Efectos del palmitato de vitamina A, el β-caroteno y el ácido retinoico en el crecimiento e incidencia de deformidades en larvas de pargo rojo Chrysophrys major

Effects of vitamin A palmitate, β-carotene and retinoic acid on the growth and incidence of deformities in larvae of red sea bream Chrysophrys major

LH Hernández-H.¹*, S Teshima¹, S Koshio², M Ishikawa², FJ Gallardo-Cigarroa³, MS Alam⁴, O Uyan²

¹ Laboratorio de Producción Acuícola, UNAM Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Av. de los Barrios 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de México 54090, México. * E-mail: luish3@yahoo.com

³ Yamaha Nutreco Aquatech Co. Ltd., Suite 702 Abundant'95, Hakataekihigashi 3-12-1, Fukuoka 812-0013, Japan.

⁴ Center for Marine Science, Aquaculture Program, University of North Carolina at Wilmington, 7205 Wrightsville Ave., Wilmington, NC, 28403, USA.

Recibido en febrero de 2005;
aceptado en octubre de 2005.

Resumen

Se examinaron los efectos del palmitato de vitamina A (VAP; 2.7, 27 y 165 mg/100 g dieta), el β-caroteno (βC; 1, 9 y 50 mg/ 100 g dieta) y el ácido retinoico (RA; 2.8, 28 y 166 mg/100 g dieta) en la incidencia de deformidades de larvas de pargo rojo (Chrysophrys major) utilizando micro dietas con zeina durante 15 días. Crecimiento (peso final, ganancia en peso y longitud total) e índice de supervivencia fueron afectados por el incremento en la suplementación de esos compuestos. Las anormalidades observadas en las larvas fueron compresión o fusión aparente de los segmentos de la notocorda y deformidades en la boca. La compresión/fusión aparente de los segmentos se detectó principalmente en las vertebras de la zona hemal, afectando la longitud total de las larvas. La incidencia de estas deformidades se incrementó con el aumento de los niveles de VAP, βC y RA en las dietas, pero se observó un porcentaje significativamente más alto de vértebras afectadas en las larvas alimentadas con las dietas con RA. El efecto del βC no fue claro en el presente estudio, ya que sólo la concentración más alta provoco una incidencia de deformidades significativa. Los resultados del presente estudio muestran que la vitamina A en la dieta podría estar vinculada a las deformidades vertebrales en larvas del pargo rojo.

Palabras clave: Chrysophrys major, deformidades vertebrales, vitamina A, ácido retinoico, larva.

Abstract

The effects of vitamin A palmitate (VAP; 2.7, 27 and 165 mg/100 g diet), β-carotene (βC; 1, 9 and 50 mg/100 g diet) and retinoic acid (RA; 2.8, 28 and 166 mg/100 g diet) on the incidence of deformities in red sea bream (Chrysophrys major) larvae were examined using zein-based micro-bound diets during 15 days. Growth (final body weight, weight gain and total length) and survival rate were affected by the increasing supplementation of these compounds. The abnormalities observed in the larvae included the compression or apparent fusion of the segments in the notochord and mouth deformities. Compression/apparent fusion of the segments was detected mainly in vertebrae of the hemal zone, affecting the total length of larvae. Incidence of these deformities increased with increasing levels of VAP, βC and RA in the diets, but a significantly higher percentage of affected vertebrae was observed in the larvae fed the diets containing RA. The effect of βC was unclear in the present experiment, since only the highest concentration caused significant incidence. The results of this study show that dietary vitamin A may be related to the vertebral deformities in red sea bream larvae.

Key words: Chrysophrys major, vertebral deformities, vitamin A, retinoic acid, larvae.

