Microflora de la sardina (Sardina pilchardus) fresca y refrigerada de la costa Atlántica marroquí

Microflora of fresh and ice-stored sardines (Sardina pilchardus) from the Moroccan Atlantic coast

Fatima Elotmani¹, Omar Assobhei¹*, Anne-Marie Revol-Junelles², Jean-Bernard Millière^2,3

¹ Laboratoire de Microbiologie Appliquée et Biotechnologie Faculté des Sciences Université Chouaib Doukkali B.P. 20 24000 El Jadida, Maroc. *E-mail: assobhei@ucd.ac.ma; assobhei@hotmail.com

² Laboratoire Bioprocédés Agro-Alimentaires Institut Polytechnique National de Lorraine Ecole Nationale Supérieure d'Agronomie et des Industries Alimentaires (ENSAIA-INPL) 2 avenue de la Forêt de Haye B.P. 172 54 505 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex, France. ]]> ³ Institut Universitaire de Technologie (IUT) Nancy-Brabois Université Henri Poincaré - Nancy I 54 600 Villers-lès-Nancy, France.

Recibido en octubre de 2003;
aceptado en marzo de 2004.

Resumen

Se muestrearon sardinas (Sardina pilchardus) capturadas en la costa Atlántica marroquí, frente a El Jadida, en febrero, mayo y julio. Todas se estudiaron en fresco, pero las capturadas en julio también se estudiaron tras haber sido mantenidas en hielo durante 10 días. De las muestras en fresco, se aislaron un total de 193 cepas bacterianas, a partir de músculo, piel, branquias y vísceras. De las refrigeradas, en cambio, se aislaron un total de 122. En todas las muestras predominaban las bacterias Gram negativas, siendo los más frecuentes los géneros Moraxella, Acinetobacter, Psychrobacter, Pseudomonas, Shewanella y Flavobacterium. Entre las Gram positivas se identificaron Staphylococcus, Micrococcus y bacterias corineiformes. No se encontró variación con respecto al mes de muestreo. El almacenaje en hielo favoreció el desarrollo de Pseudomonas como flora dominante, seguida por la especie Shewanella putrefaciens. El estudio señala a Pseudomonas como contribuyente a la alteración de las sardinas tras mantenerlas en hielo durante 10 días.

Palabras clave: Sardina pilchardus, fresca, hielo-almacenada, microflora, costa atlántica marroquí.

Abstract

Key words: Sardina pilchardus, fresh and ice storage, bacterial microflora, Moroccan Atlantic coast.

Introducción

La microbiología de sardinas frescas y refrigeradas ha sido objeto de varios estudios en los últimos años (Gram et al., 1987; El Marrakchi et al., 1990; El Marrakchi et al., 1992; Ababouch et al., 1996; Gennari et al., 1999). El pescado está sujeto a una rápida alteración por acción microbiana, cuya tasa de descomposición depende de varios factores tales como condiciones de almacenaje y factores intrínsecos de los especimenes como edad y tamaño, contenido en grasa, alimentación y estado fisiológico, composiciones cualitativa y cuantitativa de la microflora inicial asociada al ambiente de procedencia, estación del año, arte de pesca y procesado inicial del pescado (Murray y Shewan, 1979; El Marrakchi et al., 1992; Gennari et al., 1999). Es de aceptación generalizada que la alteración del pescado marino tiene como causa principal el crecimiento bacteriano (Liston, 1980; Gram y Huss, 1996). La composición de la flora bacteriana está también relacionada con los factores previamente mencionados. En los peces vivos y sanos, los microorganismos pueden encontrarse en la piel, branquias y vísceras. La degradación bacteriana de componentes solubles de bajo peso molecular produce metabolitos volátiles que son las sustancias responsables del olor y sabor desagradables que conducen al rechazo sensorial del pescado (Ababouch et al., 1996).

En 2000 la sardina (Sardina pilchardus) representó cerca de 80% del pescado capturado en aguas marroquíes. A escala mundial, Marruecos es el principal productor y exportador de esta especie (representando el 47% de la producción mundial en 1997). Los valores nutricional y económico de esta especie son de gran importancia ya que satisface las necesidades nacionales de pescado fresco y porque corresponde a la mayor parte del pescado exportado en conserva. El objetivo de este trabajo fue la identificación de la naturaleza de la flora bacteriana de las sardinas frescas y refrigeradas de la costa marroquí, como parte de un programa de estudios de la capacidad de preservación del pescado a través del uso de bio-preservativos. Los resultados obtenidos en este trabajo serán comparados con otros disponibles para otras especies de pescado.

