Extractos de Semilla de Swietenia humilis Zucc. con Actividad Antifúngica en Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill.

Extracts of Swietenia humilis Zucc. Seed with Antifungal Activity in Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill.

Miguel Ángel Angulo–Escalante¹, Evangelina Armenta–Reyes¹, Raymundo Saúl García–Estrada¹, José Armando Carrillo–Fasio¹, Edith Salazar–Villa¹, y José Benigno Valdéz–Torres²

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Apdo. Postal 32A, Unidad Culiacán, km 5.5 Carr. Culiacán–El dorado, Culiacán, Sinaloa, México CP 80129. Correspondencia: mangulo@ciad.edu.mx.

² Instituto Tecnológico de Monterrey, Campus Culiacán, Blvd. Pedro Infante 3773, Culiacán, Sinaloa, México CP 80100.

Recibido: Marzo 22, 2009
Aceptado: Junio 22, 2009

Resumen

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antifúngico de extractos de semillas de Swietenia humilis, planta de la familia meliaceae rica en metabolitos secundarios con actividad fungicida, para el control in vitro de Rhizopus stolonifer. De las semillas, se obtuvieron extractos diclorometánico, hidroalcohólico y metanólico, los cuales se incorporaron de forma separada al medio de cultivo papadextrosa–agar (PDA) en concentraciones de 1, 2.5, 5 y 7.5%. Se determinó su efecto en la inhibición del crecimiento micelial, esporulación y alteraciones en las estructuras germinativas del hongo Rhizopus stolonifer, causante de la pudrición blanda en hortalizas. La inhibición del crecimiento micelial inducida por el extracto metanólico fue directamente proporcional a la concentración, el cual a 7.5% inhibió el crecimiento micelial en un 70.3%. Los extractos hidroalcóholico y diclorometánico no afectaron de manera significativa este parámetro. La aplicación de extracto metanólico a concentraciones mayores del 5%, no permitió la formación de esporas, mientras que los extractos diclorometánico e hidroalcólico inhibieron un 85.8 y 97.7% respectivamente, al usarse una concentración de 7.5%. El extracto metanólico disminuyó el tamaño y cambió el color de los esporangios del hongo. El diámetro promedio de los esporangios en el testigo fue de 275 μM y 110 μM para el extracto metanólico al 2.5%. Además, el extracto metanólico al 5% indujo la formación de zigosporas, como un mecanismo de sobrevivencia a condiciones adversas que le impiden al hongo reproducirse en forma asexual. El efecto del extracto metanólico en la inhibición del crecimiento micelial, esporulación y alteraciones de las estructuras germinativas observado en este estudio, puede atribuirse a la presencia de compuestos relacionados estructuralmente a terpenoides. Su presencia se demostró con reacciones de caracterización y su cromatograma correspondiente en capa fina. Por lo que Swietenia humilis podría ser una fuente de metabolitos para el desarrollo de fungicidas.

Palabras clave: Esporulación, crecimiento micelial, extracto metanólico.

Abstract

The present study is aimed to evaluate the antifungal effect of extracts obtained from seeds of Swietenia humilis, a tree of the meliaceae family rich in secondary metabolites with in vitro antifungal activity for the control of Rhizopus stolonifer. Extracts were obtained from the seeds using dichloromethane, methanol and hydro–alcoholic, and incorporated individually on a medium of potato–dextrose–agar (PDA) at 1, 2.5, 5 and 7.5% concentrations. The effect was determined on the mycelia growth inhibition, sporulation, and alteration of the Rhizopus stolonifer vegetative and germinative structures. R. stolonifer is a causal agent of vegetables soft rot. The mycelia growth inhibition induced by the methanol extract, was directly proportional to the concentration at 7.5%, and inhibited the mycelia growth about 70.3%. The hydro–alcoholic and dichloromethane extracts did not significantly affect this parameter. Applications over 5% of methanol extract did not allow fungi spore formation, whereas the hydro–alcoholic and dichloromethane about extracts inhibited 85.8 and 97.7% respectively at a concentration of 7.5%. The methanol extract decreased size and changed color of the fungi sporangium. The sporangium diameter in the control was 275 μM and 110 μM exposed with the methanol extract at 2.5%. Furthermore, zygospores formation was induced by this extract at 5%, as a result of a reproduction mechanism in adverse conditions that do not allow an asexual reproduction. The effect of the methanol extract in mycelia growth inhibition, sporulation, and alteration of the germination structures observed in this study can be attributed to the presence of compounds related with terpenoids. Their presence was demonstrated with characterization reactions and thin layer chromatography. Therefore, Swietenia humilis can be a source of secondary metabolites for new fungicides development.