Introducción

Las deformidades del cuerpo son un problema fundamental en la producción de peces marinos (Koumoundouros et al. 1997) y a menudo están asociadas con la depresión del crecimiento, altas tasas de mortalidad, susceptibilidad a estrés y enfermedades (Andrades et al. 1996, Boglione et al. 2001). Además, las deformidades del cuerpo afectan la calidad y el valor comercial de los peces (Koumoundourus et al. 2001). En su mayoría, las deformidades ocurren en el esqueleto (vértebras y mandíbulas) durante los estadios larval y juvenil (Koumoundourus et al. 1997). Durante algunos años, se ha supuesto que la vitamina A (vit A) produce algunas malformaciones en el esqueleto de larvas producidas en criaderos (Cahu et al. 2003). El exceso de vit A en la dieta se ha sugerido como responsable de las deformidades vertebrales en las larvas del lenguado japonés Paralichthys olivaceus (Takeuchi et al. 1995, Dedi et al. 1995, Dedi et al. 1997, Takeuchi et al. 1998), del turbot Scophthalmus maximus (Estevez y Kanazawa 1995), del halibut del Atlántico Hippoglossus hippoglossus (Hamre et al. 2005) y el salmón del Atlántico Salmo salar (Ørnsrud et al. 2002, Ørnsrud et al. 2004). El efecto de la vit A de la dieta en las deformaciones de las vértebras es mediado por su derivado, el ácido retinoico (RA). Durante el desarrollo larvario, el RA regula la actividad de los genes homeobox (Means y Gudas 1995), que están a cargo de la organización del patrón de desarrollo de eje central de cuerpo (Ross et al. 2000). El exceso de RA interrumpe la expresión normal de estos genes, originando las deformidades en las vértebras (Takeuchi et al. 1998).

La producción por acuacultura del pargo rojo Chrysophrys major es la segunda más grande en Japón (Koshio 2002), pero los peces de esta especie criados artificialmente muestran una gran incidencia de deformidades en el cuerpo, particularmente en las vértebras (Takashima 1978, Matsuoka 1987), y es posible que la vit A de la dieta pueda afectar el desarrollo normal de estadio tempranos de esta especie. Ogata y Oku (2001) no encontraron ninguna diferencia significativa en el crecimiento de juveniles de pargo rojo alimentados con 100 mg de RA kg^-1 de dieta cuando se comparó con juveniles alimentados con una dieta comercial. Asimismo, Hernández et al. (2004) reportaron que juveniles de pargo rojo no mostraron ninguna deformidad en el esqueleto cuando se alimentaron con una dieta suplementada con 100,000 unidades internacionales (IU) de vit A kg^-1 (1 IU = 0.3 de all-trans-retinol). Por ello, el desarrollo de deformidades en las vértebras parece estar relacionado con el estadio larvario de esta especie y, hasta el momento, no existen reportes de cómo la vit A puede afectar el desarrollo normal de su estadio larvario. El propósito del presente estudio, por tanto, fue el de examinar los efectos de vit A, RA y β-caroteno (βC) en el desarrollo normal del estadio larvario temprano del pargo rojo.