Material y métodos

Muestreo y almacenaje

Las sardinas fueron pescadas en las aguas frente a la ciudad de El Jadida (costa atlántica marroquí, 33°-33°16'09"N, 8°30'-8°45'W). Se efectuaron seis ensayos con las muestras obtenidas: cuatro en febrero y mayo de 1999 y dos en julio de 2001. Cada muestra fue de 5 kg de pescado. Después de recolectadas las sardinas se transportaron al laboratorio en contenedores refrigerantes, en los que se mantuvieron a aproximadamente 4°C con hielo troceado durante un total de 8 h. A su llegada al laboartorio se eligieron aleatoriamente muestras de 5 pescados que fueron inmediatamente sometidas a análisis microbiolócos.

Análisis bacteriológicos

Se analizaron por separado 25 g de branquias, vísceras y músculo dorsal obtenido con piel. En los pescados recolectados en julio solamente se analizaron muestras de músculo dorsal con piel. Las muestras se homogeneizaron en condiciones de asepsia, en 225 mL de caldo de sal de triptona estéril (TS), usando un homogeneizador del tipo Ultra-Turax. Después se procedió a una serie de diluciones a 1/10 en TS. La siembra de placas e incubación se realizó de acuerdo con El Marrakchi et al. (1990), excepto en el caso de la flora productora de sulfuro (SPF) que, después de incubada a 25°C durante 3 d, se observó en Agar Hierro con suplemento de cisteína según el formulado por Gram et al. (1987). Los conteos de flora mesófila aerobia total (TMAF) y flora psicrofila aerobia (PF) se ejecutaron en Agar para Conteo en placas (PCA) (Biokar, Beauvais, France) incubadas a 30°C durante 3 d y a 4°C durante 10 d, respectivamente. La flora moderadamente halófila (MHF) se observó con PCA rehidratado con agua de mar esterilizada después de incubarse a 25°C durante 5 d. La flora enterobacteriana (EF) se contó usando Agar de MacConkey (Biokar) incubado a 37 °C durante 24 h. Se añadió 1 ml de la dilución apropiada en placas por duplicado, excepto para EF cuyos conteos se determinaron en placas de difusión. Después de la incubación, se recolectaron aleatoriamente 10% de colonias bacterianas, de las placas de mayor dilución que presentaban crecimiento.

Mantenimiento de las cepas bacterianas

Los aislados fueron mantenidos en Agar Nutritivo inclinado (Biokar), excepto los de MHF cuyo Agar Nutritivo se preparó con agua de mar. Todos los aislados se almacenaron a 4°C hasta que fueron usados.

Identificación de los aislados

Las reacciones y pruebas bioquímicas realizadas fueron: reacción de Gram, oxidasa, presencia de catalasa con H₂O₂ al 3%, observaciones microscópicas de forma y determinaciones de mobilidad. El metabolismo de la glucosa se investigó a través del test O/F en medio de Hugh y Leifson (Biomérieux) y de la produción de H₂S en Agar Hierro de Kligler (Biomérieux). Los medios de identificación de MHF se rehidrataron con agua de mar esterilizada. Las cepas se identificaron inicialmente según Dainty et al. (1979). Posteriormente la identificación se efectuó a través de los kits API 20E, API NE, Api Staph para las Micrococcaceae y API 50 CHB para las cepas de Bacillus (API System, Montolieu-Vercieu, France).

Resultados

Flora bacteriana de las sardinas frescas recolectadas en febrero y mayo

En las sardinas frescas los niveles iniciales de los cinco tipos de microflora analizados fueron siempre significativamente inferiores al limite de 10⁶-10⁷ CFU g^-1 recomendado por el ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) (tabla 1). Las branquias fueron el órgano más afectado, seguidas de las vísceras. Los niveles bacterianos encontrados en el músculo fueron de 3.5, 3.8, 2.5, y 1.3 log CFU g^-1 para la flora TMAF, MHF, PF y EF, respectivamente. La SPF, detectada solamente en las branquias, constituyó una baja proporción de la flora inicial del pescado.

