Respuestas Genéticas Provocadas por el Tratamiento con Isotiocianatos en Hongos del Género Alternaria

Genetic Responses Induced by Isothiocyanates Treatment on the Fungal Genus Alternaria

María Elena Báez Flores¹, Rosalba Troncoso Rojas² y Martín Ernesto Tiznado Hernández²

¹ Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Culiacán, Sin., CP 80000, México.

Recibido: Julio 16, 2008
Aceptado: Noviembre 12, 2008

Resumen

Los isotiocianatos son compuestos naturales con potente actividad antifúngica producidos por Brassicas como parte de su sistema de defensa. Estos compuestos representan una alternativa a la utilización de compuestos químicos para el control de infecciones fúngicas en productos agrícolas. El objetivo de la revisión fue analizar los estudios publicados acerca de los mecanismos moleculares de la respuesta de hongos al efecto tóxico de los isotiocianatos. Los estudios en Alternaria brassicicola demuestran la inducción de genes cuyos productos cumplen funciones en estrés oxidativo (citocromo P450, tioredoxinas y oxidoreductasas), así como en la excreción de isotiocianatos (glutatión-S-transferasas y transportadores ABC). El hongo A. brassicicola es un patógeno especializado en Brassicas, mientras que Alternaria alternata es un patógeno generalista. Sin embargo, en A. alternata también se reportó la inducción de un gen codificando a un transportador ABC. En base a los datos de la revisión se puede concluir que el mecanismo de respuesta a isotiocianatos en hongos incluye la formación de un conjugado isotiocianato-glutatión que es excretado mediante un transportador ABC. Se sugiere que la utilización de isotiocianatos en combinación con inhibidores de transportadores ABC, podría evitar la resistencia fúngica y constituiría un tratamiento amigable con el ambiente y la salud humana.

Palabras clave: Brassicas, fungicidas, mecanismo molecular de respuesta, transportador ABC, glutatión-S-transferasa.

Abstract

Keywords: Brassicas, fungicides, response molecular mechanism, ABC transporter, glutathione-S-transferase.

Uno de los retos para aumentar el suministro mundial de alimentos, es el de reducir las pérdidas post-cosecha de frutas y hortalizas que pueden variar desde un 10 hasta un 50% de la producción total (Barbosa-Cánovas et al., 2003). Una de las causas principales de enfermedades post-cosecha en frutas y hortalizas son los hongos fitopatógenos (Sharma et al., 2009). El método utilizado para controlar las enfermedades fúngicas se basa, casi exclusivamente, en la utilización de productos químicos sintéticos. Sin embargo, en las últimas décadas, los esfuerzos se han dirigido a obtener una mejor comprensión de los efectos biológicos de los compuestos aislados de plantas que tienen una potencial aplicación en el control de enfermedades y plagas, debido a la reciente tendencia a utilizar alternativas más seguras para el control de hongos y a reducir al mínimo la dependencia de pesticidas artificiales (Troncoso-Rojas y Tiznado-Hernández, 2007). Se espera que el uso de compuestos naturales tenga un menor impacto sobre los ecosistemas, ya que a diferencia de los productos químicos sintéticos, éstos son biodegradables y no se acumulan en el medio ambiente. Los isotiocianatos (iTCs) se encuentran entre los compuestos alternativos debido a su potente actividad fungicida (Tiznado-Hernández y Troncoso-Rojas, 2006), así como a sus efectos positivos sobre la salud humana (Vig et al., 2009). Se ha reportado que Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler es eliminado por medio de bajas concentraciones de 2-propenil-isotiocianato (Troncoso-Rojas et al., 2005). Sin embargo, el modo de acción del ITCs no se ha podido entender por completo (Manici et al., 1997). Por otra parte, algunas otras especies del género Alternaria son capaces de infectar especies de Brassica spp., los cuales utilizan ITCs como mecanismo de defensa, tales como A. brassicicola y A. brassicae (Sigareva y Earle, 1999). La posibilidad de los hongos de desarrollar resistencia contra ITCs hace que sea importante entender las bases moleculares de este fenómeno, de tal forma que sea posible conocer los genes que son inducidos en respuesta a estos compuestos naturales y, en consecuencia, cuáles son las proteínas involucradas en el mecanismo de defensa de los hongos. Por consiguiente, el objetivo de esta revisión es analizar la literatura sobre las bases moleculares de la respuesta adaptativa de hongos del genero Alternaria a los efectos tóxicos del ITC.

