Efecto de la contaminación marina sobre la estructura genética poblacional del bivalvo Crassostrea angulata

Effect of marine contamination on the genetic population structure of the bivalve Crassostrea angulata

Ismael Cross y Laureana Rebordinos*

Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias del Mar, Universidad de Cádiz, Polígono Río San Pedro, E-11510 Puerto Real, Cádiz, España. * E-mail: laureana.rebordinos@uca.es

Recibido en diciembre de 2001;
aceptado en marzo de 2003.

Resumen

Se analizaron siete loci alozímicos en tres poblaciones naturales de Crassostrea angulata localizadas en la costa suratlántica de la Península Ibérica. Dos de las poblaciones mostraban distintos niveles de contaminación por metales pesados, mientras que la otra no estaba contaminada y se utilizó como control. Los siete loci se mostraron muy variables en cuanto a número de alelos, nivel de polimorfismo y heterocigosidad media. Los loci Lap y Mdh1 presentaron alelos nulos. Para el hierro se encontró una correlación positiva significativa entre el número de alelos y la concentración que se ajustaba a un modelo de regresión lineal; sin embargo, esta correlación fue negativa para la heterocigosidad, y significativa para el cadmio y el zinc. Los loci Em, Lap, Mdh1 y Xdh mostraron déficits de heterocigotos en todas las poblaciones. Los valores de déficit de heterocigotos (D) fueron estadísticamente significativos entre las poblaciones contaminadas y la control para el locus Mdh1 y muy próximos al nivel de significación para el Em. En el locus Pgm apareció un exceso de heterocigotos en la población control y un déficit, correlacionado con el aumento de niveles de concentración de metales, en los otros dos. Las diferencias entre los valores de D de las tres poblaciones también fueron significativas para este locus. Se obtuvieron relaciones significativas, positivas y negativas entre la concentración de metales y algunos alelos de los loci Em, Lap y Pgm. Además, los genotipos homocigotos de los alelos con valores de correlación positivos fueron seleccionados en las zonas más contaminadas, mientras los heterocigotos eran los más favorecidos en la población control, mostrando un comportamiento adaptativo y corroborando la utilidad de algunos de estos loci como biomarcadores en estudios de dinámica de poblaciones en zonas sometidas a contaminación ambiental.

Palabras clave: ostra, Crassostrea angulata, biomarcadores, poblaciones, alozimas.

Abstract

Seven enzyme loci were analyzed in three natural populations of Crassostrea angulata located on the southern Atlantic coast of the Iberian Peninsula. Two of the populations showed distinct levels of contamination by heavy metals, whereas the third was not contaminated and served as control. These seven loci were shown to be very variable in terms of the number of alleles, polymorphism and average heterozygosity. The Lap and Mdh1 loci presented null alleles. A significant positive correlation was found between the number of alleles and the concentration of iron that was fitted to a model of linear regression. However, this correlation was negative for the heterozygosity, and significant for cadmium and zinc. The Em, Lap, Mdh1 and Xdh loci showed a deficit of heterozygotes in all the populations. The values of heterozygotic deficit (D) were statistically significant between the contaminated populations and the control for Mdh1 and very close to a significant level for Em. In Pgm, a heterozygotic excess appeared in the control population and a deficit, which was correlated to the increased levels of metal concentration, occurred in the other two populations. The differences between the D values of the three populations were also significant in this locus. Positive, negative and significant relationships were obtained between the concentration of metals and some alleles of the Em, Lap and Pgm loci. Also, the homozygotic genotypes of the alleles with positive correlation values were selected in the contaminated areas, while the heterozygotes were more favoured in the control population, showing an adaptive behavior and corroborating the utility of some of these loci as biomarkers in studies of population dynamics in areas subjected to environmental contamination.

Introducción

Las regiones estuarinas son zonas muy contaminadas por residuos orgánicos e inorgánicos, aumentándose su concentración en las zonas de mezcla de agua dulce y salada debido a la sedimentación de la mayor parte de los residuos. Existen diversos organismos, tanto marinos como estuarinos, que acumulan contaminantes y que, debido a sus características biológicas y a su distribución y tamaño, se han propuesto como bioindicadores de contaminación ambiental, como es el caso de algunas especies de moluscos (Rebordinos et al., 1999).

