Evaluación de la concentración de oxitetraciclina en tejidos de camarón suministrada a través de nauplios de Artemia y de un baño medicado

Evaluation of oxytetracycline concentration in shrimp postlarval tissues offered through Artemia nauplii and medicated bath

A. Roque^1,2*, C. Cuenca¹, A. Espinosa³, C. Bermúdez³, C. Bolan¹ y B. Gómez-Gil¹

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo Laboratorio de Bacteriología de Crustáceos Sabalo Cerritos, s/n Mazatlán, Sinaloa, México.

³ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo Laboratorio de Residuos Tóxicos Carr. a la Victoria, Km 0.6 Hermosillo, Sonora, México.

Recido en abril del 2003;
aceptado en noviembre de 2003.

Resumen

En México, la oxitetraciclina es comúnmente aplicada en los sistemas de cultivo larvario de camarón para controlar problemas bacterianos. Sin embargo, no se sabe cuánta oxitetraciclina es incorporada por los camarones. El objetivo del presente estudio fue medir los niveles de oxitetraciclina incorporados por postlarvas de Litopenaeus vannamei, ofrecida por dos rutas diferentes, bioencapsulada en nauplios de Artemia franciscana y aplicada directamente en agua de mar. Se hicieron cinco tratamientos: Postlarvas medicadas a través de un baño convencional (20 ppm) y alimentadas con nauplios de Artemia (BAÑO), postlarvas alimentadas con nauplios de Artemia enriquecida con oxitetraciclina (19 mg comida^-1) y Rich®, una mezcla comercial de lípidos (R-OTC), postlarvas alimentadas con nauplios de Artemia enriquecida con oxitetraciclina (19 mg comida^-1) (OTC), postlarvas alimentadas con nauplios de Artemia enriquecida con Rich® (RICH) y postlarvas alimentadas con nauplios de Artemia (control). Los tratamientos se aplicaron por 7 días y diariamente se muestrearon postlarvas de todos los tratamientos para medir los niveles de oxitetraciclina incorporados usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La más alta incorporación de oxitetraciclina en los camarones fue con el tratamiento BAÑO. Los valores no variaron mucho día con día ni entre tratamientos. El Rich^® mejoró la cantidad de oxitetraciclina incorporada por los camarones. El día 7 las concentraciones de oxitetraciclina medidas en los diferentes tratmientos fueron: OTC, 5.77 ± 0.6 µg g^-1; R-OTC, 18.98 ± 2.8 µg g^-1; y BAÑO, 26.3 ± 8.1 µg g^-1 de extracto de camarón. Se recomienda ofrecer al menos 4 veces la concentración mínima inhibitoria (CMI), para lograr concentraciones terapéuticas en los organismos a ser tratados. Los resultados del análisis cromatográfico en el cuerpo de los camarones mostraron que se alcanzaba 0.15 de la CMI (303.98 µg mL^-1) reportada y para el tratamiento más alto. La oxitetraciclina es hidrosoluble y posiblemente su bioencapsulación, para lograr valores terapéuticos, no sea posible. En cuanto al baño medicado, se requiere una concentración más alta para lograr valores terapéuticos en los tejidos de camarón.

Palabras clave: oxitetraciclina, camarón, Litopenaeus vannamei, HPLC.