Isotiocianatos y su actividad biocida. Las plantas producen metabolitos secundarios, los cuales desempeñan distintas funciones entre las que cabe citar: participación en el mecanismo de defensa contra los depredadores, o como sustancias de reserva. Entre estos metabolitos están los glucosinolatos (GLSs), que son productos naturales que contienen nitrógeno y azufre, presentes principalmente en algunas especies de la familia Brassicaceae, tales como: mostaza, brócoli, col, coliflor, rábano, nabo y canola (Fahey et al, 2001). Los GLSs no son compuestos tóxicos per se; sin embargo, la pérdida de la compartimentalización celular por daño en los tejidos puede unir las moléculas de GLSs con la enzima mirosinasa, que hidroliza a los GLSs, produciéndose así una aglicona inestable que se reorganiza, de forma espontánea, en compuestos biológicamente activos como tiocianatos, ITCs y nitrilos, dependiendo de la concentración de hierro en las células, la sustitución de las cadenas laterales y el pH de la célula (Wisttock y Halkier, 2002). De los compuestos mencionados, los ITCs tienen la mas amplia actividad biocida, incluyendo la inhibición de hongos (Mayton et al., 1996), bacterias (Tajima et al., 1998), nemátodos (Kermanshai et al., 2001), insectos (Ratzka et al., 2002) y semillas de maleza (Brown y Morra, 1995). El mecanismo por el cual los ITCs inhiben el crecimiento de hongos y microorganismos aún no se conoce bien. Algunas hipótesis proponen que los ITCs son la causa de inactivación de las enzimas intracelulares por medio de la degradación oxidativa de los puentes disulfuro, de la inhibición de enzimas metabólicas por la acción del radical tiocianato y la acción desacopladora de la fosforilación oxidativa. Al parecer, la alta reactividad de los ITCs se debe principalmente a la fuerte naturaleza electrofílica del grupo funcional Isotiocianato (-NCS) (Kroll et al., 1994). Experimentos in vitro demostraron que el alil-isotiocianato puede formar enlaces covalentes con el grupo de azufre reactivo de glutatión (Kawakishi y Kaneko, 1987), así como con los grupos amino y sulfhidrilo libres de los aminoácidos (Cejpek et al., 2000), lo cual sugiere que los ITCs pueden reaccionar químicamente con las proteínas a través de los grupos aminos y los grupos sulfhidrilos libres que están presentes en los grupos laterales de los residuos de aminoácidos, tales como la lisina, la arginina y la cisteína. La actividad antifúngica de los ITCs parece ser más al azar que específica, ya que podría reaccionar con cualquier proteína de la célula fúngica. Esta naturaleza no específica del sitio de acción de los ITCs hace poco probable una mutación que podría inducir un fenotipo de resistencia en los hongos, tal como ha sido observado con algunos fungicidas sintéticos.

Mecanismos bioquímicos y genéticos implicados en la resistencia a los hongos. La capacidad de los fitopatógenos necrotróficos para detoxificar metabolitos secundarios puede ser un factor importante en la determinación de la especificidad del hospedero. Este mecanismo hace posible que las especies de Alternaria se especialicen en determinados taxa. Por ejemplo, A. solani es específico de tomate y papa, mientras que A. brassicae y A. brassicicola son específicos de Brassicas. En estos hongos, los ITCs pueden funcionar como un estímulo para activar los genes necesarios para la patogénesis, mientras que una especie generalista como A. alternata, carece de un sistema de enzimas de detoxificación contra compuestos de defensa de las Brassicas (Giamoustaris y Mithen, 1997). La tolerancia de un fitopatógeno, en particular a los compuestos tóxicos, resulta de las actividades de degradación celular que transforman a los compuestos de defensa de las plantas en substancias menos tóxicas. Las enzimas de degradación son importantes para estos hongos, ya que eliminan el efecto de los compuestos tóxicos del hospedero, lo que permite a los hongos infectarlo. Esto fue demostrado en mutantes específicos generados por la inactivación de genes. Por ejemplo, los mutantes del fitopatógeno de la avena, Gaeumannomyces graminis, no son capaces de infectar a la avena debido a un defecto en la producción de avenacinasa, una enzima detoxificante de la avenacina, una saponina producida por las plantas de avena (Osborne, 1996). Otros mecanismos de tolerancia de los hongos a compuestos tóxicos se relaciona con las enzimas de la fase I y fase II, citocromo P450 y la glutatión-S-transferasa (GST), respectivamente (Sellam et al., 2006), o con las proteínas integrales de membrana que secretan compuestos tóxicos de la célula (Del Sorbo et al., 2000). Los citocromos P450 pueden metabolizar las sustancias exógenas, tales como fármacos, toxinas y contaminantes del medio ambiente; las GSTs son enzimas altamente conservadas implicadas en la resistencia a los plaguicidas, tolerancia hacia los xenobióticos, y la respuesta al estrés oxidativo en plantas, insectos y hongos (Burns et al., 2005). Estas enzimas catalizan la conjugación de glutatión a sustratos electrofílicos, lo que da origen a compuestos menos reactivos y más solubles y, por consiguiente, facilita su eliminación de la célula (Salinas y Wong, 1999). En ratas, los ITCs inducen y modulan la actividad de las enzimas de la fase I y fase II. Existe amplia evidencia derivada de estudios en modelos animales de que determinados ITCs y sus conjugados pueden inhibir las enzimas del citocromo P450, responsables de la inducción de tumores. De esta manera, se piensa que la inducción de las GSTs funciona como medio de protección (Mithen et al., 2000). Se ha encontrado evidencia de la inducción coordinada de citocromo P450 y GSTs en los hongos, por medio del tratamiento de Streptopmyces griseus con genisteína (Dhar et al., 2003). Por otra parte, la presencia de conjugados de glutatión podría dar lugar a la inducción de los transportadores ABC, los cuales pueden catalizar la eliminación de dichos conjugados de la célula. Estos transportadores tienen una función esencial en la secreción de toxinas específicas y no específicas de los hospederos, como una forma de protección contra los compuestos de defensa de la planta, así como en la resistencia a fungicidas. Existen un gran número de genes en levaduras que regulan la resistencia a xenobióticos tóxicos; sus productos son proteínas membranales de transporte pertenecientes a la super familia ABC (Del Sorbo et al., 2000). En la membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae existen por lo menos cinco transportadores ABC: Pdr5p, Snq2p, Pdr12p, Yor1p y Ycf1p (Bissinger y Kuchler, 1994).

