Actividad Antifúngica in vitro de Extractos Acuosos de Especias contra Fusarium oxysporum, Alternaría alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp., Penicillum digitatum y Aspergillus niger

Antifungal Activity in vitro of the Aqueous Extracts of Spice's Against Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp., Penicillum digitatum and Aspergillus niger

Isaura Cáceres Rueda de León, Rafael Colorado Vargas, Erika Salas Muñoz, Laila N. Muñoz Castellanos y León Hernández Ochoa

Facultad de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de Chihuahua, Campus Universitario # 2, Chihuahua, Chihuahua, Apartado Postal 669, CP 31125, México. Correspondencia: lhernandez@uach.mx

Recibido: Junio 21, 2013
Aceptado: Marzo 12, 2014

Resumen

En el presente trabajo se evaluó la actividad antifúngica in vitro de extractos acuosos de especias de clavo (Eugenia caryophyllata) canela (Cinnamomum zeylanicum); y orégano mexicano (Lippia berlandieri) obtenidos mediante la técnica de hidrodestilación, contra seis de los principales hongos patógenos que atacan a los alimentos (Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp., Penicillum digitatum y Aspergillus niger). La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó utilizando la técnica de inhibición del crecimiento micelial y los componentes principales de los extractos acuosos obtenidos se evaluaron por HPLC. Los resultados obtenidos mostraron que el extracto acuoso de orégano presentó la mejor capacidad de inhibición de crecimiento radial del micelio con una concentración de 40 mg/L. Los principales constituyentes identificados en los extractos acuosos de las especies estudiadas fueron ácidos fenólicos, flavonoides, y compuestos volátiles (Eugenol, Timol y Carvacrol).

Palabras clave: Extractos acuosos, actividad antifúngica, hongos patógenos, clavo (Eugenia caryophyllata), canela (Cinnamomum zeylanicum).

Abstract

In the present study the antifungal activity in vitro of the aqueous extracts of clove (Eugenia caryophyllata) cinnamon (Cinnamomum zeylanicum); and Mexican oregano (Lippia berlandieri) obtained by hydrodistillation process were evaluated, against six major pathogenic fungi that cause diseases in food (Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp., Penicillum digitatum y Aspergillus niger). The minimum inhibitory concentration (MIC) was determinate by inhibition of mycelia growth and the principal compounds contained in the aqueous extracts were analyzed by HPLC. The results showed that the aqueous extracts of Mexican oregano showed major inhibition of mycelia growth with a 40mg/L. The principal constituents identified in the spice extracts were phenolic acids, flavonoids, and volatile compounds (Eugenol, Thymol and Carvacrol).

