad de la producción controlada de ésta, lo que ha permitido la instalación de laboratorios para su producción a nivel comercial. Para que una producción controlada de semilla sea potencialmente viable en el largo plazo es necesario contar con reproductores que sean manejados adecuadamente para mantener su diversidad genética, reducir problemas potenciales ocasionados por endogamia y que sirvan de fuente a futuros programas de mejora genética.

El conocimiento del acervo genético de la especie a lo largo de su rango de distribución es un factor importante que permitirá realizar un manejo adecuado, tanto para la creación de un stock de reproductores como para evitar que los cultivos dependientes del suministro natural de semilla pierdan diversidad genética y sufran cambios en su estructura genético-poblacional.

Existen pocos estudios filogenéticos y genético-poblacionales sobre el ostión de placer C. corteziensis. En un análisis filogenético con alozimas en especies de Crassostrea, Hedgecock y Okazaki (1984) reportaron que una población de C. corteziensis de San Blas, Nayarit, presentó valores moderadamente altos de diversidad genética con un promedio de 2.07 alelos por locus, un 67% de loci polimórficos y una heterocigosidad esperada de 20%. Por otra parte, un análisis basado en electroforesis de proteínas entre poblaciones de dos lagunas costeras de Nayarit con condiciones de salinidad distintas (Rodríguez-Romero et al. 1988), indicó una baja diferenciación genética entre localidades, sin descartarse la posibilidad de diferenciación en un rango geográfico más amplio.

A pesar de la poca variabilidad comúnmente detectada por las alozimas, diversos estudios con especies de Crassostrea han sido capaces de detectar diferencias genéticas entre poblaciones. Tal es el caso de C. virginica en el Golfo de México (Buroker 1983) y C. angulata en España y Portugal (Michinina y Rebordinos 1997). Estos autores mencionan que, a pesar del potencial de dispersión de la especie en su etapa larvaria, dichas diferencias se deben probablemente a presiones selectivas por diferencias en el hábitat. La distribución de C. corteziensis en diferentes ambientes estuarinos (de hipersalinos a salobres) podría originar también diferencias genéticas detectables. De resultar así, para la creación de un stock de reproductores será de gran utilidad contar con información sobre si existe o no diferenciación genética de esta especie entre sus distintas localidades y, dado el caso, el grado de diferenciación entre las poblaciones.

En este estudio se estimó la diversidad genética, la diferenciación y el flujo genético de C. corteziensis entre localidades del Golfo de California con el fin de determinar la estructura genética de su población.

Obtención de muestras

Se obtuvieron muestras de C. corteziensis de cinco localidades del noroeste de México, entre enero de 2004 y marzo de 2005. Las localidades muestreadas fueron: Guaymas (Bahía de Lobos: 27°20' N, 110°30' W), Topolobampo (Bahía de Santa María: 25°39' N, 109°13' W), Culiacán (Bahía de Ceuta: 24°05' N, 107°09' W), Nayarit Norte (Estero de Tecuala: 22°28' N, 105°40' W) y Nayarit (Boca de Camichín: 21°45' N, 105°30' W) (fig. 1). Los ejemplares de Topolobampo, presuntamente de la misma especie, fueron más pequeños que los del resto de los sitios. Todos los organismos fueron transportados vivos o congelados al CIBNOR, siguiendo el método de Hegdecock y Okazaki (1984), donde se realizó su disección. Los organismos silvestres se recolectaron de las raíces de los mangles, con excepción de la muestra de Boca de Camichín que fue tomada de una balsa de cultivo (de fijación natural). Se obtuvieron 50 individuos de cada localidad.

