Efecto de la estimulación vagal sobre los cambios inducidos por la epilepsia en la organización temporal del sueño en el gato
Vagal simulation effect on epilepsy–induced changes in the temporal organization of sleep in the cat
Adrián Martínez1,2
1 Dirección de Investigación en Neurociencias. Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.
2 Facultad de Estudios Superiores Aragón, UNAM.
]]>Correspondencia:
Adrián Martínez Cervantes,
Dirección de Investigación en Neurociencias.
INPRFM. Calz. México–Xochimilco 101,
San Lorenzo Huipulco, 14370, México, DF.
E.mail: adrianmc@imp.edu.mx
Recibido primera versión: 12 de septiembre de 2011.
Aceptado: 28 de octubre de 2011.
SUMMARY
Clinical and experimental observations have demonstrated a relationship between epilepsy and sleep. During slow wave sleep (SWS), facilitation of the epileptic activity has been observed, as well as an inhibition of this activity during the rapid eye movement (REM) stage. On the other hand, during epileptic seizures, sleep inhibition is manifest, but when epileptic activity is present without seizures, an increase in cortical synchronization is encountered. Vagus nerve electrical stimulation (VNS) induces synchronization or desynchronization of cortical activity depending on the stimulation parameters. We have described an inhibition of generalized convulsive activity induced either by electrical (kindling) or chemical (penicillin) stimulation of the temporal lobe amygdala. It has also been demonstrated that VNS induces ponto–geniculo–occipital activity thus suggesting that VNS exerts an influence on epilepsy and sleep.
The aim of this study was to analyze the effect of chronic electrical stimulation of the vagus nerve on epilepsy–induced changes in the temporal organization of sleep and wakefulness stages.
Ten male cats were stereotaxically implanted to record conventional sleep. In addition, a bipolar stainless steel electrode bound to a cannula was directed to the central nucleus of the temporal lobe amygdala. Finally, a bipolar hook stainless steel electrode was fixed on the left vagus nerve at the level of the larynx. One microliter of saline solution containing 100 IU of sodium penicillin G (Pn) was injected into the amygdala to induce an epileptic state. The left vagus nerve was stimulated with 30–s impulses in an hour, five times a day; subsequently brain electrical activity was recorded for 8 hours.
The Pn injection elicited interictal spikes and changes in the temporal organization of sleep and wakefulness stages. The temporal organization of these stages exhibited the following variations: a) increase in the number of phases during wakefulness, b) increment in the number of phases during SWS–I and a diminution in the mean duration of this phase, c) SWS–II total time was increased as well as its percentage, d) latency of REM sleep increased, whereas the number of phases and the total time of this phase decreased. VNS in presence of Pn produced the following changes: a) increase in the latency of the appearance of spikes in 88%, and b) reduction of spike frequency in 40%. With regard to the temporal organization of sleep and wakefulness stages, we observed: a) decrease in the number and total time of SWS–I and SWS–II phases and b) diminution in the latency of onset of the first REM sleep.
VNS reverted REM sleep inhibition induced by epilepsy, as well as caused increase in wakefulness and decrease in cortical synchronization and interictal epileptic activity. These effects suggest inactivation of areas that induce REM sleep and also of areas that induce the generalization of epileptic activity localized in brain stem, which send their projections to the anterior brain. With respect to the decrease in both cortical synchronization and somnolence, this might be due to the inhibition, via the solitary tract and locus coeruleus nuclei, of thalamic areas (reticular nucleus), which generate the cortical synchronization. The increase in wakefulness may be due to VNS activation of the basalis nucleus (this pathway originates in the brain stem), which is a system that regulates awake and attention behaviors by its projections, which traverse the thalamic nuclei and connect to the cerebral cortex.
Key words: Vagus nerve, amygdala, penicillin, epilepsy, sleep.
