Neofusicoccum eucalyptorum (=Botryosphaeria eucalyptorum) and N. parvum: Pathogens in eucalyptus plantations in Mexico
Jesús G. De la Mora-Castañeda; David Cibrián-Tovar; Omar A. Pérez-Vera*
* División de Ciencias Forestales (Departamento de Ecología y Silvicultura), Universidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Chapingo, Texcoco, Edo. de México. México. Correo-e: oalejandrovera@gmail.com Tel.: 01(595) 9521500 ext. 5542 (* Autor para correspondencia).
Recibido: 12 de marzo, 2014 ]]> Aceptado: 18 de septiembre, 2014
RESUMEN
En el oriente de Michoacán, la muerte regresiva en plantaciones comerciales de eucalipto se presentó en árboles con daños por heladas y sequías en el 2013. En Eucalyptus nitens se aisló al patógeno Neofusicoccum eucalyptorum encontrando a su teleomorfo Botryosphaeria eucalyptorum en los cancros, mientras que N. parvum se aisló de E. nitens y E. globulus. Ambas especies de Neofusicoccum se identificaron por morfología y se caracterizaron molecularmente mediante PCRITS. Las secuencias de N. eucalyptorum (números de acceso: KC479184 y KC4799188) y N. parvum (KC479185, KC479186 y KC479187) se depositaron en el Banco de Genes del NCBI. En campo, los eucaliptos enfermos presentaron muerte regresiva, cancros fusiformes en fuste que inducen hinchamientos, flujo de resina y brotes epicórmicos. Los hongos inoculados in vitro en varetas de E. nitens y E. globulus causaron lesiones necróticas y abundantes picnidios inmaduros a 10 días después de la inoculación (ddi). En los árboles de E. nitens de tres años de edad se formó un cancro de apariencia hundida con forma fusiforme, de color café oscuro y de 13 a 21.9 cm a los 48 ddi. Este trabajo es el primer reporte de N. eucalyptorum y N. parvum en México causando enfermedad en plantaciones de eucalipto.
Palabras clave: Botryosphaeriaceae, cancros, endófito, Eucalyptus sp., muerte regresiva.
ABSTRACT
In 2013, in the east of Michoacán, die-back in commercial eucalyptus plantations appeared in trees with frost and drought damage. Neofusicoccum eucalyptorum was isolated on Eucalyptus nitens, and its teleomorph Botryosphaeria eucalyptorum was found on cankers; N. parvum isolated on E. nitens and E. globulus. Both species of Neofusicoccum were identified by morphology and were molecularly characterized by PCRITS. The sequences of N. eucalyptorum (access number: KC479184 and KC4799188) and N. parvum (KC479185, KC479186 and KC479187) were deposited in the Gene Bank of the NCBI. In the field, diseased eucalyptus showed die-back, fusiform cankers on stem, which induce bulges, resin flow and the appearance of epicormic shoots. The fungi inoculated in vitro in shoots of E. nitens and E. globulus provoked necrotic lesions and abundant immature pycnidia at 10 days after inoculation (dai). E. nitens trees of three years of age showed a fusiform canker with sunken appearance and dark brown coloration, measuring 13 to 21.9 cm at 48 dai. This study is the first report of N. eucalyptorum and N. parvum in Mexico causing disease in eucalyptus plantations.
Keywords: Botryosphaeriaceae, cankers, endophyte, Eucalyptus sp., die-back.
]]> INTRODUCCIÓN
En México existen alrededor de 25,000 ha de plantaciones comerciales de eucaliptos de rápido crecimiento establecidas en Chihuahua, Estado de México, Guerrero, Michoacán, Oaxaca, Tabasco y Veracruz (Pérez-Vera, Yáñez-Morales, Alvarado-Rosales, Cibrián-Tovar, & García-Díaz, 2005; Velázquez et al., 2013). Entre las especies plantadas se encuentran Eucalyptus camaldulensis Dehnh., E. globulus Labill., E. grandis W Hill, E. nitens Deane & Maiden, E. pellita F. Muell., E. urophylla S. T. Blakede y el híbrido E. urophylla x grandis (E. urograndis). De este conjunto de especies, destacan E. nitens y E. globulus en ambientes de mayor altitud con tendencia a heladas y E. urophylla en el trópico húmedo (Comisión Nacional Forestal [CONAFOR], 2011). En los años 2010, 2011 y 2012, se establecieron plantaciones con E. nitens y E. globulus en el estado de Michoacán, donde se registró mortalidad en árboles con edades de tres a cuatro años. Los organismos involucrados en los tejidos muertos o enfermos fueron hongos pertenecientes a la familia Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales, Ascomycetes). Los hongos de esta familia tienen amplia distribución en el mundo y afectan un grupo diverso de plantas dicotiledóneas, monocotiledóneas y gimnospermas (Mohali, Slippers, & Wingfield, 2006; Pérez, Wingfield, Slippers, Altier, & Blanchette, 2009, 2010; Smith, Crous, Wingfield, Coutinho, & Wingfield, 2001). Los géneros Botryosphaeria y Neofusiccocum infectan el