Análisis genético por alozimas

Se estandarizaron las condiciones de análisis de alozimas con base en el trabajo de Hegdecock y Okazaki (1984) con esta misma especie, utilizando tejido de músculo y manto para las siguientes enzimas (se incluye nomenclatura y número EC de acuerdo con Shaklee et al. (1990)): adenilato kinasa (AK*, EC 2.7.4.3), aspartate aminotransferasa (AAT*, EC 2.6.1.1), fosfoglucomutasa (PGM*, EC 5.4.2.2), fosfogluconato deshidrogenasa (PGDH*, EC 1.1.1.44), glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI*, EC 5.3.1.9), glutamato deshidrogenasa (GDH*, EC 1.4.1.-), leucin-aminopeptidasa (LAP*, EC 3.4.11.1), malato deshidrogenasa (MDH*, EC 1.1.1.37), superóxido dismutasa (SOD*, EC 1.15.1.1), triosefosfato isomerasa (TPI*, EC 5.3.1.1), xantina deshidrogenasa (XDH*, EC 1.17.1.4). Las enzimas AAT*, GDH*, GPI*, LAP*, PGM*, SOD* y XDH* se analizaron con el sistema amortiguador R (May 1992); las enzimas AAT*, AK*, MDH*, PGDH* y TPI* con el sistema T-C (Shaw y Prasad 1970, Benzie et al. 1993); las enzimas AK*, MDH* y PGDH* en el sistema CAAMP (Shaklee y Keenan 1986, Murphy et al. 1996); las enzimas PGM*, PGDH* y SOD* con el sistema fosfato-citrato (Selander et al. 1971); las enzimas AAT*, GPI*, LAP* y SOD* con el sistema A (Ayala et al. 1972); las enzimas GDH*, TPI* y XDH* con el sistema B (Ayala et al. 1972), y las enzimas AK*, MDH* y PGDH* con sistema "C" (Ayala et al. 1972). Como resultado de esta etapa exploratoria sólo se obtuvieron revelados adecuados para las enzimas PGM*, GPI* y SOD* analizadas en músculo con el sistema R, y para AK* y MDH* analizadas en manto y músculo, respectivamente, con el sistema T-C, por lo que éstas fueron las enzimas seleccionadas para el análisis de las muestras.

Análisis de datos

Las lecturas alélicas se efectuaron con geles en fresco y se fotodocumentaron. Se asignaron letras a los alelos considerando como *a la banda con mayor avance anodal. Con las lecturas electroforéticas se calcularon las frecuencias alélicas y se estimaron los siguientes parámetros de diversidad genética: proporción de loci polimórficos (Pl), número de alelos por locus (A), y heterocigosidad observada (H_o) y esperada (H_e), todo ello utilizando el programa BIOSYS-1 (Swofford y Selander 1981). Se estimó la deficiencia de heterocigotos mediante el índice de endogamia Fis y se realizaron pruebas exactas de Fisher para determinar desviaciones con respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg para cada locus en cada localidad con el programa FSTAT (Goudet 2000). Se llevó a cabo un ajuste de secuencia de Bonferroni para las pruebas múltiples de significancia (Rice 1989). Se realizó un análisis de diferenciación de poblaciones basado en el índice θst como estimador de Fst (Weir y Cockerham 1984), cuya significancia se estimó mediante el método de remuestreo con reemplazo denominado bootstrap (15,000 repeticiones) incluido en el programa FSTAT (Goudet 2000). La distancia genética de Nei (1978) y el flujo genético medio entre localidades (Nm = 0.25 (1 - Fst)/ Fst) se estimaron con la ayuda del programa PopGene (Yeh et al. 1999). El dendrograma UPGMA de distancias genéticas se obtuvo con el programa TreeView (Page 1996).

Análisis de ADN mitocondrial

Los productos de PCR fueron secuenciados en sentido y antisentido (Macrogen, Corea) y las secuencias fueron editadas utilizando el programa ChromasPro ver. 1.15 (Technelysium, Australia). Se construyeron árboles filogenéticos del tipo "vecino más cercano" basados en las divergencias entre pares de secuencias utilizando el modelo parámetro-dos de Kimura instrumentado en el programa MEGA ver 3.1 (Kumar et al., 2004) en el cual C. gigas quedó como grupo externo. El programa MEGA incluye el método de remuestreo bootstrap con 500 repeticiones para verificar la probabilidad de ocurrencia de la topología del árbol obtenido. Se depositaron cuatro secuencias en la base de datos pública "GenBank": dos de C. corteziensis (ejemplares recolectados en Culiacán y Guaymas), una de Crassostrea sp. (ejemplar recolectado en Topolobampo) y una de C. gigas. Las secuencias quedaron registradas con números de acceso EU733651 a EU733654.

Se estimó el grado de divergencia genética entre la secuencia de C. corteziensis y Crassostrea sp. (muestra de Topolobampo) dividendo el número de bases variables de la secuencia del gen 16SrRNA de las dos especies entre el total de bases de la secuencia. Este valor se comparó con el grado de divergencia de secuencias del mismo gen de otras especies de ostión registradas en el GenBank (C. ariakensis, C. rhizophorae y C. virginica, con números de acceso AY160757, DQ839415 y AY905542, respectivamente). Se construyó un árbol filogenético de la misma manera descrita en el párrafo precedente.