INTRODUCCIÓN

La pudrición blanda ocasionada por Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill es una enfermedad poscosecha altamente destructiva, que ataca una gran variedad de frutas y hortalizas a nivel mundial (Qing y Shiping, 2000). Las esporas del hongo presentes en el medio ambiente se depositan en las heridas de los frutos maduros y producen infecciones que generan pérdidas de los productos entre el 25 al 50%, aún con tratamientos antifúngicos (Hahn, 2004). Los fungicidas sintéticos son el método mas utilizado para el control de hongos poscosecha (Müller, 2002); sin embargo, provocan el desarrollo de mecanismos de resistencia, a la vez que generan residuos tóxicos en alimentos y medio ambiente poniendo en riesgo la salud del hombre. Esto ha inducido a la búsqueda de nuevos fungicidas que seguramente se encuentran en los vegetales (biofungicidas) y especialmente los que pertenecen a la familia Meliaceae. Estas plantas contienen tetranortriterpenoides, conocidos como limonoides con diversas actividades biológicas, incluyendo la antifungica (Roy y Saraf, 2006). Investigaciones realizadas en las últimas dos décadas han permitido identificar plantas de esta familia con actividad antifúngica. Entre ellas destacan Azadirachta indica A. Juss, que contiene limonoides antifúngicos (Govindachari et al., 1998) y Khaya ivorensis A. Chevallier, de la que se han aislado 10 limonoides con acción fungicida a Botrytis cinerea Pears (Abdelgaleil et al., 2005). En México se encuentra el árbol Swietenia humilis Zucc (Pennington, 1981), comúnmente conocido en el estado de Sinaloa como "venadillo" y en otras regiones del país como "zopilote" y "caobilla" o "cubano" (Martínez, 1979). Se le localiza en los bosques secos y húmedos tropicales de las costas del Pacífico de los estados de Sinaloa, Colima, Michoacán, Guerrero y Chiapas, México; hasta la provincia de Gunacaste, en Costa Rica (Standley, 1920–1926). Este árbol es una fuente de madera para la construcción de muebles y en ciertas regiones de México es utilizado como árbol medicinal para eliminar parásitos intestinales (Niembro–Rocas, 1990). Estudios fitoquímicos muestran que las semillas de venadillo contienen, al menos 11 humilinoides (Jiménez et al., 1998) y por su semejanza en sus estructuras químicas se incluyen en el grupo de los mexicanolides. Los extractos metanólicos de semillas secas de Swietenia humilis mostraron actividad insecticida en el gorgojo harinero (Tenebrio monitor Linnaeus.) en estado de larva (Segura–Correa et al., 1993). Los humilinoides B y C aislados del extracto metanólico poseen actividad anticancerígena in vitro (Jiménez et al., 1997) y los humilinoides C y E actividad insecticida contra el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis Hübner) (Jiménez et al., 1997; Jiménez et al., 1998). Sin embargo, no se han realizado estudios que demuestren la actividad antifungica tanto de los extractos metanólicos como de los mexicanolides aislados. La presente investigación se realizó con el objetivo de determinar el efecto antifúngico de los extractos obtenidos de semillas de Swietenia humilis en Rhizopus stolonifer.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación del germen de semillas de venadillo. Durante el mes de abril de 2004, se colectaron los frutos en estado maduro de árboles localizados en la ciudad de Culiacán, Sinaloa, México y se trasladaron al Laboratorio de Toxicología del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Culiacán. Las semillas fueron liberadas de la cápsula y secadas bajo sombra durante 15 días (Dai et al., 1999). Las semillas sin testa se almacenaron en bolsas de polietileno a 4°C.