El tema de seguridad de alimentos con relación a la contaminación microbiana, la cual proviene, principalmente de hongos y bacterias, representa un reto en la actualidad debido a la alta demanda de los consumidores para la sustitución de conservadores químicos debido a que algunos de ellos han demostrado tener efectos cancerígenos en la salud; una solución a esta problemática son los productos naturales (Falerio et al., 2005; Nutcha et al., 2006). Se ha demostrado que una gran variedad de plantas contienen compuestos naturales, los cuales presentan actividad antioxidante, anti cancerígena, así como antimicrobiana, entre otras (Shan et al., 2005; Wojdylo et al., 2007); Estos compuestos son llamados agentes antimicrobianos y pueden ser añadidos intencionalmente al alimento o a empaques, debido a que retardan el crecimiento o causan la muerte de los microorganismos aumentando así, la resistencia de la alteración de calidad o seguridad de un alimento (Davidson y Zivanovic, 2003); en estado natural, estos compuestos pueden desempeñar el papel de conservadores de alimentos de una manera natural y sin comprometer la salud de los consumidores (Beuchat, 2001); esto, debido a que varios de los agentes antimicrobianos han demostrado tener actividad biológica, la cual puede provenir de sus diversos componentes fenólicos presentes (Zhen-Dan et al., 2005; Shan et al., 2005; Cha y Chinnan, 2004). Para extraer dichos compuestos también es necesario el desarrollo de técnicas que permitan la obtención de éstos, como es el caso de la hidrodestilación (Hernández-Ochoa et al., 2012) proceso por el cual, se obtienen los aceites esenciales que han sido ampliamente estudiados por su actividad biológica (Lambert et al., 2001). Los aceites esenciales contienen hasta un 3 % de moléculas activas (Ortuño, 2006) sin embargo, su fuerte olor y sabor, en la mayoría de los casos, impide la aceptación de los consumidores. En el proceso de extracción de los aceite esenciales, existe una segunda fase, llamada extracto acuoso o agua floral, la cual, según recientes estudios, puede presentar actividad biológica contra diferentes tipos de bacterias, incrementando las expectativas para su utilización como conservador natural en alimentos, ya que algunos de los componentes activos contenidos en el aceite esencial pueden migran hacia el extracto acuoso (Hernández-Ochoa et al., 2012). Estudios de extractos acuosos de plantas, obtenidos por distintos métodos, ya se han utilizado recientemente para la producción de fungicidas alimentarios, incluyendo extractos de pino (Pinus sylvestris) abeto rojo (Picea abies), ajo (Allium sativum), albahaca, romero, laurel entre otros (Eslaminejad et al., 2012; Özcan et al., 2011). En el presente trabajó se investigó la actividad antifúngica y composición química de extractos acuosos de clavo, canela y orégano mexicano para la inhibición de seis de los principales hongos patógenos en alimentos: Fusarium oxysporum, Trichoderma spp., Aspergillus niger, Alternaria alternata, Geotrichum candidum y Penicillum digitatum.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materia vegetal. Se utilizaron partes de tallo, hojas y flores de la planta de orégano mexicano (Lippia berlandieri Schauer) cultivada en la región de Chihuahua. Los frutos de canela (Cinnamomum zeylanicum) y clavo (Eugenia caryophyllata) fueron adquiridos en la empresa Comercial Cardona S.A. de la misma ciudad; todas las muestras fueron provenientes del mismo lote y almacenadas a temperatura ambiente (27±2 °C).

Material biológico. Tres de las cepas utilizadas (Fusarium oxysporum, Trichoderma spp. y Aspergillus niger) fueron obtenidas del cepario de la Facultad de Ciencias Químicas. Alternaria alternata fue aislado de jitomate tipo saladette (Lycopersicum esculentum) y pimiento (Capsicum annuum L.) ambos en proceso de descomposición con daño cuticular notable; Geotrichum candidum se aisló de queso tipo panela y Penicillum digitatum se obtuvo del Capulin (Ardisia compressa); todas las cepas fueron aisladas de acuerdo a lo publicado por Agrios (2005); una vez identificado el daño cuticular en los productos se realizaron cortes profundos y triangulares con un bisturí de una profundidad de aproximadamente 0.5 cm en las zonas de necrosis externa, se desinfestaron en una solución de hipoclorito de sodio al 2 % por 30 seg y después recibieron 3 lavados con agua esteril, finalmente se colocaron en gasas estériles para retirar el exceso de agua. Las muestras fueron sembradas en agar PDA (papa-dextrosa-agar BD Bioxon) y posteriormente identificadas morfológicamente de acuerdo al manual de Barnett y Hunter (1998).

Hidrodestilación. Las especias se sometieron individualmente al proceso de hidrodestilación utilizando un aparato modificado de extracción tipo Schilcher, con una relación de 1/10 (p/v) según lo publicado por Hernández-Ochoa et al., 2012. La extracción tuvo una duración total de 5 h, y al final del proceso se recuperaron los extractos acuosos en frascos color ámbar para evitar la oxidación, las muestras fueron almacenadas en refrigeración a 4 °C.