Materiales y métodos

Se obtuvieron huevos fertilizados de pargo rojo C. major de una granja de crianza privada en la Prefectura de Kumamoto (Japón), que fueron transportados al Laboratorio de Producción Marina Kamoike (Facultad de Pesquerías, Universidad de Kagoshima). Los huevos se colocaron en un tanque de 500 L, con aireación continua, un flujo de agua de 100-120 mL min^-1 y temperatura del agua de 17-18°C, hasta que eclosionaron. A partir de los tres días después de eclosionar y hasta el inicio del experimento, las larvas se alimentaron tres veces al día con el rotífero Brachionus plicatilis (longitud de la lórica de 100-150 μm). Los rotíferos se mantuvieron en Chlorella concentrada (Fresh Chlorella V-12, Chlorella Industry Co. Ltd., Tokyo, Japón). Antes de ser añadidos a las larvas, los rotíferos se enriquecieron de 6 a 8 horas con ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) utilizando Aqualene (Takeda-Kagakushiryo, Tokyo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La composición basal de las micro dietas aglutinadas (MBD) consistió de 25% (w/w) caseina libre de vitaminas (Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón), 10% harina de pescado, 10% de harina de krill y 10% de harina de calamar (todas de Nippon Suisan Kaisha Ltd., Tokyo, Japón). Los lípidos de las harinas fueron eliminados con dietiléter utilizando un extractor Soxhlet. Se agregó aceite de hígado de calamar (Riken Vitamin, Tokyo, Japón) al 5%, lecitina de frijol de soya (Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón) al 3% y n-3 HUFA al 1%. Se agregó dextrina (Kanto Chemical Co., Tokyo, Japón) al 6.7%, mientras que las mezclas de vitaminas y minerales (Hernandez et al. 2004) se agregaron al 5% cada una. También se utilizó una mezcla de atrayentes (0.2% de betaina y 0.1% de inosin-5'-monofosfato), así como zeina (Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón) como aglutinante al 8%, y se agregó un rellenador (α-celulosa 11%, Sigma Chemical Co., St. Louis USA) para ajustar las dietas al 100%. En total se prepararon nueve dietas diferentes, que fueron suplementadas con palmitato de vit A (VAP), RA y βC. Se agregó VAP (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japón) hasta proveer concentraciones de 2.7, 27 y 165 mg/100 g de dieta (270, 2,700 y 16,5000 IU vit A/100 g dieta, respectivamente); βC (Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón) a razón de 1, 9 y 50 mg/100 g dieta, mientras que el all-trans-RA (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) se agregó a razón de 2.8, 28 y 166 mg/100 g dieta. Las concentraciones analizadas se muestran en la tabla 1. Las MBD se prepararon de acuerdo con Teshima et al. (1982) y Kanazawa et al. (1989) y, después de prepararlas, se pulverizaron y cirnieron en partículas con un rango de entre 125 y 180 μm. Las dietas se almacenaron a -24°C hasta su uso.

Prueba de alimentación

Al inicio de la prueba de alimentación, se transfirieron larvas de cinco días después de eclosionar con una longitud total (TL) de 3.11 ± 0.25 mm (promedio ± error estándar) y un peso seco medio de 20 ± 0.1 μg del tanque stock a los tanques experimentales (tanques circulares de polietileno de 30 L de capacidad conteniendo 25 L). En cada tanque se colocaron quinientas larvas y cada MDB se administró a un grupo triplicado de tanques. También se montó un grupo control alimentado exclusivamente con rotíferos. Las dietas (0.6 mg larva^-1 día^-1) se dieron 15 veces por día, cada 30 min durante la mañana (de las 7:30 a las 12:00 h) y cada hora durante la tarde (de las 13:00 a las 17:00). Cada tanque recibió rotíferos como suplemento (aproximadamente 200 rotíferos larva^-1 día^-1) alimentados exclusivamente con Chlorella cada mañana (7:00) y tarde (17:00). Vit A no fue detectada en las muestras de estos rotíferos. Los rotíferos utilizados para alimentar el grupo control fueron enriquecidos con Aqualene durante 6-8 h antes de alimentar a las larvas. Los rotíferos (900-1000 rotíferos larva^-1 día^-1) se sumininstraron a cada tanque tres veces por día a las 7:00, 12:30 y 17:00 h. El contenido de vit A (como retinol total) en estos rotíferos fue de 55 ± 3.5 IU g^-1 en base seca.

Durante la prueba de alimentación, el agua bombeada desde la Bahía de Kagoshima, Kagoshima (Japón), se pasó a través de un filtro de grava y antes de agregarse a los tanques, se filtró de nuevo a través de filtros de cartucho de 100 y 30 μm (Tocel, Advantec Inc., Tokyo, Japón). El flujo de agua en cada tanque fue de 100-120 mL min^-1, con aireación continua (100 mL de aire min^-1). La temperatura del agua fue de 20.0 ± 0.7°C (promedio ± SD), el pH de 8.0 ± 0.1, la salinidad de 34 ± 0.5%o y el oxígeno disuelto de 5.9 ± 0.1 mg L^-1. Todos los tanques se mantuvieron en ciclos de 11 h luz y 13 h oscuridad. Diariamente se sifoneó el fondo de los tanques y se contó el número de larvas muertas, ajustando la cantidad de MBD en consecuencia. La prueba de alimentación se realizó por un periodo de 15 días.

