Análisis estructural del gen mitocondrial citocromo b y de la región control de Cynomys mexicanus y Spermophilus spilosoma (Rodentia: Sciuridae)

Luis Manuel Guevara-Chumacero¹, Ricardo López-Wilchis¹, Francisco F. Pedroche² e Irene de los Angeles Barriga-Sosa²

¹ Departamento de Biología, Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina. Del. Iztapalapa C. P. 09340, México D. F.

² Departamento de Hidrobiología, Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina. Del. Iztapalapa C. P. 09340, México D. F. E-mail: lmgc1@yahoo.com.

The nucleotide sequences of the cytochrome b gene and of the control region are described for Cynomys mexicanus and Spermophilus spilosoma. The cytochrome b gene was characterized by the presence of eight non-synonymous substitutions at the inter-generic level, presented mainly in the transmembrane zone (87%). The control region was characterized by the presence of the conserved blocks, ETAS1 and CSB1; by the absence of repetitive sequences and by the conserved blocks, ETAS2, CSB2 and CSB3. Most of the inter-generic variation (47.9%) was observed in the ETAS domain. The structure of the control region was similar to that of phylogenetic related species.

El gen mitocondrial, citocromo b, ha sido extensamente estudiado dentro de los mamíferos por ser un componente obligatorio de la cadena respiratoria (Mitchell 1976. J. Theor. Biol. 62: 327-367). Asimismo, la región control del ADN mitocondrial, se considera importante por contener el origen de la replicación (Larizza et al. 2002. J. Mol. Evol. 54: 145-155). Estas dos regiones han sido caracterizadas en diversas especies de roedores (Saccone et al. 1987. J. Mol. Evol. 26: 205-211; Gemmell et al. 1996. Mol. Biol. Evol. 13(6): 798808; Larizza et al. 2002. op. cit.; Reyes et al. 2003. Mol. Biol. Evol. 20(4): 622-632), sin embargo se ha generado poco conocimiento al respecto dentro de la familia Sciuridae (Oshida et al. 2001. Zool. Sci. Tokio. 18(1): 107-114; Larizza et al. 2002. op. cit.). Por esta razón en el presente estudio se llevó a cabo la caracterización del gen citocromo b y de la región control de Cynomys mexicanus Merriam (1892) y Spermophilus spilosoma Bennett (1833).

Se tomaron muestras de tejido de oreja de C. mexicanus y S. spilosoma provenientes de San Luis Potosí [El Manantial (24°07'30''N, 100°55'30''0) y el Gallo (24°12'00''N, 100°54'06''0)] y Coahuila [San Juan del Retiro (24°51'13"N, 101°05'00''0)]. La extracción de ADN total se efectuó usando el Dneasy Tissue kit de QIAGEN. Para la amplificación por PCR se siguió el protocolo del kit Taq PCR de QIAGEN, para C. mexicanus se usaron los pares de cebadores MVZ05/MVZ14 y para S. spilosoma MVZ05/MVZ16 (Smith & Patton 1993. Biol. J. Linnean Soc. 50: 149-177) y para la región control, se usaron los cebadores L15933/H637 (Oshida et al. 2001. op. cit.). Las condiciones empleadas fueron las siguientes: un ciclo a 94° 90s, 45° 60s, 72° 90s; 30 ciclos a 94° 45s, 45° 30s, 72° 45s; y un ciclo final a 94° 45s, 45° 30s, 72° 10min. Para S. spilosoma la temperatura de anillamiento fue de 40°C. La purificación se realizó mediante el kit QIAquick Spin de QIAGEN. Cada muestra se secuenció por duplicado en la Universidad de California, Berkeley y en Auburn University Genomics & Sequencing Lab, usando los analizadores genéticos ABI 377 y ABI 3100, respectivamente. Las secuencias nucleotídicas se alinearon con el programa Sequence Navigator™ 1.0.1, y el multialineamiento se llevó a cabo mediante el programa Esee V. 3.1 (Cabot 1997. The Eyeball Sequence Editor). La descripción de la estructura del gen citocromo b se basó en Whitmore et al. (1994. J. Fish Biol. 44: 637-645), empleando el código genético de mamíferos para analizar las secuencias de aminoácidos. La descripción de la región control se efectuó de acuerdo a Larizza et al. 2002. op. cit. El análisis de inferencia filogenética se efectuó con el programa PAUP V. 4 (Swofford 2002. PAUP Sinauer Assoc. Massachusetts), empleando el método de Parsimonia y un bootstrap de 100 réplicas.