RESUMEN
]]> Por las observaciones clínicas y experimentales se sabe que hay una relación entre la epilepsia y el sueño. Se describe durante el sueño de ondas lentas (SOL) una facilitación de la actividad epiléptica y una inhibición durante el sueño de movimientos oculares rápidos (MOR). A su vez, durante las crisis epilépticas se observa una inhibición del sueño y cuando no hay crisis, y sólo se registra actividad epiléptica, se observa un aumento en la sincronización cortical. La estimulación eléctrica del nervio vago (ENV) induce sincronización y desincronización de la actividad cortical según los parámetros de estimulación. Hemos descrito una inhibición de la actividad convulsiva generalizada inducida por la estimulación eléctrica (kindling) y química (penicilina) en la amígdala del lóbulo temporal. También se ha demostrado que la ENV induce la actividad ponto–genículo–occipital (PGO), por lo que se deduce que la ENV tiene influencia tanto en la epilepsia como en el sueño. El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de la estimulación eléctrica crónica del nervio vago sobre los cambios que induce la epilepsia en la organización temporal del sueño y la vigilia.Se implantaron estereotaxicamente a 10 gatos machos para registro convencional de sueño y se introdujo una cánula unida a un electrodo bipolar dirigida hacia el núcleo central de la amígdala del lóbulo temporal. Se colocó además un electrodo en forma de horquilla en el nervio vago izquierdo a nivel de la laringe. Se aplicaron en un microlitro de solución salina, 100 unidades internacionales (UI) de penicilina G sódica (Pn) en la amígdala del lóbulo temporal para inducir la epilepsia. Se estimuló eléctricamente el nervio vago (ENV) izquierdo durante 30 segundos cada hora. En total se aplicaron cinco estimulaciones al día y se registró la actividad eléctrica cerebral durante ocho horas.
La Pn produjo espigas interictales y cambios en la organización temporal de las fases del sueño y la vigilia.
En la organización temporal de las fases del sueño y la vigilia con la Pn se observó: a) la vigilia aumentó el número de fases, b) el SOL–I aumentó el número de fases y disminuyó la duración promedio de la fase, c) el SOL–II aumentó el tiempo total de la fase así como su porcentaje, d) el sueño MOR aumentó la latencia y disminuyó el número de fases así como el tiempo total de la fase. Con la ENV en presencia de la Pn se observó: a) un aumento en la latencia de aparición de espigas en un 88% y b) una reducción en la frecuencia de las mismas en un 40%. En la organización temporal de las fases del sueño y la vigilia se observó: a) una disminución del número y del tiempo total de las fases del SOL I– II y b) una disminución en la latencia de aparición del primer sueño MOR.
La ENV revirtió la inhibición del sueño MOR inducida por la epilepsia, aumentó la vigilia, disminuyó la sincronización cortical y la actividad epiléptica interictal. Estos efectos nos sugieren la inactivación de las áreas que inducen la inhibición del sueño MOR y de las áreas que inducen la generalización de la actividad epiléptica, localizadas en el tallo cerebral y que envían proyecciones hacia el cerebro anterior. Con respecto a la disminución de la sincronización cortical, la reducción de la somnolencia se debería probablemente a la inhibición vía el núcleo del tracto solitario (NTS)–locus coeruleus hacia las áreas del tálamo (núcleo reticular) que generan la sincronización cortical. El aumento de la vigilia se debería a que la ENV activa al núcleo basalis (vía que se origina en el tallo cerebral), que es un sistema que regula la conducta de vigilia y atención por medio de sus proyecciones a través de los núcleos del tálamo y que se conectan a la corteza cerebral.
Palabras clave: Nervio vago, amígdala, penicilina, epilepsia, sueño.
INTRODUCCIÓN
Los mecanismos subyacentes al efecto de la estimulación eléctrica del nervio vago sobre la actividad epiléptica no son del todo conocidos y éstos se empiezan a conocer analizando la ENV en humanos1–4 y en modelos experimentales.5–8 En éstos se ha observado que la ENV induce sincronización9–14 o desincronización del electroencefalograma (EEG)15–17 según los parámetros de estimulación.