El cobre, hierro, manganeso y zinc son los metales que se encuentran en mayor proporción en lamelibranquios de ambientes contaminados (Galtsoff, 1964). Se han descrito los efectos perjudiciales que presentan sobre el crecimiento y reproducción de organismos acuáticos, en general, mediante estudios histológicos y fisiológicos (Baker, 1969; MacInnes y Thurberg, 1973; Sarasquete et al., 1992).

El análisis genético se ha considerado una herramienta útil para determinar la calidad de los ambientes acuáticos. El principal requerimiento a nivel genético para que un organismo pueda ser utilizado como bioindicador es que presente loci polimórficos que permitan detectar fácilmente variaciones en frecuencias génicas, heterocigosidades o en estructuras multilocus entre poblaciones de áreas contaminadas (Beardmore et al., 1980; Michinina y Rebordinos, 1997; Rebordinos y Cross, 1999).

Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) es un molusco bivalvo sésil que cumple todos los requerimientos anteriores para ser utilizado como bioindicador porque, debido a su actividad filtradora y bajo metabolismo, acumula metales en sus tejidos que se incorporan en las células en forma de gránulos inertes de derivados de zinc y depósitos insolubles de cobre y azufre (Establier, 1969).

Los contaminantes pueden afectar la constitución genética produciendo mutaciones génicas o variaciones cromosómicas. Se han descrito alteraciones de la división celular y también del contenido y organización cromosómica de diversos moluscos, principalmente referidos a supresión mitótica, poliploidización y degeneración. A nivel de cromosomas individuales se han descrito aneuploidías y fusión de cromátidas hermanas (Barsiene, 1994). Además se ha demostrado un efecto selectivo en contra de determinados genotipos por exposición a altas concentraciones de metales pesados. Se ha propuesto que la interacción de los metales con la estructura de las proteínas podría cambiar las propiedades enzimáticas de diferentes genotipos en un locus polimórfico, de manera que se reflejaría en la condición física del organismo, sobre todo si se trata de enzimas importantes para la glicólisis o el ciclo de Krebs (Nevo et al., 1984; Hummel y Patarnello, 1994).

Los estudios de campo que evalúan los efectos de los contaminantes basados en estructura genética son escasos, a pesar de que los datos disponibles apuntan a que las poblaciones que viven en ambientes contaminados a menudo muestran cambios en su estructura genética en relación con las poblaciones control (Fevolden y Garner, 1987).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la relación existente entre la estructura genética de tres poblaciones de C. angulata, sometidas a un gradiente de contaminación. Además, se pretendió establecer relaciones entre concentraciones de metales pesados y la presencia de determinados alelos y/ o genotipos para valorar su influencia sobre el componente genético individual y la estructura genética poblacional de esta especie que potencialmente podría ser utilizada como bioindicador.

Material y métodos

En la figura 1 se representan las poblaciones de C. angulata muestreadas en este estudio. La zona A está localizada en la desembocadura de los ríos Tinto y Odiel (Huelva, España), los cuales presentan niveles muy altos de contaminación por metales pesados procedentes de la cuencas mineras existentes en la región. La zona B se encuentra en la desembocadura del Río Guadalquivir (Cádiz, España), caracterizada por tener valores altos de contaminación por metales pesados. La zona C, localizada al SE de la zona B, se encuentra alejada de los puntos de mayor contaminación de la Bahía de Cádiz y se ha utilizado como población control.

Los muestreos se realizaron durante 1996-1997; se recogieron 317 individuos de la zona A, 219 de la zona B y 215 de la zona C. Los ejemplares fueron recolectados en el periodo intermareal y se llevaron al laboratorio, donde se diseccionaron sus hepatopáncreas, se congelaron en N2 y se mantuvieron a -80°C hasta el momento de la electroforesis. Los sistemas enzimáticos analizados fueron: enzima málico (EM), leucín aminopeptidadasa (LAP), malato deshidrogenasa (MDH), fosfoglucoisomerasa (PGI), fosfoglucomutasa (PGM) y xantín deshidrogenasa (XDH). La técnica utilizada fue electroforesis en geles de almidón que reveló un control genético monogénico para EM (Em), LAP (Lap), PGI (Pgi), PGM (Pgm) y XDH (Xdh). La enzima MDH se reveló en dos zonas de actividad, controladas por un gen cada una de ellas (Mdh1 y Mdh2) (Michinina y Rebordinos , 1997).