Molienda y obtención de extractos. Se molió 1 kg de germen de semilla de venadillo en una licuadora comercial y se pasaron por un tamiz No. 40 (diámetro de partícula 425 μM). La muestra se dividió en dos secciones para realizar los procesos de extracción.

Extracto hidroalcohólico (HA). Se pesaron 150 g de germen de semillas molidas y se colocaron en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Se adicionaron 1.5 L de etanol/agua (7:3, v:v) y se mantuvieron en reposo, en ausencia de luz y a temperatura ambiente por una semana. El macerado se filtró con tela de organza y papel filtro Whatman No. 5 y el filtrado se evaporó en un rotavapor (Buchi R–205, Suiza) a presión reducida y temperatura controlada, no mayor a 50°C (Cáceres et al., 1991). Finalmente, el extracto se colocó en viales ámbar de 50 mL y almacenado a 4°C.

Extractos diclorometánico y metanólico (DCM y MeOH). Se pesaron 110 g de germen de semilla molida y se mezclaron con 5 L de diclorometano. El macerado se dejó en reposo durante una semana a temperatura ambiente y en la oscuridad. La obtención del extracto y almacenamiento se realizaron bajo las mismas condiciones que con el extracto hidroalcohólico. De la extracción antes descrita, se recuperó el germen, se mezcló con 3 L de metanol y se maceró durante una semana a temperatura ambiente y en la oscuridad. El macerado se filtró y evaporó a las condiciones mencionadas. Los solventes utilizados en esta investigación fueron marca JT–Baker (en el caso de metanol y etanol) y Fisher (diclorometano), grado HPLC.

Inhibición del crecimiento micelial. El medio de cultivo PDA se esterilizó durante 15 min a 15 lb/plg² y se enfrió a 45°C (Misra y Sahu, 1977). Se agregaron los extractos crudos de venadillo: metanólico, diclorometánico e hidroalcohólico a concentraciones de 1, 2.5, 5 y 7.5%. Posteriormente, se vació en cajas Petri, bajo condiciones asépticas. Se utilizaron cinco cajas por tratamiento, incluyendo al testigo que consistió en PDA sin extracto. En la parte central de las cajas Petri se colocó un disco de agar de 0.7 cm de diámetro más Rhizopus stolonifer en crecimiento activo (Jasso de Rodríguez et al., 2005; Reddy et al., 1998), incubándose por 24 h a 28°C. El diámetro de crecimiento del micelio se midió cada tres horas, hasta que el testigo llenó por completo la caja. El resultado se expresó en porcentaje de inhibición del crecimiento micelial y se obtuvo a través de la aplicación de la ecuación descrita por Vallejo–Cohen et al. (1999).

Inhibición de la esporulación. El conteo de esporas se realizó a partir de las cajas Petri utilizadas en el experimento de la actividad biológica de los extractos. Se les agregaron 10 mL de agua destilada esterilizada, se raspó la superficie con un portaobjetos y se filtró la suspensión con una malla de organza. La concentración de esporas por mililitro se determinó con una cámara de Neubauer y con el apoyo de un microscopio compuesto (Carl Zeizz) a 40 X de aumento (Bautista–Baños et al., 2003). El porcentaje de inhibición de la esporulación se determinó de acuerdo a la siguiente ecuación:

Identificación y evaluación de esporangios alterados. Se seleccionaron muestras de estructuras vegetativas y germinativas, del hongo en estudio, de los tratamientos del ensayo de inhibición del crecimiento micelial con 72 h de incubación y se fijaron con lactofenol en porta objetos. Se observaron y analizaron en un microscopio óptico marca Carl Zeizz (100X) equipado con una cámara digital (Moticam 480) y con el uso del software Motic Images 2000 versión 1.3, se les determinó el diámetro.