En ambas especies la secuencia compilada para el gen citocromo b fue de 713 nt (237 aminoácidos) (No. en GenBank DQ106851-DQ106854), ~62.5% en relación con Sciurus vulgaris (No. en GenBank NC_002369). La secuencia compilada promedio de la región control para C. mexicanus y S. spilosoma fue de 996 nt (No. en GenBank DQ106855-DQ106858), ~90% de la región completa registrada para S. vulgaris (No. en GenBank NC_002369). El gen citocromo b se caracterizó por las substituciones sinónimas (58), aunque también se observaron substituciones no sinónimas, de las cuales ocho cambios de aminoácidos se presentaron a nivel inter-genérico (C. mexicanus-S. spilosoma): cinco Val-Ileu, uno Ileu-Val, uno Val-Ala y uno Ileu-Thr, y la mayoría de ellos (7) corresponden a aminoácidos hidrofóbicos de la zona transmembranal, como se ha observado en diversos vertebrados (Irwin et al. 1991. J. Mol. Evol. 32: 128-144; Kornegay et al. 1993. J. Mol. Evol. 37: 367-379). Similar a lo reportado para otros roedores (Brown et al. 1986. J. Mol. Biol. 192: 503-511; Matson & Baker 2001. Mol Bíol. Evol. 18(8): 1494-1501; Reyes et al. 2003. op cit.) la región control de las especies de estudio se caracterizó por presentar los dominios ETAS, central y CSB, además de los bloques conservados ETAS1 y CSB1. No se presentaron secuencias de repetición cortas o largas, ni los bloques conservados ETAS2, CSB2 y CSB3 característicos de especies como Rattus rattus, Mus musculus y Cavia porcellus (Larizza et al. 2002. op. cit.). Se detectaron 117 substituciones entre C. mexicanus y S. spilosoma, de las cuales el 47.9% fueron en el dominio ETAS, considerado como el dominio más variable de la región control de mamíferos (Sbisà et al. 1997. Gene. 205: 125-140). El 44.4% de la variación inter-genérica se presentó en el dominio CSB que, para mamíferos, es menos variable que el dominio ETAS, y es donde ocurre el procesamiento de los cebadores de ARN para la replicación de la cadena pesada (Sbisà et al. 1997. op. cit.). Por su parte el dominio central presentó solamente el 7.7% de los cambios a nivel inter-genérico, coincidiendo con su carácter altamente conservado, asociado a la interacción con elementos del citoesqueleto (Jackson et al. 1996. Nucieic Acids Res. 24: 1212-1219, Reyes et al. 2003. op. cit).

Especies filogenéticamente cercanas (S. vulgaris, C. mexicanus, S. spilosoma) comparten un esquema general de la región control, conformado por los tres dominios característicos de roedores, además de los bloques conservados ETAS1 y CSB1 (Fig. 1). R. rattus y M. musculus, especies presentes en otro clado, tienen la característica de presentar dos bloques conservados del dominio ETAS (ETAS1 y 2) y tres bloques conservados en el dominio CSB (CSB1, 2 y 3). Ésta última especie presenta repeticiones de secuencias cortas. Finalmente, C. porcellus presenta bloques conservados en CSB y repeticiones de secuencias cortas dentro del mismo, y repeticiones de secuencias largas en ETAS (Larizza et al. 2002. op. cit.).

En conclusión, el análisis de las regiones del ADNmt abordadas en este trabajo para C. mexicanus y S. spilosoma mostró que guardan una estructura similar a la de otros mamíferos. Para el gen citocromo b presentaron la mayor variación inter-genérica de aminoácidos en la zona transmembranal (Irwin et al. 1991. op. cit.), mientras que para la región control mostraron una estructura similar a la de S. vulgaris, y la mayor variación inter-genérica en el dominio ETAS (Larizza et al. 2002. op. cit.).

AGRADECIMIENTOS