La sincronización cortical es considerada como una repuesta inherente al arreglo neuronal cortical. El sueño y la epilepsia son dos tipos de actividad sincrónica y se ha sugerido que comparten el mismo sitio para la generación de la sincronización: el núcleo reticular del tálamo. Se describen dos partes funcionales diferentes: una para generar los husos18–20 y otra para la génesis de la epilepsia de ausencia, secundariamente generalizada.21 Se atribuyen a estos dos tipos de actividad sincrónica una cualidad inhibitoria.22–24
]]> Se ha descrito además que el núcleo del tracto solitario también influye sobre estos dos procesos debido a que la estimulación eléctrica induce una inhibición de la epilepsia,25 y que la estimulación química induce sueño de ondas lentas (SOL).26En cuanto a la desincronización del EEG, ésta se ha aceptado desde que se propuso el "sistema reticular de activación ascendente",27 comprobándose mediante la inactivación del NTS por diferentes procedimientos28–31 una desincronización cortical asociada a un despertar. Se ha demostrado que la parte bulbar del tallo cerebral ejerce una inhibición sobre su parte rostral,32 y que cuando las vías inhibitorias ascendentes bulbares–mesencefálicas son interrumpidas por lesiones mediopontinas, los animales muestran signos electrográficos y conductuales de vigilancia.33 Este efecto ha sido interpretado como la liberación del sistema activador ascendente del tallo cerebral de las influencias inhibitorias de su parte bulbar.34
Las observaciones clínicas y experimentales sugieren una íntima relación entre la epilepsia y el sueño,35–37 como procesos de sincronización y desincronización de ritmos cerebrales corticales y por ello planteamos como el objetivo del presente trabajo analizar la estimulación eléctrica crónica del nervio vago sobre los cambios en la organización temporal del sueño y la vigilia inducidos por un foco penicilínico amigdalino.
MÉTODO
Los experimentos se realizaron bajo las especificaciones emitidas por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz para el cuidado y uso de los animales de laboratorio. Se implantaron para registro convencional de sueño 10 gatos machos con un peso de entre 3.0 y 4.5 kg. La cirugía se realizó en condiciones asépticas, bajo anestesia con pentobarbital sódico (33mg/kg i.v.); los electrodos bipolares de acero inoxidable se dirigieron siguiendo coordenadas estereotáxicas38 hacia cada una de las amígdalas del lóbulo temporal y a cada uno de los cuerpos geniculados laterales. El electrodo dirigido hacia la amígdala izquierda tenía unido una cánula guía (diámetro 20) de acero inoxidable. Además se implantaron electrodos epidurales en forma de clavo en la corteza prefrontal y electrodos convencionales en los músculos de la nuca. El nervio vago fue disecado caudalmente respecto de la laringe y se implantó un electrodo bipolar en forma de horquilla, de alambre de acero inoxidable (5 mm de separación entre cada punta). Todos los animales tuvieron un periodo de recuperación postoperatorio de 15 días, que sirvió como habituación, en la cámara de registro sonoamortiguada con agua y alimento ad libitum. En todos los animales la cánula guía sirvió para liberar 100UI de Pn en 1.0μl de solución salina al 0.9% por medio de una microjeringa Hamilton. El umbral del estímulo eléctrico para el nervio vago fue determinado repitiendo cada cinco minutos el pulso de 0.5ms de duración y un tren de 30 Hz aumentándose la intensidad (0.2mA) hasta que aparecieran conductas vegetativas. La intensidad de la estimulación varió entre 1.2 y 3.0 mA. Una vez establecido el umbral, el nervio vago se estimuló cinco veces durante un minuto a intervalos de una hora (10:00–14:00 horas). La primera estimulación ocurrió antes de aplicar la Pn.
PROCEDIMIENTO
Se realizaron registros de ocho horas de duración de la actividad eléctrica cerebral, en cuatro condiciones experimentales. El grupo I, control; el grupo II recibió la Pn; el grupo III recibió la ENV; el grupo IV recibió ENV + Pn, ocurriendo la primera ENV antes de aplicar la Pn. En cada una de las condiciones el registro se inició a las 8:30 am, inmediatamente después de aplicar la ENV. Se describen los estadios conductuales39 observados en cada manipulación cuando se aplicó la Pn y se produjo la conducta epiléptica.
Una vez obtenidos los registros de la actividad eléctrica cerebral, éstos se calificaron manualmente,40 midiendo la duración de cada estadio (vigilia, SOL–I, SOL–II y sueño MOR) y se capturaron manualmente en una PC.