Identificación de los grupos de componentes activos. Se utilizó la metodología descrita por Mareggiani et al. (1998), que consistió en el uso de cromatoplacas de vidrio recubiertas con gel de sílice 60 F₂₅₄ Camag de 20 x 20 cm. Alícuotas de 10 μL del extracto metanólico se vertieron con un capilar de vidrio a tres cm del borde inferior de la cromatoplaca; así mismo, se dejaron tres cm de separación entre cada muestra. Las muestras se eluyeron con cloroformo:acetato de etilo (95:5), cloroformo:metanol (90:10), cloroformo:metanol (80:20). La movilidad de los componentes se observó bajo una lámpara de luz ultravioleta (Camag) a longitudes de onda de 254 y 366 nm, respectivamente. Para la detección de estructuras esteroidales y de glicósidos esteroidales y triterpénicos, se utilizó el método de Liebermann–Burchard (Stadtman, 1967); así como, el método de Mayer y Dragendorf, para la detección de alcaloides (Trease y Evans, 1987). Se utilizó el reactivo citrobórico para determinar la presencia de flavonoides.

Diseño estadístico. La evaluación para inhibición del crecimiento micelial y la inhibición de la esporulación se analizó mediante un diseño de 2 factores totalmente al azar: extracto, concentración. El factor extracto tuvo tres niveles: diclorometano, metanol y etanol; la concentración, cuatro niveles, 1, 2.5, 5 y 7.5%. En la evaluación de germinación de esporas se tuvieron los factores anteriores, pero el factor concentración tuvo tres niveles, 0, 5 y 7.5%. Los datos de cada experimento se analizaron mediante el paquete estadístico Minitab versión 14.0. Se llevaron a cabo análisis de varianza y de comparación múltiple de medias, estas últimas mediante pruebas de Tukey, para determinar diferencias entre tratamientos (p < 0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inhibición de la esporulación. A las 24 horas de exposición, se presentaron valores promedio altos en la inhibición de estructuras de reproducción de Rhizopus stolonifer en todos los extractos y en las cuatro concentraciones evaluadas. El extracto metanólico mostró una inhibición proporcional a su concentración y la inhibición total de la esporulación se observó a partir de la concentración del 5 y 7.5% (Cuadro 3). Los extractos hidroalcohólico y diclorometánico mostraron variaciones en su comportamiento y no lograron inhibir completamente la formación de esporas, a pesar de presentar valores por arriba del 88% (Cuadro 3). El extracto metanólico de las semillas de Swietenia humilis contiene diversos limonoides conocidos como humilinoides (Segura–Correa et al., 1993), a los que se les puede atribuir el efecto fungicida (esporocida). Esto debido a que limonoides con estructura similar obtenidos de las semillas de Swietenia mahogani (L.) Jacq. mostraron actividad antifungica en la roya del cacahuate causada por el hongo Puccinia arachidis Speg. (Govindachari et al., 1998).

Efecto sobre estructuras vegetativas y germinativas. La exposición de Rhizopus stolonifer a las distintas concentraciones de los extractos en estudio ocasionó alteraciones en sus estructuras vegetativas y germinativas en las cuales el efecto de los tres tipos de extractos presentaron diferente grado de efecto; dichas alteraciones se observaron con mayor intensidad cuando el hongo fue expuesto al extracto metanólico. Las alteraciones que se observaron en el hongo Rhizopus stolonifer fueron la disminución en el tamaño y color de los esporangios. Los valores de las muestras tratadas apreciados mediante el microscopio (Fig. 1), no coinciden con los reportados por Schipper (1984) y Ribes et al. (2000), quienes basan las diferencias entre especies del género Rhizopus en sus dimensiones y características estructurales. Ellos indican que para Rhizopus stolonifer, el diámetro normal de los esporangios varía entre 250 y 300 μm. Este dato coincide con los 275 μm de diámetro encontrados en promedio para el tratamiento testigo, mientras que los esporangios desarrollados en el extracto metanólico a 2.5% disminuyeron en 1.5 veces sus dimensiones, ya que el diámetro fue de 110 μm. Al exponerse el hongo con extracto metanólico al 5% (Fig. 2) indujo la formación de esporas sexuales conocidas como zigosporas. Agrios (2001) indica que las zigosporas sólo se presentan en Rhizopus stolonifer cuando se enfrenta a condiciones adversas que le impiden seguirse reproduciendo de manera asexual. Desde el punto de vista de multiplicación del hongo, la formación de zigosporas es preferible a la formación de esporangios y sus correspondientes aplanosporas (esporas asexuales), ya que en cada esporangio se desarrollan 30,000 aplanosporas, mientras que los zigosporangios sólo desarrollan una zigospora (Le Bars–Bailly et al., 1999). Al aumentar la concentración del extracto metanólico, las alteraciones estructurales fueron más drásticas (Fig. 3). En la concentración al 7.5%, el hongo no logró desarrollar zigosporangios ni esporangios en forma adecuada (Fig. 3C). Además, se observó ramificación del esporangióforo (Fig. 3A), que no corresponde con la estructura típica de Rhizopus, ya que según Schipper (1984) y Ribes et al. (2000), este género desarrolla de uno a tres esporangióforos sin ramificación a partir del rizoide. Finalmente, también se observaron alteraciones como desorganización de la pared celular en los esporangióforos, puntas sin cerrar con vaciado de líquido citoplasmático (concentración del 7.5%) (Fig. 3D) y falta de pigmentación en las concentraciones del 2.5 al 7.5% (Fig. 3B).