Resultados

De las cinco enzimas analizadas se resolvieron seis loci, de los cuales dos fueron monomórficos (MDH-2, SOD) en todas las poblaciones. Los loci polimórficos, es decir aquellos que dieron como resultado un alelo en al menos un individuo (criterio del 99%) y en al menos una población, fueron AK*, PGM*, GPI* y MDH-1*. El conjunto de estimadores de la diversidad genética (Pl, A y H_o) indican que la localidad menos diversa es la de Topolobampo (tabla 1). Nayarit Norte sobresale del resto por presentar los valores más altos, en particular en cuanto a la heterocigosidad (H_o= 0.117). Las tres localidades restantes presentan valores comparativamente similares entre ellas. Los valores medios de Fis por localidad indican una deficiencia significativa de heterocigotos en Guaymas y Topolobampo y marginalmente significativa en Culiacán (P = 0.0467); sin embargo, esta última pasó a ser no significativa después del ajuste secuencial de Bonferroni. Nayarit Norte y Nayarit no muestran disparidades entre lo observado y lo esperado en función del equilibrio de Hardy-Weinberg (tabla 1).

Tres de los cuatro loci polimórficos presentaron un número considerable de alelos en el total de las localidades (5 en AK, 6 en GPI* y 11 en PGM*) (tabla 2). Con la excepción de Topolobampo los alelos más comunes en AK*, GPI* y PGM* (*c, *c y *g, respectivamente) coincidieron en todas las localidades con alta homogeneidad en sus frecuencias. En Topolobampo los alelos más comunes en AK*, GPI* y PGM* (*b, *f e *i, respectivamente) presentaron una notoria diferencia en sus frecuencias con respecto al resto de las localidades (fig. 2). De acuerdo a las pruebas exactas de Fisher y a los valores de Fis, todas las poblaciones se ajustaron al equilibrio de Hardy-Weinberg en todos los loci (tabla 2), con la única excepción del locus PGM* en Topolobampo. Cabe mencionar que, aunque los valores de P del coeficiente de endogamia Fis antes del ajuste secuencial de Bonferroni en Guaymas (AK* y GPI*) y en Nayarit Norte (AK*) fueron no significativos, en realidad fueron más bien bajos (tabla 2). Considerando que, como se explica más adelante, los ejemplares recolectados en Topolobampo representan a una especie diferente a C. corteziensis y que se detectaron ejemplares característicos de dicha localidad en las localidades de Guaymas y Nayarit Norte, se realizó un nuevo análisis de Fis en estos dos sitios extrayendo los ejemplares "tipo-Topolobampo" (i.e., aquellos que presentaron el genotipo PGM*ff). El cambio del valor de P de Fis hacia la no significancia fue claro en ambas localidades, pasando de 0.008 a 0.377 en GPI* y de 0.015 a 0.130 en AK*, en Guaymas y Nayarit Norte, respectivamente. La única excepción fue AK* en Guaymas, cuyo valor no se modificó pero se mantuvo en un nivel marginal no significativo (P ≈ 0.05).

El análisis genético-poblacional mostró un valor altamente significativo de Fst = 0.536 (P < 0.01) que indica que al menos una localidad es distinta. Las evidentes diferencias en las frecuencias alélicas entre Topolobampo y el resto de las localidades indican claramente que esta localidad es genéticamente distinta. El análisis de diferenciación, excluyendo a Topolobampo, dio como resultado un valor no significativo de Fst = 0.004 (P > 0.05), lo que muestra que no hay diferencias genéticas entre Guaymas, Culiacán y las dos localidades de Nayarit. La asociación entre el conjunto de localidades se aprecia en el dendrograma basado en la distancia genética (fig. 3), en donde se observa la evidente separación de Topolobampo, y si bien Culiacán se asocia más con Nayarit y Nayarit Norte con Guaymas, las distancias entre estos dos grupos son mínimas. El flujo genético entre localidades, calculado a partir del Fst global excluyendo Topolobampo, fue de 24.3 migrantes por generación; los valores pareados de Fst dieron como resultado valores de flujo genético relativamente homogéneos (Guaymas/Culiacán, Nm = 21.4; Guaymas/Nayarit Norte, Nm = 66.4; Guaymas/Nayarit, Nm = 17.2; Culiacán/Nayarit Norte, Nm = 43.6; Culiacán/Nayarit, Nm = 83.5; Nayarit Norte/ Nayarit, Nm = 30.8). Con base en estos resultados no hay evidencias para considerar que la población de C. corteziensis se encuentre estructurada.