Se identificaron un total de 193 cepas (73 TMAF, 48 MHF, 44 PF, 16 SPF y 12 EF), pertenecientes a 17 géneros. Las bacterias Gram-negativas (138 aislados) estuvieron representadas por 12 géneros, de los cuales los predominantes fueron Acinetobacter sp. con 26 aislados, Pseudomonas sp. con 21, Flavobacteria sp. con 19, y Vibrio sp. con 18. La flora Gram-positiva (55 aislados) estuvo representada predominantemente por Staphylococcus con 30 aislados y por Micrococcus sp. con 19 aislados (tabla 2).

Flora bacteriana de las sardinas frescas recolectadas en julio

En el dia 0, los conteos de bacterias en las sardinas fueron de 3.6, 3.1, 3.6 y 2.1 log CFU g^-1 para TMAF, PF, MHF y SPF, respectivamente (tabla 1). De la flora inicial de las sardinas frescas se aislaron 22 cepas Gram-positivas y 40 Gram-negativas (tabla 2). La composición fue semejante a la descrita para el músculo de las sardinas frescas recolectadas en febrero-mayo. Sin embargo, las proporciones de Shewanella putrefaciens, Micrococcus sp. y Staphylococcus sp. presentaron valores más altos en los ensayos de julio, mientras que las de Acinetobacter sp., Flavobacterium sp, E. coli, Vibrio alginolyticus y A. salmonicida fueron más altas en los ensayos de febrero-mayo.

Evolución de la flora de las sardinas recolectadas en julio

Los datos de los conteos de bacterias efectuados durante el almacenaje en hielo se presentan en la figura 1. En este período los valores límite de 10⁶-10⁷ CFU g^-1 se alcanzaron a los 10 días en la SPF, mientras que en la TMAF y PF estos valores se alcanzaron a los 8 días de almacenaje. Para toda la microflora en general, el crecimiento fue detectado a partir del tercer día de almacenaje. La TMAF incrementó de 3.6 a 8.6 log CFU g^-1. Los conteos en PCA fueron significativamente más bajos que los obtenidos en Agar Hierro. La PF incrementó de 3.1 a 8.5 y la SPF de 2.1 a 7.6 log CFU g^-1, en 10 d (figura 1).

Al final del almacenaje en hielo las bacterias Gram-negativas constituían cerca de 90% de la flora total (tabla 2). Ps. fluorescens era la especie predominante con 33% del total de aislados, seguida de Sh. putrefaciens con 23% del total de aislados; otras especies de Pseudomonas representaban 18.3%. Las SPF estuvieron representadas casi exclusivamente por la especie Sh. putrefaciens (tabla 3).

En peces vivos y sanos el músculo normalmente no presenta microorganismos. Es de resaltar que la contaminación del músculo del pescado empieza en las horas siguientes a su captura. Los conteos iniciales de las diferentes poblaciones de microflora estudiadas fueron semejantes a los obtenidos en pescados de aguas frías, aunque bastante más bajos que los obtenidos en pescados tropicales, cuyos conteos alcanzaron 10⁹-10¹⁰ CFU g^-1 (Gram, 1989, en Ababouch et al. 1996). El Marrakchi et al. (1990) registraron niveles idénticos en sardinas recolectadas en la costa de Agadir. La contaminación bacteriana relativamente baja en las vísceras puede ser un indicador de un período de alimentación reducido (Huss, 1988). En nuestro estudio la SPF constituyó una baja proporción de la flora inicial del pescado; sus niveles estuvieron por debajo de los descritos en trabajos anteriores (Huss, 1988; El Marrakchi et al., 1990; Ababouch et al., 1996). La composición de la microflora del músculo, con relación a la reacción de Gram, fue distinta a la observada por El Marrakchi et al. (1992). En nuestro estudio las bacterias Gram-negativas fueron siempre predominantes en la flora inicial de los ensayos de febrero-mayo y en los de julio, en agua de mar a temperatura de 16°C y 18°C, respectivamente.

En las sardinas de la costa de Agadir, El Marrakchi et al. (1992) observaron una escasa predominancia de bacterias Gram-positivas, principalmente Staphylococcus sp., Micrococcus sp. y bacterias corineiformes, mientras que la flora Gram-negativa estuvo representada predominantemente por Escherichia coli, Vibrio fuvialis, Aeromonas hydrophila, Acinetobacter anitratus, Moraxella spp. y Flavobacterium multivorum. Así, el sitio de recolección influye en la frecuencia de aislamiento de las diferentes especies de flora del pescado, pero no en su composición cualitativa. De esta manera se pudo observar un alto nivel de similaridad entre la composición cualitativa de bacterias iniciales de sardinas frescas cogidas en la costa atlántica marroquí, y de sardinas procedentes de otras áreas como el Mar Adriático (Gennari y Tomaselli, 1988; Gennari et al., 1999).