Identificación de grupos de componentes químicos. La identificación de componentes activos se realizó en el extracto metanólico, por ser el único que cumplió las expectativas de inhibición micelial. Los resultados de los ensayos de caracterización por reacciones específicas resultaron positivos para alcaloides y glucósidos terpenoides. En la caracterización de compuestos alcaloides se formaron precipitados de cristales con coloraciones de anaranjado intenso, amarillo pálido y marrón, confirmando la formación de sales de alcaloides en las tres reacciones. El alcaloide nicotina, como testigo, reafirmó los resultados. Para el caso de glucósidos terpenoides, la caracterización mostró el precipitado color crema pálido esperado, que muestra la deshidratación de grupos hidróxilo en posición tres de los terpenoides (Lenz del Río, 1981). La identificación por cromatografía en capa fina mostró un grupo de alcaloides con Rf de 0.36. Este valor es muy cercano al de 0.37 reportado por Payo et al. (2001), que corresponde a un alcaloide cuya estructura es similar a la de n–metil flindersina, un alcaloide presente en la familia Meliaceae. Además, según Lenz del Río (1981), de acuerdo a los solventes empleados, este grupo de alcaloides podrían corresponder a los de tipos oxigenados, que son solubles en alcoholes y cloroformo, entre otros solventes. Respecto al grupo de terpenoides, estos se encontraron a un valor de Rf de 0.87. No se encontraron reportes de valores Rf para terpenoides similares a los presentes en la especie S. humilis. Sin embargo, se esperaba la presencia de ellos debido que ya están ampliamente reportados en la literatura por Okorie y Taylor (1970); Segura–Correa et al. (1993) y Jiménez et al. (1997 y 1998). Estos compuestos se reportan tanto en extractos metanólicos como en triclorometánicos y poseen actividad insecticida contra Ostrinia nubilalis (Jiménez et al., 1998).

CONCLUSIONES

El extracto metanólico de la semilla de Swietenia humilis presentó la mayor actividad antifúngica en comparación con el extracto diclorometánico e hidroalcóholico. Esto se debió a que inhibió el crecimiento micelial, la esporulación y alteró la formación de las estructuras reproductivas de Rhizopus stolonifer, determinante para la inhibición de la esporulación. De acuerdo a la revisión de literatura y a la demostración de la presencia de terpenoides, estos podrían ser los responsables de la actividad antifúngica. Por lo tanto, las semillas de Swietenia humilis contienen metabolitos con actividad antifungica contra Rhizopus stolonifer.

Al personal de los laboratorios de Toxicología y Fitopatología del CIAD–Unidad Culiacán: Yadira López–Pantoja e Isidro Márquez–Zequera por su apoyo en los procesos de extracción y pruebas biológicas; al CECyT y CONACyT por su apoyo económico.

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