In Mexico, oxytetracycline is commonly applied to shrimp larval rearing systems to control bacterial problems; however, it is not known how much oxytetracycline is incorporated by the shrimp. The present study aimed to measure the levels of oxytetracycline incorporated by Litopenaeus vannamei shrimp postlarvae offered by two different administration routes: bioencapsulated in Artemia franciscana nauplii and applied directly in the seawater. Five treatments were used: postlarvae medicated through conventional bath (20 ppt) and fed Artemia nauplii (BATH), postlarvae fed Artemia nauplii enriched with oxytetracycline (19 mg meal^-1) and Rich^®, a commercial lipid mix (R-OTC), postlarvae fed Artemia nauplii enriched with oxytetracycline (19 mg meal^-1) (OTC), postlarvae fed Artemia nauplii enriched with Rich^® (RICH), and postlarvae fed with Artemia nauplii (control). Treatments were applied for seven days and postlarvae from each treatment were sampled daily to measure the levels of oxytetracycline incorporated through high performance liquid chromatography (HPLC). Higher incorporation of oxytetracycline in the shrimp was found in the BATH treatment. Values did not vary much among days within the treatments. Rich^® improved the amount of oxytetracycline incorporated by the shrimp. By day 7, the mean antibiotic determinations were as follows: OTC, 5.77 ± 0.6 µg g^-1; Rich® + OTC, 18.98 ± 2.8 µg g^-1; and BATH, 26.3 ± 8.1 µg g^-1 of shrimp extract. An antibiotic dose of 4 times the minimum inhibitory concentration (MIC) is recommended in order to achieve therapeutic doses in the organisms to be treated. The results from the chromatography analysis on the shrimp body showed that only 0.15 of the MIC (303.98 µg mL^-1) reported was in fact detected in the shrimp in the highest treatment. Oxytetracycline is water-soluble, and perhaps its bioencapsulation for treatment purposes is not feasible. As for the medicated bath, a higher concentration is required to achieve a therapeutic dose in the shrimp tissues.

Key words: oxytetracycline, shrimp, Litopenaeus vannamei, HPLC.

Introducción

En México, uno de los antibióticos mas usados en la industria camaronícola es la oxitetraciclina (Roque et al., 2001). En larvicultura, los antibióticos son generalmente administrados en el agua; sin embargo, esta ruta de suministro conlleva pérdidas de antibiótico y posiblemente el desarrollo de resistencia en ambas bacterias, blanco y no blanco. En America Latina los camaronicultores usan principalmente el camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) (FAO, 2002).

Una ruta alternativa de suministro de antibiótico a organismos acuáticos puede ser a través del alimento. Los antibióticos se pueden suministrar encapsulados en alimento vivo (bioencapsulación), aumentando así la eficacia de suministro (Chair et al., 1991). La factibilidad de esta técnica se ha investigado en peces (Cherel y Nin, 1991) y camarones (Mohney et al., 1990). Gómez-Gil et al. (2001) sugieren cuánto antibiótico debe ser ofrecido a los nauplios de Artemia durante 4 h, periodo de tiempo que se estableció como adecuado en el mismo estudio.

Sin embargo, a la fecha, no se sabe si las postlarvas de camarón logran realmente incorporar los antibióticos y, en caso de hacerlo, si la cantidad incorporada es terapéutica ya sea cuando el antibiótico es ofrecido en el alimento o aplicado directamente en el agua (Roque y Gómez-Gil, 2003).

El objetivo de este estudio fue comparar dos rutas de suministro de oxitetraciclina a postlarvas de camarón blanco L. vannamei: bioencapsulación, utilizando nauplios de Artemia como vehículo, y un baño medicado. También se evaluó si los niveles incorporados en las postlarvas tenían valor terapéutico.

Organismos experimentales

Se descapsularon quistes de Artemia franciscana, Kellog 1906 (INVE, Belgica) (3.2 g día^-1) de acuerdo con el protocolo propuesto por Sorgeloos et al. (1977). Los huevos se incubaron en 1.8 L de agua de mar, aireándose fuertemente y con intensa

Roque et al.: Evaluación de la concentración de oxitetraciclina en tejidos de camarón luz artificial. Los nauplios se cosecharon a las 24 h, y se dividieron en cuatro grupos: uno se enriqueció con Rich® (1.28 g), una emulsión lipídica comercial mezclada en 800 mL de agua de mar, y otro grupo se enriqueció con Rich^® (1.28 g) y oxitetraciclina (Sigma Chemical Co., EUA) (1.024 g), mezclados en 800 mL de agua de mar con una concentración final de 1.28 mg mL^-1; otro grupo se enriqueció con oxitetraciclina mezclada en 800 mL de agua de mar dando una concentración final de 1.28 mg mL^-1; y el último grupo se dejó en 800 mL de agua de mar limpia. Los cuatro grupos se incubaron 4 h más antes de ser ofrecidos a las postlarvas de camarón.