La sobreexpresión de PDR5 causa resistencia a cientos de fármacos que no están químicamente relacionados (Kolaczkowski et al., 1996), incluyendo muchas clases de antimicóticos clínicos y fungicidas agrícolas, tales como anilopirimidina, bencimidazoles, ditiocarbamatos, azoles y análogos de estrobilurinas.

Por el contrario, la inactivación de PDR5 causa hipersensibilidad a los fármacos y compuestos tóxicos naturales. Además de la ABC, la superfamilia principal de transportadores facilitadores (MFS) también previenen la acumulación de compuestos tóxicos (Pao et al., 1998). Anteriormente, se consideraba que los transportadores MFS se ocupaban solamente de la secreción de toxinas endógenas (Hayashi et al., 2002). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los transportadores MFS de Candida albicans y S. cerevisiae también están involucrados en la protección contra compuestos exógenos, tales como los inhibidores de la desmetilación de esteroles (Calabrese et al., 2000). Recientemente, estudios en Botrytis cinerea revelaron la existencia de un transportador MFS, denominado Bcmfs1, el cual desempeña un papel en la tolerancia tanto hacia compuestos tóxicos naturales como hacia fungicidas sintéticos.

Además, este transportador MFS tiene una especificidad de sustrato que se superpone con el transportador ABC BcatrD de B. cinerea. Asimismo, se propuso que los transportadores MFS desempeñan una función no solo en la secreción, sino también como transportadores de afluencia, debido al aumento de la sensibilidad mostrada por la sobreexpresión de mutantes de Bcmfs1 a la presencia de cicloheximida (Hayashi et al., 2002). Del Sorbo et al. (2000), propusieron que transportadores similares están presentes prácticamente en todas las especies de hongos fitopatógenos y afirmaron que la regulación de los genes que codifican para transportadores ABC y MFS en los hongos filamentosos, probablemente sean un importante tema de investigación en el futuro. Esto se debe a la posibilidad de desarrollo de tratamientos, basados en la utilización simultánea de inhibidores de la transcripción de dichos genes y fungicidas en las cepas que muestran resistencia múltiple. De hecho, existen varios bloqueadores de las bombas ABC de fármacos en mamíferos y levaduras, tales como FK506, propafenonas y el fármaco antifúngico terbinafina, capaz de revertir la resistencia a azoles mediada por transportadores en levaduras y en los aislados clínicos de Candida albicans (Schuetzer-Muehlbauer et al., 2003). Recientemente, se encontró un potente inhibidor del transportador ABC Pdr5p de S. cerevisiae, el isonitrilo, un metabolito de un hongo del género Trichoderma (Yamamoto et al., 2005), que incluye algunas especies importantes en el control biológico. Este compuesto causó la inhibición de la secreción de cicloheximida y cerulenina, mediada por Pdr5p, en células que sobreexpresaron Pdr5p, sin influir en la expresión del gen PDR5 o en la cantidad de proteína Pdr5. Sin embargo, la adición de isonitrilo llevó a la acumulación intracelular de rodamina 6G, un sustrato para Pdr5p.