Determinación de la concentración. Se realizó mediante una separación líquido-líquido (extracto/acetato de etilo) en un embudo, en una relación 1:2 (v/v). La fase orgánica de este proceso se llevó a un rotavapor y la determinación de la concentración se realizó mediante la diferencia de pesos del matraz con la ecuación 1:

Determinación de la Composición Química mediante HPLC. El equipo utilizado fue un Sistema HPLC Dionex (P680 Solvent Rack SOR-100) unido a una bomba doble para solventes y un detector UV; con columna C-18 Varian Polaris 5 (5 µm, 250 x 4.6 mm) con un flujo de 0.8 mL/min y un volumen de inyección de 20 µL siendo filtradas las muestras con filtros de 0.2 µ antes de ser inyectadas. La detección se llevó a cabo a 280 nm. Los compuestos fenólicos obtenidos de las 3 diferentes especias se analizaron mediante el método descrito por Shan et al. (2005), el cual consiste en un programa de gradientes entre dos diferentes soluciones: ácido fórmico al 2.5 % (solución A) y metanol 100 % (solución B). Estándares comerciales para la identificación fueron utilizados: ácidos fenólicos (ácido rosmarínico, acido cinámico y ácido hidroxicinámico), cinamaldehído, acetil eugenol, alcohol cinámico, ácido ρ-coumarico, eugenol, quercetina, acetato de eugenol, cariofileno, ácido gálico, catequina, epicatequina, timol, carvacrol, ácido vainillico, ácido cafeico, ρ-cimeno, ácido clorogénico, kaempferol y ácido rosmarínico. Todos los análisis de identificación se realizaron por triplicado. Se utilizó una de longitud onda amplia para identificar diferentes tipos de polifenoles y todas las muestras fueron almacenadas a 4 °C.

Actividad biológica de extractos acuosos. Se determino la CMI de acuerdo a la metodología descrita por Carrillo et al., (2003) en cultivos de PDA con diez diferentes concentraciones de extracto: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 ppm. Se sembró cada uno de los hongos seleccionados, utilizando trozos discoidales de 4 mm de diámetro hechos con un horadador, tomados de una colonia de siete días de desarrollo y se colocaron en el centro de las cajas petri con los tratamientos. Las muestras se incubaron a 27±2 °C durante siete días y para el registro de su crecimiento se midió la colonia en dos diámetros perpendiculares con un Vernier para poder calcular el promedio del crecimiento del micelio. Se realizaron tres repeticiones por cada tratamiento, más un testigo, con inoculo sin tratamiento para cada uno de los extractos acuosos y concentraciones probadas. Una vez que se determinaron los valores cercanos a las concentraciones mínimas inhibitorias, se procedió a reducir el número de ensayos y realizar pruebas en intervalos de 50 ppm, dentro del rango de inhibición. Se realizó el análisis de varianza mediante el programa estadístico Minitab versión 15 y las pruebas se establecieron en relación a la comparación de medias de Tukey (p < 0.05) con tres replicas por muestra.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis fisicoquímicos. Los resultados obtenidos para los análisis de pH de los extractos acuosos, mostraron que todos los extractos presentaron valores ácidos, siendo 5.3 ± 0.11 para el clavo, 5.5 ± 0.2 para canela y 6.2 ± 0.11 para orégano presentando diferencia significativa entre ellos (p < 0.05). En el caso de la densidad, se obtuvieron valores muy similares a los del agua, con 0.9977 ± 0.0009 para el extracto acuoso de canela, 0.9977 ± 0.0015 para clavo y finalmente 0.9975 ± 0.0002 para orégano, sin significancia entre ellos (p > 005), éste valor se debe a que los extractos presentan características muy parecidas a las del agua como ser un líquido no viscoso y polar. Las concentraciones finales, posterior a la eliminación del agua de los extractos acuosos obtenidos fueron de 1009.4 mg/L para la canela; 715.5 mg/L para el clavo y finalmente, el orégano con 500 mg/L. Concentraciones similares fueron reportadas por Seori et al., (2011).