Algunas de las enzimas se han escogido por su posible sensibilidad a metales pesados, así PGM y LAP son afectadas de manera directa por iones metálicos (Milstein, 1961; Young et al. 1969). La PGI se ha utilizado porque, en general, es muy polimórfica y porque debido a su posición en la glicólisis y gluconeogénesis juega un papel importante en la distribución de carbohidratos para diferentes usos metabólicos. Además, diversos estudios han demostrado que está bajo selección natural, especialmente en ambientes inestables (Patarnello y Battaglia, 1992). Las enzimas MDH, EM y XDH no están descritas como dianas de metales, pero son enzimas centrales del metabolismo primario, por lo que se usaron con el objeto de tener dos materiales diferentes sobre los que estudiar el posible efecto ambiental.

Las zonas de actividad se numeraron por orden de migración creciente, y a los alelos dentro de un locus se les asignaron números indicando su movilidad relativa en relación al más común que se denominó 100. Los alelos nulos se nombraron con el número 00 y se identificaban por ausencia total de actividad del sistema, presentando actividad normal para el resto de las enzimas.

Las concentraciones de los metales se obtuvieron a partir de datos publicados por Sáenz-Aurrecoechea (1998) y por Blasco et al. (1999).

El análisis de los datos se llevó a cabo mediante los programas Genetix 4.0 y SYSTAT 8.0. La relación entre los párametros genéticos y la presencia de metales se determinó mediante el análisis de correlación entre las concentraciones de metales en cada zona y la variable en cuestión (frecuencias alélicas, números de alelos, heterocigosidades, etc.). Las matrices de correlación fueron utilizadas para determinar si existían relaciones estadísticamente significativas entre las dos variables mediante análisis de regresión.

Resultados

Los seis enzimas estudiados nos permitieron analizar siete loci en las tres poblaciones de C. angulata. Los resultados de las frecuencias alélicas en cada uno de los loci se presentan en la tabla 1. Todos los loci fueron variables y se detectó un alelo nulo en el locus Lap en las poblaciones B y C, y otro en el locus Mdh1 en las de A y B. Puesto que no fue posible distinguir los heterocigotos para nulos todos los patrones con una banda fueron considerados homocigotos para el alelo activo.

Las heterocigosidades medias obtenidas de las tres poblaciones difirieron considerablemente de los valores insesgados esperados. El número medio de alelos por locus también varió entre las poblaciones; además, aparece una relación inversa entre el número medio de alelos por locus y las heterocigosidades. Así, se puede observar que la población A es la que presenta un número de alelos más alto (n_a = 4) y un valor de H_dc más bajo (H_dc = 0.246), al contrario de lo que ocurre con la población C control (n_a = 3.43, H_dc = 0.289).

En la tabla 2 se recogen los valores de heterocigosidades observadas y esperadas en cada locus de cada zona, con el fin de poder compararlas y determinar si su comportamiento es similar en las tres zonas de estudio. Las diferencias entre los valores fueron estadísticamente significativas en todos los loci, excepto en Pgi y Mdh2. En Pgm también se observaron desviaciones significativas de las condiciones de equilibrio, pero mientras que en la población A esta desviación se debió a un déficit de heterocigotos, en las de B y C se obtuvo un exceso de éstos. Los valores de heterocigosidad esperada fueron similares para las tres poblaciones en todos los loci. Sin embargo, se observaron diferencias apreciables entre los valores observados en varios loci. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas para los loci Mdhl y Pgm, y próximas al nivel de significación para Em.

La relación entre las diferencias genéticas observadas en las poblaciones y la presencia de concentraciones variables de metales pesados se determinó mediante análisis de regresión. En la tabla 3 se muestran los resultados de los coeficientes de regresión obtenidos para las matrices de correlación entre las frecuencias alélicas y la concentración de los metales en cada población. Se obtuvieron resultados estadísticamente significativos para los loci Em, Lap y Pgm. La enzima LAP es afectada por cobre, hierro y manganeso, de manera que la frecuencia del alelo 91 aparece correlacionada positivamente con la concentración de hierro y zinc, mientras que para el alelo 122 esta correlación fue negativa. Además, en la población A, que es la más contaminada, no se obtuvo ninguna actividad para este sistema en un número considerable de individuos mostrando que, además de un efecto específico sobre alelos concretos, se produce un efecto general en algunos individuos de inhibición total de la actividad enzimática. Se obtuvieron resultados similares para los alelos 100 y 132 de Pgm. El alelo 100 mostró un coeficiente de correlación muy próximo al nivel de significancia de 0.05 (r² = 0.992, P = 0.057) para el cadmio y el zinc (r² = 0.984, P = 0.080) pero, en cambio, esta correlación fue negativa y significativa (P = 0.045) entre el alelo 132 y la concentración de cadmio. El número de alelos también mostró una correlación positiva significativa con la concentración de hierro presente. Mientras que la heterocigosidad media está inversamente correlacionada (P < 0.05) con las concentraciones de cadmio y zinc, respecto a las de plomo la correlación está próxima a ser significativa (r² = 0.988, P = 0.07) .