]]> La actividad eléctrica cerebral se obtuvo usando preamplificadores de EEG (Grass 7P511K) colocando el filtro para bajos en 1Hz y el filtro para altas a 100Hz. Los amplificadores tienen un filtro "T" analógico para quitar el ruido residual de los 60Hz de la línea. La salida analógica de los amplificadores se adquirió y se guardó digitalmente en el disco duro de una PC para un análisis posterior más detallado, ya fuera de línea.Los parámetros EEG considerados fueron la latencia, la amplitud y la frecuencia. Para evaluar los cambios de éstos entre el grupo I y el III versus el II y el IV, se aplicó la prueba de "U" Mann–Whitney para grupos independientes.
Para evaluar el efecto de la actividad interictal sobre los estadios del sueño se consideraron las siguientes variables: a) los cambios provocados por la Pn en los grupos II y IV; b) los cambios inducidos por la ENV en el grupo III y c) los cambios provocados por la ENV+Pn en el grupo IV.
El análisis estadístico se realizó aplicando la prueba no paramétrica de rangos "t" de Wilcoxon para grupos relacionados, para evaluar la latencia, el tiempo total y el número de fases de los estadios del sueño entre el grupo I, el II y el IV.
Al terminar la manipulación experimental con cada animal se realizó la verificación de los sitios cerebrales de los electrodos subcorticales usando la técnica del procedimiento rápido.41
RESULTADOS
En un esquema de la amígdala del lóbulo temporal,42 se muestra el sitio de inyección con un círculo, observándose que en dos animales el sitio se localizó en el núcleo basola–teral y siete en el núcleo central (figura 1 y cuadro 1). En el cuadro 2 se muestra el número de registros de la actividad eléctrica cerebral en cada una de las situaciones que se realizaron por sujeto.
Efecto de la penicilina
La aplicación tópica de Pn produce espigas interictales con una latencia de 6.8±2min y su frecuencia media fue de 9.50/30 segundos. La amplitud aumenta progresivamente de 200 a 400μv, estabilizándose entre los 6–9 minutos en los grupos II y IV, no encontrándose una diferencia significativa en la inducción y desarrollo de las espigas entre los núcleos estimulados.
En las áreas registradas se observa el siguiente orden de propagación de las espigas: corteza prefrontal izquierda, corteza prefrontal derecha, en el cuerpo geniculado izquierdo, en el cuerpo geniculado derecho y, por último, en la amígdala derecha.
Efecto de la penicilina sobre el sueño y la vigilia
Se observó lo siguiente en el grupo III: a) la vigilia disminuyó 13% del tiempo total de la fase, b) el SOL–I aumentó un 25% del tiempo total de la fase, c) el SOL–II aumentó 9% del tiempo total de la fase, d) el sueño MOR aumentó la latencia al primer sueño MOR y disminuyó (8%) el número de fases (figura 2), e) durante el sueño MOR se observó una inhibición de la actividad paroxística en todas las áreas registradas ante la ocurrencia de ondas ponto–genículo–occipitales (figura 3).
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En la acumulación por hora de las fases del sueño, se observó que en el inicio del registro aumenta la latencia al primer sueño MOR y una disminución del tiempo total del sueño MOR.
Efecto de la ENV sobre la latencia de las espigas
La ENV indujo una latencia de 12.8 minutos en el grupo IV en comparación con el grupo II (su latencia fue de 6.8 minutos) (figura 4). Se observa una diferencia aunque no fue significativa en la aparición de la actividad epileptiforme.
Efecto de la ENV sobre la conducta
La ENV indujo los siguientes cambios conductuales en los grupos III y IV: lengüeteo, deglución, inmovilidad con la mirada hacia arriba, contracciones abdominales. La presencia del electrodo induce miosis del ojo izquierdo.
Efecto de la ENV sobre el sueño y la vigilia
En el grupo II, versus el grupo I, se observó lo siguiente: a) un aumento de vigilia en 9% del tiempo total de la fase, b) aumento del tiempo total de la fase SOL–I (5%), c) disminución del tiempo total de la fase SOL II (4%), d) la disminución significativa de la fase de sueño MOR (19 %) (cuadro 3).