El desempeño de las larvas con cada MBD se valoró por peso final (FBW), ganancia en peso (WG), longitud total (TL) e incidencia de deformidades. Por tanto, al final de la prueba de alimentación, las larvas fueron anestesiadas con 10 mg L^-1 de Eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol, Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón). Se seleccionaron 30 larvas de cada tanque al azar para la medición de TL, utilizando un proyector de imagen (Profile Projector PJ-250, Mitsutoyo, Tokyo, Japón) junto con un calibrador digital (tipo CD-15C, Mitsutoyo, Tokyo, Japón), y después se fijaron en formol amortiguado al 10% para su posterior tinción. Las larvas remanentes se juntaron y se liofilizaron para medir el peso corporal (BW) con una microbalanza electrónica (Shimadzu PMB-1, Kyoto, Japón) y para los análisis de RA.

Técnica de tinción y deformidades del cuerpo

Las larvas se tiñeron utilizando la técnica de doble tinción con azul alcian y rojo de alizarina para hueso y cartílago (Kawamura y Hosoya 1991). Durante la inspección del cuerpo se utilizaron las descripciones de Matsuoka (1985, 1987) para determinar el estadio de desarrollo y número de vértebras. La columna vertebral se dividió en cuatro regiones con base en los caracteres morfológicos distintivos de las vértebras (Boglione et al. 2001): dos cefálicas (1ra y 2da), ocho pre-hemales (3ra a 10a), once hemales (11a a 21a) y tres caudales (22da a 24ta). El número de vértebras se determinó por el número de segmentos en las notocordas y los arcos. El tamaño de las vértebras o segmentos se evaluaron midiendo éstas y la distancia entre los arcos. Las deformidades se determinaron de acuerdo con las descripciones de Takashima (1978) y Boglione et al. (2001).

Análisis químicos

Los contenidos de proteína cruda y cenizas de las dietas se analizaron con los métodos de la AOAC (1990), el de lípidos con el método de Bligh y Dyer (1959), y los de vit A (cuantificado como retinol total), RA y βC, mediante cromatogafía líquida de alto desempeño (HPLC) con reactivos de grado HPLC. El retinol total en las dietas se extrajo con la técnica de saponificación con KOH etanólico y se cuantificó con los métodos reportados por Estevez y Kanazawa (1995). El sistema HPLC consistió de una bomba (LC-3A Shimadzu Corp. Tokyo, Japón), un detector UV en 325 nm (SPD-6A, Shimadzu Corp. Tokyo, Japón), un procesador de datos (Chromatopac C-R7Ae-plus, Shimadzu Corp. Tokyo, Japón) y una columna (Shimpack CLC-SIL 4.6 x 150 mm, Shimadzu Corp., Tokyo, Japón) de sílica (diámetro de partícula = 5 μm). Se utilizó hexano-isopropanol (95:5) como fase móvil (1 mL/min y all-trans-retinol, 95%, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) como estándar externo. El βC en las dietas se extrajo y cuantificó con los métodos reportados por Eitenmiller y Landen (1999). El sistema HPLC fue similar al utilizado para el retinol total, pero el detector de UV se utilizó en 436 nm, y se usó también una columna Cosmosil SC18-MS (Nacalai Tesque Inc., Tokyo, Japón). Se utilizó un flujo de 2 mL min^-1 de acetronil: metanol:etil acetato (88:10:2) como fase móvil y β-caroteno (80%, Wako Pure Chemicals Ind., Osaka, Japón) como estándar externo. El RA en las dietas y larvas se extrajo con etanol, como lo reportan Eitenmiller y Landen (1999). El sistema HPLC fue el mismo utilizado para el βC, pero con el detector en 370 nm y una fase móvil de hexano:isopropanol (95:5). Se usó el all-trans-ácido retinoico (97%, Wako Pure chemicals Ind., Osaka, Japón) como estándar externo. Debido al tamaño de la muestra, el contenido de RA se determinó sólo en el cuerpo de las larvas.

