Localización In Situ de Inclusiones del Virus Tristeza de los Cítricos con Anticuerpos Desarrollados Contra la Proteína Recombinante no Estructural p20

In Situ Localization of Citrus tristeza virus Inclusion Bodies with Antibodies Developed to the Recombinant p20 Non-Structural Protein

María Magdalena Iracheta Cárdenas¹, Sanjuanita Lyzzeth Salazar Martínez¹, María Luisa Cárdenas Ávila² y Mario A. Rocha Peña³

¹ Universidad Autónoma de Nuevo León Instituto de Biotecnología, Ave. Universidad s/n. Cd. Universitaria. San Nicolás de los Garza, Nuevo León CP 66450, México.

³ Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL), Facultad de Ciencias Biológicas (FCB), Laboratorio de Virología Vegetal. Apartado Postal 128-F. Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, Nuevo León CP 66450 México. Correspondencia: mario.rochape@uanl.edu.rnx

Recibido: Junio 29, 2012
Aceptado: Agosto 23, 2012

Resumen

Se describe el desarrollo de un inmunoensayo para la localización in situ de inclusiones virales inducidas por el virus tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus = CTV) mediante microscopía de luz con anticuerpos preparados contra la proteína recombinante p20 no estructural del CTV. Se emplearon cortes manuales de aproximadamente 100 µm de grosor a partir de corteza de varetas de plantas de cítricos sanas e infectadas por el CTV. Los cortes se fijaron en 70 % de etanol y se incubaron subsecuentemente con anticuerpos anti-p20 desarrollados ya sea en rata o conejo en diluciones de 1:5,000 y 1:10,000 y 1:1,000 y 1:3,000 respectivamente, y con conjugados comerciales IgG anti-especie en diluciones de 1:30,000 para cada uno de ellos, agregando al final la solución cromogénica compuesta por NBT/BCIP. Las inclusiones virales se visualizaron en un microscopio de luz a 10 y 40 aumentos en forma de áreas irregulares con coloración azul obscura en el área del floema y fibras del floema en cortes efectuados con plantas infectadas por el CTV; los tejidos provenientes de plantas sanas no presentaron ningún tipo de coloración, lo que permitió discriminar plantas sanas e infectadas por el CTV.

Palabras clave: DIBA, serología, proteína recombinante, microscopía de luz.

An in situ immunoassay is described for localization of Citrus tristeza virus (CTV) inclusion bodies by light microscopy with antibodies developed to the recombinant p20 non-structural protein. Free hand bark sections of ca. 100 µm tick from healthy or CTV infected plants were fixed with 70 % ethanol and subsequently incubated with specific polyclonal antiserum anti-p20 either from rat or rabbit at dilutions 1:5,000 y 1:10,000 y 1:1,000 and 1:3,000 respectively and IgG anti species at 1:30,000 dilution; at the end, the chromogenic solution NBT/BCIP was added. Viral inclusion bodies were visualized by light microscopy at 10 and 40X magnifications as dark blue irregular areas in phloem associated tissues in CTV infected plants; no dark blue color was observed in the phloem tissues of healthy plants.

Keywords: DIBA, serology, recombinant protein, light microscopy.

El virus tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus = CTV, género Closterovirus, familia Closteroviridae) consiste de partículas largas y flexibles de 2000 x 12 nm de tamaño y se restringe al floema de plantas infectadas (Bar-Joseph y Lee, 1989). El virus induce la formación de inclusiones amorfas características en el citoplasma de células asociadas al floema en diversos hospedantes cítricos infectados con diferentes aislamientos del virus con propiedades biológicas diversas (Bar-Joseph y Lee, 1989; Brlansky y Lee, 1990; Miao y Skaria, 2002; Schneider, 1959). El RNA genómico del CTV (RNAg) consiste de 12 marcos de lectura abierta los cuales codifican para por lo menos 12 productos de naturaleza proteica (Karasev et al., 1995); la presencia de inclusiones virales del CTV se ha asociado a la acumulación de una proteína no estructural con una masa molecular de aproximadamente 20kDa, producida por el gen p20 situado en la porción proximal 3' del genoma del virus (Gowda et al., 2000). El presente estudio reporta el uso de anticuerpos desarrollados contra la proteína recombinante p20 no estructural del CTV para la localización in situ de inclusiones virales empleando microscopía de luz.