Se adquirieron postlarvas 6 de L. vannamei de un laboratorio de producción de postlarvas en Sinaloa, México, se aclimataron a un sistema de recirculación de 400 L de capacidad y se alimentaron con nauplios de Artemia no medicados. Cuando las postlarvas alcanzaron un peso aproximado de 0.046 g se usaron en el experimento.

El número de nauplios consumido por postlarva se estimó, alimentando ad libitum tres postlarvas, colocadas individualmente en recipientes de 0.5 L con un número conocido de nauplios de Artemia por 24 h. Después de este periodo se contaron los nauplios de Artemia sobrevivientes. Los nauplios de Artemia se contaron cosechándolos de cada frasco, individualmente en 10 mL de agua de mar limpia, y fijándolos con 5 mL de alcohol etílico (96x). Los nauplios se tomaban del fondo del recipiente donde estaban fijados y sedimentados, en pequeñas gotas con una pipeta Pasteur, y se colocaban sobre un porta objetos. Todos los nauplios se colocaron sobre el porta objetos, se contaron y, al final, su número se sumó para tener un conteo total por frasco.

Análisis de oxitetraciclina por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés)

Las postlarvas se recolectaron de los acuarios, se enjaguaron con agua destilada, se envolvieron en aluminio y se almacenaron a -80°C, hasta su análisis.

Los análisis cromatográficos siguieron la metodología de Bermúdez-Almada et al. (1999), adaptada de Long et al. (1990) con modificaciones mínimas. Las muestras (0.5 g) se pasaron a un mortero de vidrio. Se les añadió sílica C₁₈ (2 g; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) con tamaño de partícula de 15 a 40 µm, 0.05 g de EDTA (etiléndiaminotetraacetato) y 0.05 g de ácido oxálico. La mezcla fue homogeneizada con la mano del mortero. La pasta formada se pasó por una jeringa con papel filtro en el extremo inferior para formar una columna. La matriz de la columna fue comprimida a 4.5 mL y se pasaron dos volúmenes de 8 mL de hexano. La oxitetraciclina fue extraída con dos porciones de 8 mL de acetonitrilo-metanol (1:1 v/v) conteniendo 0.06% de BHA (butil-hidroxi-anisol, Sigma) y BTH (butil-hidroxi-tolueno, Sigma). El extracto se evaporó hasta que se secó en un baño maría a 40°C, bajo flujo de aire. El residuo fue diluido en 1 mL de fase móvil y sonicado (Cole Parmer 8892) 45 min hasta suspensión. La solución fue centrifugada 10 min a 17000 x g. El sobrenadante se pasó por un filtro de membrana de nylon de 0.45 | m. Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de líquidos (Varian 9010, Sunnyvale, CA) equipado con un detector ultravioleta-visible (Varian 9050) a 365 nm. La muestra inyectada se extrajo con un flujo isocrático de ácido oxálico:acetonitrilo:metanol (70:27:3 v/v/v) a 1 mL min^-1 en un columna de fase reversa con C18 (5 µm, 4.6 x 250 mm, Alltech Associates, Inc., Deerfield, IL). La oxitetraciclina en las muestra se identificó por comparación del tiempo de retención con el del estándar. Todas las muestras se corrieron por duplicado.

Protocolo experimental

• R-OTC, postlarvas alimentadas ad libitum durante 4 h, con nauplios de Artemia conteniendo oxitetraciclina y Rich^®.

• RICH, postlarvas alimentadas ad libitum durante 4 h, con nauplios de Artemia conteniendo Rich^®.

• OTC, postlarvas alimentadas ad libitum durante 4 h, con nauplios de Artemia conteniendo oxitetraciclina.