Análisis estadístico

Tanto FBW, WG, TL, tasa de supervivencia, incidencia de deformidades en las vértebras, porcentaje de vértebras afectadas en cada región como contenido de RA en las larvas de los grupos experimentales se evaluaron utilizando ANOVA de una variable (paquete super-ANOVA, Abacus Concepts, Berkeley, USA). Las diferencias significativas se evaluaron con la prueba nueva de Duncan de rango múltiple (Steel y Torrie 1980), determinando la significancia estadística de las diferencias a un nivel de 5% (P < 0.05) para cada grupo de comparaciones.

El grupo control mostró FBW y WG significativamente más altos que los grupos experimentales (tabla 2). También el valor más alto de TL se observó en el grupo control, pero sólo se observaron diferencias significativas cuando éste se comparó con los grupos alimentados con las dietas βC-2, βC-3, RA-2 y RA-3. Entre las larvas alimentadas con las MDB hubo una tendencia en la que los niveles altos de suplementación mostraron los valores más bajos de FBW, WG y TL. Particularmente, las larvas que recibieron las MDB RA-3 y βC-3 mostraron valores significativamente más bajos de FBW y WG que los otros grupos. Ambos grupos también mostraron valores más bajos de TL que los otros grupos alimentados con las MBD. La tasa de supervivencia más baja se observó en las larvas alimentadas con la dieta RA-3. La mortalidad en todos los tanques ocurrió durante los últimos días del experimento. Antes de este periodo, en todos los tanques la tasa de mortalidad fue de menos del 10%.

Durante las observaciones al microscopio, las larvas de los grupos experimentales y control mostraron segmentación de la notocorda, particularmente de la 1ra a la 21ra vértebra (de las zonas cefálica a la hemal). Sólo algunos individuos (27%) en el grupo control presentaron segmentación de las vértebras en la zona caudal. No se observó osificación en las vértebras o en los arcos.

Las anormalidades observadas fueron la compresión o fusión aparente de los segmentos en la notocorda y deformidades en la boca. La compresión/fusión aparente de los segmentos afectó principalmente las vértebras de la zona hemal y, en casos severos, las larvas parecían estar afectadas por lordocis y, por tanto, afectada su longitud total. Las deformidades en la boca tuvieron una incidencia baja en todos los grupos, especialmente el acortamiento de la mandíbula inferior.

La incidencia de al menos una deformidad en al cuerpo de las larvas de pargo rojo aumentó con el incremento de la concentración de cada compuesto (tabla 2), particularmente en los grupos alimentados con RA. Las larvas alimentadas con las MBD βC-3, RA-2 y RA-3 mostraron una incidencia significativamente más alta de deformidades que los otros grupos. Las vértebras afectadas en cada individuo se incrementaron conforme lo hicieron las concentraciones de VAP, βC y RA en las MBD, afectando principalmente en las zonas prehemal y hemal (tabla 3), mientras que la región cefálica no mostró ninguna deformidad en ninguno de los grupos. Particularmente, las larvas alimentadas con dietas con RA mostraron un alto porcentaje de vértebras afectadas, mientras que las larvas alimentadas con la dieta RA-3 presentaron todas las vértebras de la sección hemal con deformidad. Aun cuando las larvas alimentadas con la dieta βC-3 mostraron una alta incidencia de deformidades (similar a las presentadas en las larvas alimentadas con RA, tabla 2), el porcentaje de vértebras afectadas fue bajo (tabla 3).