El elevado nivel de diferenciación genética del ostión de Topolobampo respecto al resto de las localidades (una divergencia del 6%) fue confirmado con el análisis de secuencias del gen mitocondrial 16srRNA (tabla 3), el cual dio como resultado un dendrograma que separa claramente las muestras de ostión de Topolobampo de las de Guaymas y Culiacán y las de C. gigas con valores del remuestreo de 100% en cada nodo (fig. 4a). El análisis de secuencias incluyendo a otras especies de ostión registradas en el GenBank (C. ariakensis, C. rhizophorae y C. virginica) evidenció que el grado de diferenciación del ostión encontrado en Topolobampo y C. corteziensis a nivel de especie (fig. 4b) fue ligeramente mayor al observado entre C. rhizophorae y C. virginica (4.9%) y entre C. gigas y C. ariakensis (3.4%).

Discusión

Diversidad genética

A pesar de que los loci alozimáticos utilizados por Hedgecock y Okazaki (1984) en C. corteziensis recolectados en Nayarit son distintos a los del presente estudio, los niveles de diversidad genética son comparables entre ambos estudios, en particular con los de la muestra de Nayarit Norte, lo que indica que probablemente no ha ocurrido un descenso considerable de este indicador de diversidad en un periodo de aproximadamente 20 años. Lo anterior, aunado a la homogeneidad en la diversidad genética observada entre las localidades en donde se recolectó C. corteziensis, tiene implicaciones de interés tanto desde el punto de vista pesquero como acuícola. En el primer caso, si se considera que C. corteziensis ha estado sujeto a una intensa pesquería, particularmente en la región de Guaymas y el norte de Sinaloa (Chávez-Villalba et al. 2005), los datos indican que a pesar de ello, aún no existen evidencias de que la población se haya visto afectada por un cuello de botella, lo que permite hipotetizar que probablemente el tamaño efectivo de la población en el área de pesca no se ha reducido significativamente, o bien que el número de generaciones no ha sido suficiente que se acumulen los efectos de un cuello de botella.

Por lo que se refiere a la actividad acuícola, el cultivo de C. corteziensis en sartas se lleva a cabo desde hace muchos años, particularmente en el estado de Nayarit, en donde Stuardo y Martínez (1975) demostraron la factibilidad de dicho cultivo. En esta región la semilla para el cultivo se obtiene de colectores colocados en el cuerpo de agua del estero Boca de Camichín en áreas cercanas a los propios sitios de cultivo, de manera que es muy probable que dicha semilla provenga de los propios organismos cultivados. En este sentido no se observan reducciones en la diversidad genética entre el área de recolecta silvestre (Nayarit Norte) y los organismos recolectados de las sartas de cultivo (Nayarit), así como tampoco existen evidencias de cuellos de botella causados por el cultivo. Lo anterior indica que pese a la extensa actividad acuícola en Nayarit, la población en cultivo se mantiene con un tamaño efectivo suficientemente grande. Es evidente que esta población no presenta un comportamiento como el de la semilla derivada de laboratorios de producción de larvas de otras especies de ostión como Ostrea edulis, en los cuales es común que se utilicen pocos reproductores para producir los lotes de semilla, lo que resulta en una baja diversidad genética (Saavedra 1997).