• BAÑO, postlarvas alimentadas ad libitum durante 4 h, con nauplios de Artemia conteniendo Rich^® y medicadas en un baño de oxitetraciclina con 20 mg de oxitetraciclina por litro de agua de mar.

• CTRL, postlarvas alimentadas ad libitum durante 4 h, con nauplios de Artemia no enriquecidos.

Transcurridas las 4 h del periodo de alimentación, se muestrearon ocho postlarvas diariamente de cada acuario y se congelaron a -80°C hasta su análisis por HPLC. Diariamente se realizaron recambios totales de agua en cada acuario retirando la Artemia y los antibióticos no consumidos. El experimento duró siete días y se llevó a cabo dos veces.

Análisis estadísticos

Los promedios de los resultados de cada acuario fueron analizados con una prueba de Kruskal-Wallis después de verificar que no estaban distribuidos normalmente. En los casos en que la prueba de Kruskal-Wallis indicó que había diferencias significativas entre tratamientos, se utilizó la prueba de comparaciones multiples de Dunn (Zar, 1999).

Resultados

Se estimó que las postlarvas consumieron un promedio de 1334 nauplios por día (máximo = 1344, mínimo = 1321).

No se detectó oxitetraciclina en ninguno de los tratamientos CTRL o RICH.

En la primera repetición del experimento, el promedio de oxitetraciclina medida en los tejidos de camarón en el tratamiento OTC fue 8.23 µg mL^-1 con un máximo de 19.05 y un mínimo de 5.6 µg mL^-1 (días 1 y 4, respectivamente). La concentración media de oxitetraciclina en el tratamiento R-OTC fue 15.24 µg mL^-1 y las concentraciones máxima y mínima fueron 22.61 y 9.12 µg mL^-1 (días 3 y 1, respectivamente). Para el tratamiento BAÑO, la concentración media fue de 25.64 µg mL^-1, el máximo y mínimo fueron de 33.67 y 17.66 µg mL^-1 (días 3 y 1, respectivamente). La prueba de Kruskal-Wallis indicó diferencias siginificativas entre los diferentes tratamientos aplicados (H = 28.965; P < 0.001). La prueba de comparaciones múltiples de Dunn indicó que los tratamientos donde se aplicó oxitetraciclina eran significativamente diferentes de los tratamientos donde ésta no se aplicó. Sin embargo, el tratamiento OTC no fue significativamente diferente de ninguno de los otros tratamientos aplicados.

En la segunda repetición del experimento, el promedio de oxitetraciclina medido en el camarón para el tratamiento OTC fue 8.43 µg mL^-1, con un máximo de 14.96 y un mínimo de 3.18 µg mL^-1 (días 3 y 2, respectivamente). La concentración media de oxitetraciclina en el tratamiento R-OTC fue 21.18 µgmL^-1, y las concentraciones máxima y mínima fueron 28.31 y 10.31 µg mL^-1 (días 3 y 6, respectivamente). Para el tratamiento BAÑO, la concentración media fue de 39.73 µg mL^-1, el máximo y mínimo fueron de 43.08 y 14.49 µg mL^-1 (días 3 y 5 respectivamente). La prueba de Kruskal-Wallis indicó diferencias siginificativas entre los diferentes tratamientos aplicados (H = 31.015; P < 0.001). La prueba de comparaciones míltiples de Dunn indicó que los tratamientos donde se aplicó oxitetraciclina eran significativamente diferentes de los tratamientos donde ésta no se aplicó. Sin embargo, el tratamiento OTC no fue significativamente diferente de ninguno de los otros tratamientos aplicados.

En la tabla 1 se presenta un resumen de las concentraciones de oxitetraciclina medidas en el tejido de camarón para todos los tratamientos en los dos experimentos.