Se emplearon muestras de árboles de toronjo (Citrus paradisi Macf.) con antecedentes de infección positiva al CTV procedentes de la huerta Los Castores en el municipio de General Terán, Nuevo León. Como testigos negativos se emplearon árboles sanos de naranjo dulce {Citrus sinensis (L.) Osbeck}, limón (Citrus limon L.) y tangor Murcott (mandarino x naranjo) del Lote de Variedades del Campo Experimental General Terán, del INIFAP. Las muestras estuvieron compuestas por seis a ocho brotes recién expandidos, colectados alrededor de la copa de los árboles, a una altura aproximada de 1.50 m sobre el nivel del suelo. Todas las muestras se analizaron mediante inmunoadherencia a membranas de nitrocelulosa (DIBA = dot-immunobinding assay) (Rocha-Peña et al., 1991) con anticuerpos policlonales desarrollados para la proteína recombinante p25 de la cápside (Iracheta-Cárdenas et al., 2008) para verificar su estado con respecto a la infección por CTV. Las muestras positivas al CTV fueron las de los árboles de toronja con clave A2, A7, A12, A27, A110 y A111; mientras que las muestras de toronja A1, A6, A10, A11, A15 naranja F3A2, F4A1, F4A2, limón F5A3, F7A1 y el tangor Murcott dieron resultados negativos de infección por el CTV (Cuadro 1).

Para la localización de inclusiones virales se emplearon anticuerpos anti-p20 desarrollados en conejo raza Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus L.) (clave 201) y en ratas albinas (Rattus norvegicus Berkenhout). Los anticuerpos anti-p20 se prepararon en ambas especies de mamíferos según lo descrito por Iracheta-Cárdenas et al. (2008) para la proteína recombinante p25 del CTV y se emplearon en forma de antisuero crudo diluido de 1:1,000 hasta 1:10,000 en solución de TBST-PVP (= TBS 1X, + Tween 0.05 % + PVP 2 %). Los ensayos de inmunoensayo in situ se efectuaron en cortes manuales de alrededor 100 µm de grosor de corteza de varetas de cada una de las muestras de cítricos positivas y negativas al CTV. Se emplearon de 3 a 5 varetas de cada una de las muestras de cítricos y se realizaron cinco cortes de cada vareta, para tener un total de entre 25 a 50 cortes por muestra. Los cortes se sumergieron en 5 mL de etanol al 70 % por cinco minutos, en agitación a 25 ^oC. Se retiró el etanol y se incubaron por separado con 5 mL de los anticuerpos anti-p20 respectivos {rata (clave R2) o conejo (201)} diluidos en solución amortiguadora TBST-PVP; se lavaron con 5 mL de solución TBST-PVP de cinco a diez minutos. Posteriormente, los cortes se incubaron con 5 mL de IgG anti-IgG de rata-AP (Sigma A8438) o IgG anti-IgG de conejo-AP (Sigma A3812), según fuera el caso, a 25 ^oC. Se lavaron en agitación con 5 mL de solución TBST-PVP y dos veces con TBS -Tween 0.05 %, por cinco a diez minutos. Finalmente, se adicionó como sustrato y cromógeno NBT (azul de nitro tetrazolio) y BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoilo) (Sigma B3804) por un período de dos horas para visualizar los sitios de acumulación de la proteína p20. Los cortes se observaron en un microscopio de luz Leica DME bajo aumentos de 10X y 40X. Por procedimiento general, las muestras de tejidos se dejaron incubando con los anticuerpos anti-p20 respectivos (rata R2 y conejo 201) por 14-18 h en refrigeración (5-10 °C) a diferentes concentraciones de los mismos. La incubación con los conjugados enzimáticos IgG anti rata y IgG anti conejo fue de 2 h a temperatura de laboratorio.