Para determinar si existe una selección genotípica se calcularon las frecuencias observadas y esperadas de cada genotipo en cada población para los loci Em y Pgm (tablas 4, 5), por ser los loci en los que se puede detectar el efecto de la contaminación sin interferir con otros factores. En ellas se puede ver que los genotipos de alozimas más resistentes a altas concentraciones de metales (tabla 3) aparecen en las poblaciones contaminadas con frecuencias mayores que las esperadas, mientras que en la población control los más frecuentes son los heterocigotos.

Discusión

Las tres poblaciones mostraron diferencias significativas entre el número de heterocigotos observado y el esperado, y un déficit generalizado de heterocigotos, siendo ésta una característica común en las poblaciones naturales de bivalvos marinos para la que todavía no se ha encontrado una explicación satisfactoria (David et al., 1995; Bierne et al., 1998). Las comparaciones de la estructura genética entre las tres poblaciones muestran diferencias entre ellas, fundamentalmente, cuando se compararon las dos poblaciones contaminadas con la no contaminada. La población A, más contaminada, es la que presenta un mayor número medio de alelos por locus y una menor heterocigosidad, mientras que en el control no contaminado ocurre lo contrario. En la B, con valores intermedios de contaminación, se observan también a nivel genético valores intermedios entre los obtenidos para A y C. Además, estos valores de correlación se ajustaron a un modelo de regresión lineal que, en el caso del hierro, fue significativo a nivel de 5%. Sin embargo, en el caso de la heterocigosidad los valores fueron negativos en todos los casos, ajustándose también a un modelo lineal con valores significativos en el caso del cadmio y del zinc y próximo al nivel de significancia (P = 0.070) para el plomo.

Los loci de moluscos se han descrito muy polimórficos y se han relacionado con ambientes estuarinos muy variables (Sarver et al., 1992), lo cual explicaría el aumento en el número de alelos con el aumento de la concentración de metales. Por otra parte, a la vez que propician la aparición de nuevos alelos, estos metales estarían ejerciendo una fuerte presión de selección a nivel genotípico a favor de aquellas variantes enzimáticas más o mejor adaptadas a estas condiciones, lo cual explicaría el descenso en la heterocigosidad con el aumento en la concentración de metales. Este efecto estaría relacionado con la situación general de déficit de heterocigotos en las poblaciones y que resulta díficil de esclarecer puesto que no se conoce la causa del déficit de heterocigotos (Zouros et al., 1983).

Existen datos que indican la existencia de selección entre los estadios juveniles y adultos de invertebrados de zonas contaminadas por metales, contribuyendo al aumento de las clases homocigotas (Patarnello et al., 1991). En nuestro caso, el agrupamiento de clases genotípicas para aumentar la frecuencia de esperados siguió presentando valores de desviación significativos.

Aunque se detectaron déficits generalizados de heterocigotos en las poblaciones conviene analizar con detalle la situación locus a locus. Los loci Lap y Mdh1 presentaron alelos nulos, la cual ha sido una de las explicaciones del déficit de heterocigotos en poblaciones naturales (Foltz, 1986). Para el locus Mdh1, la población C control no mostró nulos ni presentó diferencias estadísticamente significativas entre el número de heterocigotos observado y esperado mientras que las diferencias fueron altamente significativas (P < 0.001) en el caso de las poblaciones A y B, por lo que la situación de este locus sería un reflejo de las condiciones ambientales.

La actividad de la enzima LAP se ha descrito como altamente afectada por metales (Young et al., 1969). En nuestro caso se observó una total inhibición de la actividad en todo el sistema Lap en un número considerable de individuos de la población altamente contaminada, A. Por lo tanto, los datos que se muestran corresponden solamente a los de aquellos individuos de la población A que mostraron actividad. Además se encontró una correlación entre las frecuencias de determinados alelos y la concentración de metales. En concreto para los alelos Lap91 y Lap122, ésta fue positiva para el primero y negativa para el segundo, apuntando a una adaptación a las condiciones contaminadas y no contaminadas, respectivamente. Sin embargo, las frecuencias de los genotipos muestran resultados claros en este sentido, probablemente debido a la presencia de nulos que quedan enmascarados en los heterocigotos.