El contenido de RA de las larvas se muestra en la tabla 3. Las larvas alimentadas con VAP y βC mostraron significativamente menos deformidades las larvas alimentadas con RA. No se detectó RA en las larvas alimentadas con rotíferos. Los contenidos de RA en las larvas se incrementaron con el incremento en los niveles de RA en las dietas, observándose un contenido significadamente más alto en las larvas alimentadas con la dieta RA-3.

Discusión

El rendimiento del crecimiento de las larvas en el grupo control fue comparable a los reportados en otros estudios con larvas de pargo rojo (Kanazawa et al. 1989, Teshima et al. 2004). Tal como lo reportaron Kolkovski et al. (1997) y Kolkovski (2001), el alimento vivo resulta en mejor crecimento que únicamente las micro dietas o una alimentación combinada.

La compresión o fusión aparente de los segmentos en la notocorda observada en las larvas alimentadas con RA es similar a las reportadas en larvas de pargo rojo criadas en granjas (Takashima 1978, Matsuoka 1987, Ogata y Oku 2001), por lo que es posible que la vit A de la dieta juege un papel importante en producir este tipo de anormalidades. De acuerdo con Takashima (1978), la compresión de las vértebras durante la etapa larval es la causa de la condición lordotica en los juveniles de pargo rojo producidos en granjas. Este tipo de anormalidades ha sido asociado con altos niveles de vit A en la dietas de otras especies de peces (Ørnsrud et al. 2002, Cahu et al. 2003).

El efecto del VAP en la incidencia y severidad de las deformidades del cuerpo fue menor al compararlo con los tratamientos con RA. Para producir retinol y su posterior oxidación para producir RA, el VAP necesita ser hidrolizado por enzimas específicas. Las larvas jóvenes carecen de varias enzimas y muchos compuestos les son dificiles de metabolizar (Kolkovski 2001). Es posible que, durante este experimento, enzimas como la lipasa carboxiléster y la lipasa triglicérica pancreática no estuvieran presentes o lo estuvieran en bajas concentraciones. Varios reportes sugieren que el alimento vivo puede contribuir sus propias enzimas digestivas (Kolkovski et al. 1993) o ayudar en la asimilación y proceso de absorción durante la digestión (Kolkovski et al. 1997).

El efecto de PC en las deformidades vertebrales no fue claro durante este experimento, pues sólo la concentración más alta causo una incidencia significativa. El βC es una de las mejores fuentes de vit A para mamíferos (Torrissen 1989), y en peces está reportado que la conversión de βC en vit A depende del tamaño del pez y el nivel de la vit A (Torrissen y Christiansen 1995). Además, varios reportes han mostrado que el βC es convertido pobremente en retinol (y por tanto en RA) en el estadio larvario (Takeuchi et al. 1995, Rønnestad et al. 1998a, b), en comparación con otros carotenoides tales como astaxantina y cantaxantina (Hamre et al. 2005).

Las deformidades causadas por el RA de la dieta en las larvas de pargo rojo son similares a las reportadas en peces producidos en granjas, indicando que el exceso de vit A de la dieta juega un papel importante en el origen de aquellas. El efecto del VAP es similar al del RA, particularmente en las concentraciones más altas, probando que utilizar VAP en micro dietas aumenta la incidencia de deformidades en las larvas de pargo rojo. Sin embargo, todavía se requiere más investigación acerca de cómo el VAP es convertido en RA por las larvas y también sobre los efectos del βC, ya que sólo la concentración más alta de éste produjo incidencia significativa de deformidades.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (Monbukagakusho) de Japón y el apoyo de la UNAM-FES Iztacala de México para esta investigación. También agradecen a Nippon Suisan Co. Ltd. (Japón) su apoyo en la adquisición del ácido retinoico para preparar las micro dietas y los analísis en el HPLC.

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