La detoxificación de ITC por Alternaria brassicicola. Se llevó a cabo un experimento de hibridación sustractiva de supresión (HSS) con el objetivo de identificar los genes candidatos implicados en la patogenicidad de A. brassicicola en Arabidopsis thaliana (una planta productora de ITCs de la familia Brassicaceae), utilizando ARN mensajero de conidias en germinación, tanto en la superficie de hojas de Arabidopsis como en el agua (Cramer y Lawrence, 2004). Se encontraron cDNAs expresados diferencialmente que codifican para cianuro hidratasa, ATPasa de arsénico, formato deshidrogenasa y un homólogo del principal precursor del alergeno Alt a1 de A. alternata, que fue denominado Alt b1. El hecho de que Alt b1 se expresará preferentemente en las esporas que germinaron en la superficie de la hoja de Arabidopsis, y no en las que germinaron en el agua, indica que la expresión Alt b1 en A. brassicicola está controlada por factores ambientales específicos, y que puede desempeñar un papel en la patogénesis necrotrófica fúngica de plantas (Cramer y Lawrence, 2004). Con el objetivo de investigar el mecanismo involucrado en la detoxificación de los ITCs por conidios de A. brassicicola, se expusieron conidias germinados de este hongo a 2-propenil isotiocianato (2p-ITC) y bencil isotiocianato (BITC), realizando un protocolo de expresión diferencial. El resultado fue el aislamiento del gen AbGst1, que codifica para una GST denominada AbGst1p (Sellam et al., 2006). La expresión de AbGst1p en E. coli reveló una alta actividad de glutatión transferasa con 2p-ITC y BITC como sustratos. Además, se encontró la regulación positiva de AbGst1 durante el inicio de la germinación de conidios, la penetración de tejidos de la hoja de A. thaliana y la mayor cantidad de ADN del hongo, lo que indica que la germinación de conidios de A. brassicicola era parte del mecanismo para llevar a cabo la infección de la planta. Al parecer, el mecanismo de detoxificación del ITC, en el que participa la GST, es altamente conservado en los hongos. Otro experimento con HSS se llevó a cabo para generar una biblioteca de cDNA de conidias germinadas de A. brassicicola tratadas con 2p-ITC (Sellam et al., 2007). La respuesta del hongo fue similar a la respuesta por estrés oxidativo, de tal manera que el 35% de los genes transcripcionalmente inducidos por 2p-ITC están involucrados en la respuesta al estrés oxidativo: GST, glutatión peroxidasa, glutamilcisteína sintetasas, tioredoxinas, tioredoxin reductasas, oxidorreductasas y citocromo P450. La respuesta incluye también mecanismos que desempeñan un papel en la reducción de la acumulación intracelular del compuesto: 16% de los cDNAs inducidos por tratamientos con ITC, codifican para transportadores de proteínas, sobre todo del tipo PDR, ABC y MFS. Estos resultados sugieren que se produce un desequilibrio redox tras la exposición a 2p-ITC como resultado del agotamiento del GSH antioxidante, debido a la reacción con los ITCs. Esto conduce a la activación del mecanismo conservado de detoxificación de ITC mediado por las enzimas de la fase I y fase II. En un estudio más reciente, se expuso a A. alternata al 2p-ITC, con el objetivo de aislar los genes inducidos mediante protocolo de hibridación sustractiva (Báez-Flores et al., 2011). En este estudio se encontró la probable participación de calcio en la respuesta fúgica. Por otra parte, se encontró la activación de un transportador ABC, que confirma lo reportado en trabajos previos, en los que se encontró la expresión de un transportador ABC en A. brassicicola tratada con 2p-ITC (Sellam et al., 2007).

CONCLUSIONES

En base a la evidencia revisada, los ITCs inducen el estrés oxidativo, lo que explica la inducción de proteínas tales como la glutatión peroxidasa, glutamilcisteína sintetasa, tiorredoxinas, tiorredoxina reductasas, oxidorreductasas y del citocromo P450. Además, el mecanismo de defensa de Alternaria contra los efectos tóxicos de los ITCs incluye la inducción de las proteínas para eliminar el ITCs de la célula; por ejemplo,ITC's y transportadores ABC. El conocimiento científico analizado en esta revisión sugiere que la combinación de los ITCs con inhibidores de las proteínas que desempeña una función relevante en la detoxificación de los hongos, tales como el transportador ABC, podría ser un tratamiento más eficaz para el control de hongos. Es probable que este protocolo reduzca las pérdidas en frutas y hortalizas debido a las infecciones por hongos durante el período postcosecha, sin efectos negativos sobre la salud humana y el medio ambiente.

LITERATURA CITADA

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