Determinación de compuestos principales mediante HPLC. Los principales compuestos fenólicos presentes en los extractos acuosos obtenidos fueron en su mayoría ácido gálico, flavonoides (catequina y kaempferol) y compuestos volátiles como eugenol, timol y carvacrol como se puede observar en la Figura 1, que muestra los cromatogramas obtenidos por HPLC para: A clavo (Eugenia caryophyllata), B orégano mexicano (Lippia berlandieri), C canela (Cinnamomum zeylanicum); detectados a 280 nm. Los resultados obtenidos muestran que, de la misma manera que en el aceite esencial (obtenido en el proceso de hidrodestilación por el cual se separa el extracto acuoso) analizado mediante técnicas de cromatografía de gases, los compuestos mayoritarios en los aceites esenciales son los mismos que lograron migrar hacia la fase acuosa, manteniendo sus proporciones mayoritarias, esto se puede deber a que los extractos hidrofílicos han demostrado ser uno de los mejores solventes para moléculas como los polifenoles (Suresh et al., 2011). La figura 1A, muestra la composición química determinada para el extracto acuoso de clavo, donde su principal compuesto identificado fue eugenol. También se identificaron algunos flavonoles como la catequina y kaempferol, y se pudo mínimamente detectar trazas de ácido clorogénico así como ρ-cimeno. En el caso del extracto acuoso de orégano, los resultados obtenidos mostraron que tiende a acumular en su composición química concentraciones más altas de timol que de carvacrol, como lo muestra la figura 1B, estos resultados son muy similares a los obtenidos por Rivero-Cruz et al., (2011) en los cuales mencionan que los isómeros timol y carvacrol, así como ρ-cimeno son los compuestos mayoritarios del extracto acuoso del orégano mexicano Polimintia longiflora y Lippia graveoles. En el extracto acuoso de canela (Cinammomun zeylanicum) analizado en el presente estudio (Figura1C) se determino la presencia de Cinamaldehido como compuesto mayoritario y en menor proporción de Kaempferol, asi como trazas de alcohol cinámico, estos resultados son similares a los obtenidos por Shan et al., (2005).