En términos generales, se encontró consistentemente la presencia de un precipitado azul oscuro en tejidos asociados a floema en los cortes efectuados con todas las muestras positivas al CTV con los anticuerpos anti-p20 tanto de rata R2, como de conejo 201. Los anticuerpos de rata R2 anti-p20, fueron efectivos para la observación de inclusiones virales en diluciones de 1:5,000 y 1:10,000 de antisuero crudo (Figuras 1 A y B). ). De igual forma, se observó la presencia de precipitado azul oscuro en tejidos asociados a floema con los anticuerpos de conejo (201) anti-p20 en diluciones de 1:1,000 (Figuras 1C y D) y de 1:3,000, con un número reducido de muestras positivas al CTV (datos no mostrados). Las muestras de cítricos sanos empleadas como testigos negativos (Cuadro 1), sometidas a inmunoensayo in situ con anticuerpos anti-p20 de rata R2 (Figura 1E) y de conejo 201 (Figura 1F), no presentaron ningún tipo de precipitado de color azul oscuro en ninguno de los tejidos analizados de naranjo dulce, limón, ni tangor Murcott.

De acuerdo a los resultados obtenidos, la formación del precipitado azul oscuro del cromógeno se ubicó en forma particular en los tejidos asociados al floema en plantas infectadas por el CTV; lo anterior demostró la reactividad de los anticuerpos anti-p20 con la proteína p20 no estructural del CTV. Los cuerpos de inclusión observados en el floema mediante los anticuerpos anti-p20 en el presente estudio, no solo presentan gran similitud con los reportados para este virus tanto con las tinciones con Azure A (Bar-Joseph y Lee, 1989; Brlansky y Lee, 1990; Miao y Skaria, 2002), y con anticuerpos monoclonales anti-CTV reportados por Lin et al. (2000), sino que también lo tienen con los cuerpos de inclusión formados por otros miembros de la familia Closteroviridae, como es el caso de los virus del amarillamiento de la remolacha (BYV) (Esau et al., 1967), del enrollamiento de la hoja de vid (Faoro et al., 1991), amarillamiento infeccioso de la lechuga (LIYV) (Medina et al., 1998), clorosis infecciosa (TICV) (Wisler et al., 1996) y clorosis del tomate (ToCV) (Wisler et al., 1998).

De acuerdo a la literatura, solo existen dos trabajos en donde se han empleado anticuerpos para la detección de la proteína p20 no estructural del CTV: el trabajo original de Gowda et al. (2000) en donde se determinó la función y expresión de la proteína p20 en tejido infectado de cítricos y el trabajo de Ecale-Zhou et al. (2002) que consistió en un estudio a nivel de ultra estructura y citopatología en naranjo (C. sinensis) y limón mexicano {Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle}; en ambos estudios se emplearon anticuerpos conjugados con oro y la detección se llevó a cabo mediante microscopía electrónica. De acuerdo a nuestro conocimiento, este es el primer trabajo en que se emplean anticuerpos desarrollados contra la proteína p20 recombinante del CTV para la discriminación de plantas sanas e infectadas por el CTV; asimismo, el estudio comprendió el modelo con una combinación de anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina y una solución cromogénica que precipita en los sitios de acumulación de la proteína p20 presente en las inclusiones virales, las cuales se pueden visualizar con facilidad a nivel de microscopía de luz. El empleo de anticuerpos marcados con oro reportado en los trabajos de Gowda et al. (2000) y Ecale-Zhou et al. (2002) tiene como inconveniente la necesidad de recurrir a la microscopía electrónica.

CONCLUSIONES

Partiendo de los resultados obtenidos en el presente estudio se llegó a las siguientes conclusiones:

Los anticuerpos anti-p20 de rata R2 y de conejo 201 reconocieron a la proteína no estructural p20 en su forma nativa mediante inmunoensayo in situ en cortes de corteza de plantas de cítricos infectados por el CTV. Con los anticuerpos anti-p20 de rata R2 y de conejo 201 se discriminó tejido infectado por el CTV, de tejido de plantas sanas.

AGRADECIMIENTOS. La presente investigación tuvo financiamiento del CONACYT-México, Proyecto 83427 CB 2007-1. Los autores agradecen al Comité Estatal de S anidad Vegetal de Nuevo León, con sede en Montemorelos, N.L., por permitir el acceso y toma de muestras en plantas infectadas por el CTV en proceso de erradicación en huertas de General Terán, Nuevo León, México.

LITERATURA CITADA

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