Discusión

Los resultados obtenidos en este estudio indican que la oxitetraciclina suministrada a las postlarvas de L. vannamei por siete días tiene poco valor terapéutico, dado que no fue posible lograr la concentración mínima inhibitoria (CMI) para aislados bacterianos frecuentemente asociados con enfermedades bacterianas en camarón, 304.0 µg mL^-1 (SD = 464.8) (Roque et al., 2001). Con el tratamiento BAÑO se logró un máximo de 38.3 µg mL^-1 y, aunque los resultados del baño medicado tradicional (BAÑO) fueron mejores debido a la más alta incorporación de oxitetraciclina en los tejidos del camarón, no se lograron los valores propuestos ni la incorporación fue significativamente mas alta para esta ruta. La CMI reportada por Roque et al. (2001) para bacterias del género Vibrio aisladas a partir de camarón de cultivo (L. vannamei y L. stylirostris) es 304.0 µg mL^-1 y Stamm (1989) propone que la dosis terapéutica a ser usada en acuicultura debe ser cuatro veces la CMI. El valor más alto detectado en este estudio (38.38 µg mL^-1) corresponde a aproximadamente un 4% del valor requerido.

La aparentemente baja incorporación de oxitetraciclina en Artemia puede ser explicada por las condiciones de aireación (Leger et al., 1987). La metabolización del antibiótico no se tomó en cuenta dado que la Artemia sólo estuvo en el sistema de enriquecimiento durante 4 h, y luego fue ofrecida a las postlarvas. La pérdida de antibiótico en los acuarios puede haber contribuido a los bajos niveles encontrados en camarón porque, después de 4 h en agua de mar limpia, la Artemia pierde cerca del 75% de la oxitetraciclina total incorporada (Gómez-Gil et al., 2001) y, así, parte de la Artemia ingerida por las postlarvas hacia el final de las 4 h debe haber tenido muy poco valor terapéutico. Además, la oxitetraciclina es inestable en soluciones acuosas a pH entre 7 y 8.5 (Aiello y Mays, 1998), lo que cubre el pH del agua de mar (aproximadamente 7.9 a 8.2).

Se sabe que los laboratorios mexicanos de producción de postlarvas continúan aplicando oxitetraciclina directamente en el agua (Gómez-Gil et al., 2001), sin embargo, este compuesto es muy soluble en el agua, y en el agua de mar forma sales con los cationes divalentes como Ca²⁺ y Mg²⁺. Varios estudios sugieren que tan sólo el 0.4% de la oxitetraciclina es la proporción biodisponible para los peces (Nouws et al., 1992). Otros estudios reportan proporciones biodisponibles más altas: 5% (Lunestad y Goksoyr, 1990), 1.25% (Nouws et al., 1992) y 7-9% (Cravedi et al., 1987). Por otro lado, en el suministro a través de alimento medicado se presenta el mismo problema porque la oxitetraciclina se liga al calcio de la dieta (Cravedi et al., 1987) haciendo imposible la absorción de ésta a través de la membrana intestinal, debido a que que los complejos de calcio y magnesio no cruzan membranas lipídicas tan eficazmente como la oxitetraciclina libre.

Los resultados de este estudio demuestran principalmente que las dosis de oxitetraciclina usadas en México en la larvicultura de camarón son inadecuadas y que, aunque el protocolo de bioencapsulación usado para la Artemia siguió las recomendaciones de Gómez-Gil et al. (2001), este antibiótico probablemente no contribuye a tratar enfermedades bacterianas del camarón. Dos efectos podrían estar resultando de su uso: (a) durante un brote de enfermedad bacteriana podría estar reduciendo el número total de bacterias presentes en la columna de agua, e indirectamente contribuir a que menos camarones sean afectados por ellas; (b) durante un brote de enfermedad bacteriana podría estar reduciendo el número total de bacterias presentes en la columna de agua y contribuir así a seleccionar bacterias resistentes.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el proyecto SIMAC No. 98016073 y por Maricultura del Pacífico, SA de CV El segundo autor fue becado por CONACYT y CECYT para la realización de este trabajo.

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