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Efecto de la ENV sobre la frecuencia de las espigas
En el EEG se observa una disminución de la frecuencia durante la ENV (figura 5). En la comparación entre los grupo II vs IV la ENV redujo de manera significativa la frecuencia de las espigas, principalmente en la primera parte del registro, esto es en los primeros 10 minutos, con reducciones de 48% con respecto al control. Asimismo se muestra que al final de los 360 minutos de aplicada la penicilina hay una disminución de alrededor del 63%. En general se mantiene por debajo de la frecuencia de la penicilina sola (0.32±0.07Hz), cuando se aplica la ENV (0.22±0.07Hz) pero sólo es significativo al principio y al final del efecto de Pn (figura 6). Un análisis de la tendencia entre frecuencia de las espigas y el tiempo de la estimulación del NV muestra una disminución de las espigas conforme se estimula el nervio vago (0.38 vs. 0.23 respectivamente) (figura 6).
Efecto de la ENV sobre el sueño en presencia de Pn
Los cambios observados son los siguientes con el grupo IV versus el grupo II: a) un aumento de la vigilia, b) una disminución en el número de episodios SOL I y II, c) disminución significativa del tiempo total de las fases de SOL I, d) no se observaron cambios en los valores del sueño MOR (figura 2).
]]> Análisis espectral de la actividad eléctricaEl análisis demostró la aparición de una frecuencia entre 2 y 4Hz y un aumento en la potencia en la amígdala que predominó después de la inyección de penicilina en el control y una disminución cuando se aplicó la ENV, el cual es representado por el eje "Y" en la amígdala. También se observa el inicio de la respuesta neuronal que coincide con la aparición del potencial y el aumento progresivo de la potencia o amplitud en los núcleos registrados, así como la inducción de la frecuencia entre 2 y 4Hz. Este ancho de banda se indujo por la aplicación de la Pn, aumentando su potencia lo que es representado por el color rojo, conforme se instala el evento epiléptico, considerándose está situación como el control. Con la ENV se produjo la disminución de la potencia de la banda de 6 a 12Hz y una disminución de la frecuencia entre 2 y 4Hz (figura 7).
DISCUSIÓN
La ENV y la epilepsia afectan por separado las fases del sueño, pero al ser aplicada la ENV en presencia de epilepsia no induce un efecto significativo en el tiempo total de las fases del sueño. No obstante, el estado hipersincrónico de la epilepsia sí se ve afectado por la ENV, que induce la desincronización cortical y provoca la inhibición de la actividad epiléptica.9,10,12,13,15,16,24,42 El efecto de la ENV aplicada en presencia de epilepsia fue restablecer los valores control del tiempo total de las distintas fases de sueño, evento congruente con su acción antiepiléptica. Este efecto se debería a la activación de las regiones cerebrales talámicas e insulares como se ha comprobado en pacientes epilépticos con la ENV usando SPECT43 y al aumento en el flujo sanguíneo inducido por la ENV, evaluado con PET, que produjo cambios en la actividad sináptica talámica que se asoció al efecto anticonvulsivo.44 Hay que recordar que la vía de propagación de la actividad paroxística parte de los núcleos amigdalinos hacia los núcleos mediodorsal y medial del tálamo y éstos proyectan hacia la corteza. Como lo han descrito Reardon y Mitrofanis,45 la parte dorsal del tálamo actúa como una compuerta hacia la neocorteza.