El elevado flujo genético detectado con el análisis alozimático indica que esta especie está conformada por una sola población panmíctica a lo largo del área de estudio. El tiempo de vida en estado larvario, de aproximadamente 18-22 días (Mazón-Suástegui et al. 2002), aunado al régimen de corrientes de la región, se puede considerar la causa del elevado flujo genético. De acuerdo con Marinone (2003), la dirección de la corriente superficial a lo largo de la costa oriental del Golfo de California muestra un patrón norte-sur en la primavera y el otoño, mientras que el patrón es sur-norte en el verano. El hecho de que la temporada de reproducción de C. corteziensis tenga lugar predominantemente de julio a noviembre (Stuardo y Martínez 1975), es decir en verano y otoño, explicaría el amplio flujo genético en ambos sentidos. Los resultados contrastan con lo encontrado en otras especies de ostiones tales como Ostrea edulis en Europa y C. virginica en el Golfo de México, en las cuales se han detectado diferencias genéticas interpoblacionales, tanto con alozimas como con marcadores genéticos de ADN nuclear y mitocondrial, con patrones marcados bajo el modelo de "aislamiento por distancia" (Hare y Avise 1996, Launey et al. 2002). Es probable que este patrón no haya sido detectado en C. corteziensis a pesar de que el rango geográfico analizado sea del orden de 900 km, debido a la relativa homogeneidad ambiental de la región, constituida por extensos sistemas estuarinos. Dado que el área de distribución de la especie abarca del Pacífico tropical de México hasta el Perú (Fischer et al. 1995) será necesario ampliar el ámbito del estudio hasta esas latitudes, para conocer mejor su comportamiento. Por otro lado, los resultados difieren también a lo observado en la almeja Chione californiensis por Licona-Chávez et al. (2007), quienes encontraron diferencias ligeras pero significativas entre localidades del Golfo de California (Agiabampo, Sonora, y La Paz, Baja California Sur). De acuerdo con estos autores, el limitado flujo genético entre ellas podría atribuirse a la presencia de barreras geográficas en la Laguna de Agiabampo que evitan parcialmente la entrada de larvas hacia el sistema lagunar.

La ausencia de estructura genética de la población de C. corteziensis aunada con los niveles de diversidad genética antes mencionados, indica que la especie tiene un potencial de recuperación en las áreas sujetas a sobreexplotación por pesquerías, o afectadas por efectos del deterioro del hábitat. Para ello será necesario determinar la ubicación de los stocks que pueden funcionar como fuentes de reclutas para los stocks explotables y diseñar esquemas de repoblación y manejo que permitan su recuperación. Sin embargo, dichos esquemas deberán tomar en cuenta la influencia de otros factores como la disponibilidad de hábitat o las variaciones de parámetros ambientales. En cuanto a las implicaciones para la acuacultura, se tendrá la posibilidad de recurrir a la recolecta de organismos en las diversas zonas en donde se distribuye la especie a lo largo del área estudiada, para la conformación de los lotes de reproductores.

Galtsoff (1964) señala que la elevada variabilidad morfológica de la concha de especies de Crassostrea dificulta en muchos casos una identificación adecuada. En este sentido, Lapegue et al. (2002) recomiendan la utilización de análisis cariológicos y moleculares, a través de los cuales dilucidaron la presencia de una especie antes reportada sólo para África (C. gasar) en las costas de Brasil. Para el caso de la muestra de Topolobampo, la combinación de los resultados de alozimas y ADN mitocondrial indicó que se trata de una especie distinta a C. corteziensis. El uso de las claves de identificación de Fischer et al. (1995) y las descripciones de Keen (1971) indican que posiblemente la especie presente en esa localidad es C. columbiensis, la cual tiene un rango de distribución similar al de C. corteziensis. Sin embargo, existen todavía vaguedades en algunas de las descripciones de ambos autores, por lo que es recomendable profundizar en la caracterización molecular de ésta y otras especies de ostréidos del Pacífico.

Independientemente de la precisa identificación de los ejemplares, cabe mencionar que a pesar de que la recolección de las muestras se realizó bajo condiciones ambientales similares en todos los sistemas lagunares (raíces de los mangles en el nivel submareal), resalta que en la Bahía de Santa María (Topolobampo) se encontraron ejemplares únicamente de la otra especie de Crassostrea (posiblemente C. columbiensis), lo que indica la necesidad de determinar las condiciones ambientales específicas en las cuales se favorece el desarrollo de una especie sobre el de la otra, así como las relaciones interespecíficas entre ellas (e.g. competencia por espacio). Para ello será necesario hacer muestreos más intensivos dentro del sistema lagunar de la región de Topolobampo y los sistemas lagunares vecinos.

Por otra parte, debe considerarse la posibilidad de confusión entre las dos especies, particularmente cuando se buscan organismos para conformar lotes de reproductores debido a que se podría incurrir en la producción de híbridos (viables o no), como ha ocurrido en la producción de C. gigas, al no saber que algunos reproductores de esta especie se encontraban mezclados con reproductores de C. sikamea (Banks et al. 1994).

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el fondo sectorial SAGARPA-CONACYT (2003-035) a AM Ibarra. El apoyo de JL Ramírez-Arce fue fundamental para la obtención de la mayor parte de las muestras. Se agradece al CESANAY su apoyo para la obtención de las muestras de Boca de Camichín (Nayarit). Un árbitro anónimo aportó importantes comentarios para mejorar el manuscrito.

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