Mdh2 ha aparecido muy poco polimórfico, aún así la única población que presentó un solo alelo fijado fue la C.

El locus Xdh no está en equilibrio en ninguna de las tres poblaciones y presenta fuertes déficits de heterocigotos. Sin embargo, mediante análisis de electroforesis secuencial (datos no mostrados) está apareciendo un alto grado de variabilidad críptica u oculta, o sea que, variando las condiciones de electroforesis se está obteniendo el desdoblamiento de bandas que aparecían como únicas en las condiciones de electroforesis estándar, lo que significaría que el método general subestima la variabilidad de este loci porque bajo un fenotipo homocigoto manifestado como única banda existirían varias distintas. En los loci con alelos nulos que presentan una situación similar en cuanto a no detección de heterocigotos, se han encontrado evidencias experimentales de que la no detección de variabilidad genética críptica produce déficit de heterocigotos (Foltz et al., 1986).

La detección de variabilidad genética críptica es de gran interés en estudios de genética de poblaciones porque puede modificar los resultados de determinados trabajos de control genético, distribución clinal de alozimas, etc. (Rebordinos y Pérez-de la Vega, 1990; Verrelli y Eanes, 2000).

Los loci Em, Pgi y Pgm, aunque aparentemente presentaron resultados diferentes, cuando se analizan con detalle se puede ver que siguen el mismo patrón de comportamiento. La Pgm se ha descrito como una enzima muy afectada por la concentración de metales (Milstein, 1961). Para Pgi también existen datos que indican que está bajo selección natural especialmente en ambientes muy variables (Patarnello y Battaglia, 1992). No conocemos datos publicados al respecto para Em, pero se esperaría que su comportamiento no fuera neutro de acuerdo con la teoría general, porque es una enzima clave en la ruta biosintética de obtención de energía (Zouros, 1975). Este locus mostró en las tres poblaciones una desviación altamente significativa de las condiciones de equilibrio Hardy-Weinberg, pero el déficit observado en C (5 = -0.297) es considerablemente más bajo que en B (D = -0.503) y que en la más contaminada A (D = -0.653). Además, se obtuvo un ajuste significativo (P = 0.023) a un modelo de regresión lineal entre la presencia del alelo 90 y la concentración de hierro. Los resultados de la tabla 4 evidencian la selección genotípica ejercida sobre los genotipos dependiendo de las condiciones ambientales, indicando un comportamiento adaptativo de los alelos.

El locus Pgi no presentó diferencias significativas en ninguna población; sin embargo, en la única población que apareció un déficit de heterocigotos (D = -0.139) fue en la A más contaminada, que fue la que mostró también un mayor número de alelos, seguida por la de contaminación intermedia, B, y la control, C , con dos alelos presentes.

Según se puede ver en la tabla 4 existen más homocigotos de los esperados en las poblaciones contaminadas para los tres alelos del locus Em, indicando que existe una selección genotípica en los loci Em y Pgm. De manera similar, en la tabla 5 se puede ver que el homocigoto más favorecido en la población A es el correspondiente al alelo positivamente correlacionado con la concentración de metales, mientras que en las otras dos poblaciones los genotipos más favorecidos son los heterocigotos para este alelo y el que produjo valores de correlación negativos. La PGM es una enzima implicada en la glicólisis y la EM es una enzima del ciclo de Krebs, de manera que el genotipo para estas formas enzimáticas implicaría diferencias en la condición física de los individuos portadores. Es interesante, por tanto, extender estos estudios a otras poblaciones para obtener más datos y analizar otras enzimas que actúen en rutas metabólicas importantes, o que puedan estar interrelacionadas con las estudiadas en el presente trabajo, así como profundizar en el mecanismo por el que los metales pesados pueden afectar la eficacia biológica de los genotipos.

Agradecimientos

Este estudio se realizó gracias a los fondos del proyecto CV-219 de la Junta de Andalucía. Los autores agradecen a Jesús Cantoral Fernández su colaboración en la consecución de financiación y en la recogida de algunas muestras y a Edgardo Díaz Ferguson su ayuda en el tratamiento estadístico de los datos.

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