Por otro lado, nuestros resultados no apoyan la hipótesis de P Gloor46 según la cual las descargas en onda y espiga características de la epilepsia de ausencia pueden desarrollarse por los mismos circuitos tálamo–corticales, los cuales normalmente generan los husos de sueño bajo ciertas condiciones de hiperexcitabilidad.47 Esto es debido a que la inhibición inducida por la ENV afecta principalmente la actividad paroxística de la corteza cerebral, ya que la ENV no puede inhibir la actividad paroxística del lóbulo temporal. La ENV está interfiriendo con la conectividad cortical que participa en la generación de la espiga cortical48,49 y con los circuitos tálamo–corticales que generan la sincronización cortical (husos de sueño).23,50
Las dos estructuras estudiadas en el presente trabajo, por un lado el nervio vago y por otro la amígdala del lóbulo temporal, están relacionadas anatómicamente entre sí. Además poseen diversos "puntos de cruce" en los núcleos que participan diferencialmente en el sueño.8,11,43,51–57 El locus coeruleus, el NTS y el tálamo, entre otras estructuras, son áreas que guardan relación tanto con el nervio vago como con la amígdala. El locus coeruleus está relacionado con fases que no implican sincronización cortical y su "inactividad" es necesaria para la instalación del sueño MOR,58,59 mientras que el tálamo está relacionado en la generación de husos de sueño y sincronía dentro de las fases SOL.23,50,60–62 En el presente estudio se observó que las estructuras implicadas podrían responden diferencialmente a distintos tipos de eventos separados, uno sincronizante como la epilepsia y otro desincronizante como la ENV, pero que al ser aplicados juntos el efecto desincronizante provocado por la ENV es capaz de reducir la hipersincronización y permitir la aparición de los ritmos cerebrales propios de las fases de sueño como en el control. También se demuestra que la ENV revierte los cambios en las fases de sueño ocasionados por la epilepsia. Sin duda este efecto participa en las primeras ocho horas de un foco agudo en el lóbulo temporal. Además se mostró que por sí sola la ENV también modifica las fases de sueño si se aplica en ausencia de un estado hipersincrónico, observándose un aumento de la vigilia y una disminución del SOL, debido a que la ENV activa las redes tálamo–corticales y córtico–talámicas e inicia el efecto desincronizante en las capas profundas de la corteza vía el núcleo basalis,63 el que a su vez sería estimulado por las proyecciones que nacen del tallo cerebral.64
Los cambios en la organización temporal del sueño inducidos por la epilepsia, los revirtió la ENV. Nuestros resultados son similares a los estudios previos en los que se observó una disminución del SOL– I y II y una reducción de la somnolencia por el aumento de la vigilia en la ENV de pacientes epilépticos.3,65 Asimismo se encontró un aumento en la frecuencia de los episodios de sueño MOR, lo que sugiere que la ENV puede ser un factor de disparo del sueño MOR ya que se aumenta la duración de los episodios de REM más allá del factor de mantenimiento.16
]]> Respecto del efecto de las crisis sobre la organización del sueño, este estudio nos muestra una variación en tiempo total de la fase de SOL–I y sueño MOR. En la comparación del control grupo I y el de Pn grupo III, se observa un aumento SOL–I en un 25% y la diminución del sueño MOR en un 8%. Estos datos son semejantes a los observados en pacientes que padecen epilepsia del lóbulo temporal.66 Este resultado nos indica cómo la actividad del lóbulo temporal modifica probablemente el rol de la actividad colinérgica en la generación del sueño MOR a nivel del área parabraquial, debido a que el núcleo central de la amígdala, que fue estimulado por la Pn, tiene conexiones directas con el área parabraquial.67El retardo en la aparición de las espigas inducido por la ENV podría estar asociado a una reversión de la actividad GABAérgica en la amígdala, ya que durante la aplicación de la penicilina sola se ha observado una disminución de los niveles de unión de los receptores a benzodiacepinas en la amígdala,68 efecto que además se reforzaría con las proyecciones, también GABAérgicas, entre el núcleo central de la amígdala y el NTS.69
La inhibición de la actividad interictal ha sido reportada por nuestro grupo en dos modelos de epilepsia experimental,7,8 sugiriéndose que este efecto se deba a que el nervio vago activa, por medio del NTS, los mecanismos noradrenérgicos que tienen lugar en el locus coeruleus70,71 y se difunden hacia la amígdala del lóbulo temporal.72
Los mecanismos de acción de la estimulación eléctrica del nervio vago son aún desconocidos. En este estudio la ENV reduce las crisis por la estimulación remota del nervio vago en el lóbulo temporal, lo que está realacionado con el reporte de que en el efecto de la ENV sobre la epilepsia hay una participación de la acetilcolina y los receptores muscarínicos.14
AGRADECIMIENTOS
Por el apoyo recibido en la realización de este trabajo al INPRFM (SSA), proyecto 3220; al CONACYT: 45943–M por el apoyo recibido para la realización de este trabajo. A la asistencia técnica de Bernardo Contreras, Edith López y Germán Vega; a Raúl Cardoso y José Luis Calderón por las ilustraciones; a Alejandro Valdés Cruz por la revisión final del manuscrito y a Marcela Sánchez por la revisión del inglés.
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