Elementalmente, el perfil bacteriológico de las sardinas frescas de la costa atlántica marroquí, se asemeja a lo descrito para muchos otros pescados de aguas frías y templadas, en los que las bacterias Gram-negativas psicotróficas no-fermentativas (pseudomonas, flavobacteria,...) eran predominantes y las bacterias Gram-positivas eran menos abundantes (Gram et al., 1987; El Marrakchi et al., 1992; Gennari et al., 1999).

Se encontró un gran número de bacterias (10⁷-10⁸ g^-1) en pescado alterado (con olor desagradable) en el período final del almacenaje en hielo, corroborando las observaciones de otros autores; es de aceptación común que para que se induzca la producción de olores y sabores desagradables, los conteos de bactérias suelen ser del orden de los 10⁷ g^-1 o superiores (Jorgensen et al., 1988; Koutsoumanis et al., 1999). Sin embargo, sólo una parte de estas bacterias pueden clasificarse como alteradoras activas (Gram et al., 1987).

El Agar para Conteo en Placas (PCA) sigue siendo el sustrato más usado para la determinación de los conteos de bacterias totales. Sin embargo, los análisis de pescado fresco y refrigerado mostraron que la utilización de una peptona de agar enriquecida, como el Agar Hierro (IA) (Gram et al., 1987), produce conteos significantemente más altos cuando todas las colonias se cuentan. Este hecho concuerda con las observaciones de Gram (1992). En PCA, los conteos de TMAF fueron subestimados, así que se sugiere la utilización de IA para la cuantificación de este tipo de flora.

La dominancia de bacterias Gram-negativas psicotróficas (Pseudomonas sp. y Sh. putrefaciens) en el período final del almacenaje en hielo, fue también registrada por Gennari and Tomaselli (1988) para sardinas del mar Adriático. Semejante evolución no se describe en las sardinas recolectadas en la costa de Agadir (El Marrakchi et al., 1992). En ese estudio, Sh. putrefaciens fue la flora dominante (22.7% de la microflora total, al final del almacenaje) seguida de Proteus mirabilis y de las bactérias corineiformes (18,7%) y Ps. fluorescens fue aislada en baja cantidad. En otro estudio con sardinas de la costa atlántica marroquí, Ababouch et al. (1996) observaron una incidencia más baja de Sh. putrefaciens (2-10%). Varios estudios también demuestran que esta cepa fue la predominante en el período final de almacenamiento en frío de pescado marino de aguas frías y templadas (Gram et al., 1987). El presente trabajo indica que la proliferación de bacterias no productoras de H₂S, como Pseudomonas, contribuye probablemente a la alteración de las sardinas de la costa atlántica. La interacción microbiana parece ser el factor más importante en el desarrollo de la flora responsable por la alteración del pescado (Gram y Melchiorsen, 1996); la fuerte actividad anti-Shewanella encontrada entre los aislados de Pseudomonas sp. de pescado tropical refrigerado que presenta alteración puede explicar parcialmente por qué las Pseudomonas sp. se tornaron dominantes a lo largo del almacenaje en hielo (Gram, 1993).

Es necesaria más investigación para la caracterización del potencial de alteración de las bactérias aisladas, y para estudiar la potencial actividad inhibidora de las cepas de Pseudomonas sp. sobre la microflora de las sardinas, en especial sobre Sh. putrefaciens.

El enfriamiento y la refrigeración mecánica no son procedimientos suficientemente adecuados para proteger el pescado contra la acción de la alteración microbiana. La incorporación de varias técnicas, como el uso de conservadores alimenticios, a la refrigeración (Leistner y Gorris, 1995) podría constituir una ventaja adicional en el control de la alteración del pescado por acción microbiana.

Este trabajo fue financiado por becas concedidas por la Coopération Franco-Marocaine, REMER (Réseau National des Sciences et Techniques de la Mer) y por el Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Formation des Cadres et de la Recherche Scientifique (PROTARS II-P1T1/37).

Referencias

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