Actividad biológica de extractos acuosos. Se determinaron las Concentraciones Mínimas Inhibitoria de los tres extractos acuosos utilizados contra los seis tipos de hongos de estudio, los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1, en la cual se puede observar que el extracto acuoso de orégano presentó mayor actividad biológica contra los hongos en estudio, demostró tener mayor inhibición de los hongos y reducir la velocidad de crecimiento en casi todos los casos. El extracto acuso de orégano confirma tener gran actividad biológica fungistática y fungicida tanto para la especie de Fussarium oxysporum como para Aspergillus niger, mostrando inhibición total a 200 ppm, mientras que para A. alternata, G. candidum, Trichoderma spp. y Penicillum digitatum a partir de 250 ppm. Es importante mencionar que, no se encontraron referencias bibliográficas de la actividad antifúngica de extractos acuosos de esta variedad de orégano, por lo que los resultados obtenidos fueron comparados con los referenciados por Jasso de Rodríguez et al. (2011) sobre la actividad biológica del aceite esencial y extractos obtenidos con solventes de Lippia graveonlens, en los cuales se menciona que extractos de orégano fueron activos contra R. stolonifer, C. gloeosporioides, P. digitatum a concentraciones de 500 µ1L^-1 4000 µ1L^-1 y 3000 µ1L^-1 respectivamente. El extracto acuoso de clavo presento actividad biológica a 800ppm para todos los hongos en estudio. Se ha demostrado que el aceite esencial de clavo posee actividad antifúngica in vitro, afectando especies que se desarrollan frecuentemente en los alimentos tales como Paeciliomyces, Peniclilium spp., Rhizophus spp., Rhizomucor spp., inclusive algunas especies de Aspergillus (Joseph and Sujatha, 2011) y que inhibe perceptiblemente el crecimiento de Aspergillus flavus, A. niger, Fusarium oxysporum, F. chrysogenum, Penicillium spp., a partir de 500 ppm y 1000 ppm (Kritzinger et al., 2002). Es difícil atribuir la actividad biológica de mezclas naturales y complejas como los aceites esenciales y extractos acuosos a un componente particular. Generalmente, los componentes principales se encuentran para reflejar absolutamente bien las características biofísicas y biológicas de los extractos (Bakkali et al., 2008). Sin embargo, es razonable asumir que la actividad fúngica de este extracto se puede relacionar con la presencia de una alta concentración (75-100 %) de Eugenol. Los componentes con estructura fenólica como el eugenol son altamente activos contra microorganismos (Gupta et al., 2008). Este compuesto fenólico puede desnaturalizar las proteínas y reacciona con los fosfolípidos de la membrana celular que cambian su permeabilidad (Bhuiyan et al., 2010), lo cual se explica por la naturaleza ácida del grupo hidroxilo, que forma un puente de hidrógeno con un centro enzimático activo. Generalmente, los componentes principales parecen reflejar absolutamente bien las características biofísicas y biológicas de los aceites esenciales y extractos de los cuales fueron aislados, la amplitud de sus efectos que están dependientes de su concentración cuando fueron probados los aceites y extractos provenientes de una especie, efecto que disminuye al realizar la combinación de plantas. Así, funciones sinérgicas de varias de las moléculas contenidas en un aceite esencial o en extractos, con respecto a la acción de uno o dos componentes principales, parece cuestionable. Sin embargo, es posible que la actividad de los componentes principales, está modulada por otras moléculas de menor importancia (Bakalli et al., 2008). La actividad antifúngica del extracto acuso de Canela (Cinammomun zeylanicum) se pudo determinar a concentraciones de 500 ppm para todos los hongos utilizados en el estudio, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Singh et al., (2007) los cuales determinaron la actividad biológica del aceite esencial y oleorresinas de canela (Cinnamomun zeylanicum) demostrando la completa inhibición micelial contra Aspergillus flavus, A. ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Penicillium citrium y Penicillium viridicatum a 6 µL. Es importante mencionar que no se conoce un mecanismo específico de acción acerca de cómo funcionan los extractos y aceites esenciales, sin embargo, una de las posibles explicaciones es el efecto de permeabilidad, debido a que cada célula está rodeada por una capa llamada membrana permeable, gracias a esta membrana semipermeable cada célula puede excluir compuestos químicos o bien dejarlos entrar, según sea el caso. Esto significa que, algunos fungicidas quedarán excluidos o parcialmente excluidos por la membrana semipermeable y otros podrán pasar; la membrana ha de contener proteínas y grasas. Por lo que, el compuesto debe poseer grupos solubles en agua y grupos solubles en grasas. La mayor parte de la molécula soluble en agua (grupos polares) se disolverán en la fase exterior proteica de la membrana semipermeable. Luego el grupo soluble en grasas, no polar, se disolverá en la parte central de la membrana. Si el compuesto puede disolverse en ambas partes de esta membrana, tendremos un compuesto capaz de penetrar (Zulueta-Rodríguez et al., 2007).

CONCLUSIÓN

Diferentes tipos de hongos patógenos alimentarios (F. oxysporum, A.alternata, G. candidum, Trichoderma spp., P. digitatum y A.niger) fueron inhibidos in vitro por extractos acuosos de especias obtenidos por hidrodestilación. El extracto acuoso de orégano presentó la mejor capacidad de inhibición de crecimiento radial del micelio con una concentración de 40 mg/L. La actividad biológica se pudo atribuir a los diferentes compuestos fenólicos encontrados en el análisis de la composición química. Los principales constituyentes identificados en los extractos acuosos de las especies estudiadas fueron ácidos fenólicos, flavonoides, y compuestos volátiles (Eugenol, Timol y Carvacrol).

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