tallo, ramas, hojas y frutos del hospedante (Crous et al., 2006; Mohali et al. 2006). Este grupo de hongos son patógenos endófitos, oportunistas, que inducen cancros en tallo y ramas, muerte regresiva, pudrición de frutos, pudrición del cuello, damping-off en plántulas y gomosis (Mohali et al. 2006; Slippers & Wingfield, 2007). Recientemente, Crous et al. (2006) realizaron un estudio sobre linajes filogenéticos en Botryosphaeriaceae, por lo que reacomodaron varias especies en el género Neofusiccocum, el cual se caracteriza por tener conidios hialinos fusiformes a elipsoides como en Fusicoccum Corda, pero se separa por tener sinanamorfos similares a Dichomera, que tiene conidios globosos a piriformes de color café. Inicialmente, en el género Neofusicoccum se reconocieron 13 especies, pero el número ha crecido conforme se hacen estudios adicionales (Sakalidis, Hardy, & Burguess, 2011); aunque para varias de ellas, estos estudios pueden ser complejos, como en N. ribis (Slippers, Crous, & M. J. Wingf.) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips (teleomorfo Botryosphaeria ribis Grossenb. & Duggar), y N. parvum (Pennycook & Samuels) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips (teleomorfo B. parva Pennycook & Samuels) (Crouss et al., 2006). En la actualidad, debido a que los teleomorfos y los anamorfos son morfológicamente muy similares y difíciles de separar, la identificación taxonómica de las especies de Botryosphaeriaceae se hace con los datos moleculares, en particular con las secuencias de ADN en combinación con las características morfológicas (Slippers & Wingfield, 2007).
Los antecedentes de Botryosphaeriales en plantaciones de eucalipto en México son escasos. Cruz, Cibrián, Ramírez, y García (2001) y Cibrián, Rosales, y García (2007) reportan a Botryosphaeria rhodina Berk. & M. A. Curtis y su anamorfo Lasiodiplodia theobromae Griffon & Maubl., y a B. dothidea (Moug. ex Fr.) Ces & De Not (anamorfo Fusicoccum aesculi Corda) como causantes de cancros en árboles jóvenes de E. camaldulensis que estuvieron bajo una condición de estrés por inundación pluvial en la región costera de Nayarit. También Slippers et al. (2004) y Rodas, Slippers, Gryzenhout, y Wingfield (2009) encontraron que B. dothidea; N. eucalyptorum Crous, H. Smith et M. J. Wingf., N. australe Slippers, Crous, & M. J. Wingf.; N. parvum y N. eucalypticola Slippers, Crous, & M. J. Wingf. causaron cancros y muerte regresiva en especies de Eucalyptus. En el sur de Veracruz, en plantaciones de E. urophylla y E. grandis se reporta a B. rhodina causando muerte descendente; los árboles afectados tuvieron enredamiento de raíz, por lo que se presume que los hongos tuvieron un rol de patógeno oportunista (Cibrián, 2013).
En el oriente de Michoacán, después de heladas atípicas y sequías prolongadas se registró declinación severa en plantaciones de árboles de E. globulus y E. nitens de tres a siete años de edad. Los árboles afectados tuvieron la raíz enredada en diferente grado de daño desde que la planta estuvo en el vivero y muerte de puntas y ramas con necrosis de 10 a 100 cm de longitud. En la corteza y los troncos de los árboles muertos se observaron picnidios subcorticales de color negro. En algunos predios de las plantaciones se registró más de 50 % de mortalidad. Por la importancia del evento se planteó como objetivo principal de este estudio, identificar los organismos causantes de la enfermedad y probar su patogenicidad en árboles vivos de E. nitens y en varetas de E. globulus y E. nitens.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de muestreo
En la empresa Forestaciones Operativas de México S. A. de C. V. (REXCEL), Michoacán, se muestrearon seis parcelas de eucaliptos de tres a siete años de edad. En los municipios de Ciudad Hidalgo (Agustina Correa y Agustina Correa 1), Irimbo (Maravatío) y Tuxpan (Mireya Tinoco) se muestrearon plantaciones con E. nitens, y en el municipio de Maravatío (Francisco Maldonado y Raúl Armas) se muestrearon plantaciones con E. globulus. Las parcelas se seleccionaron considerando la presencia de muerte regresiva y cancros en el fuste en los eucaliptos. En cada parcela se recolectaron cinco secciones de troncos con cancros de 30 cm de longitud y se caracterizaron los síntomas visualmente. En el Cuadro 1 se muestran las características de cada parcela.
Aislamiento e identificación morfológica del patógeno
De cada una de las secciones de troncos de los árboles recolectados, se tomaron 15 trozos de tejido sintomático de 6 mm2 (450 submuestras). Las muestras se desinfectaron con hipoclorito de sodio comercial al 3 % por 3 min, se lavaron en agua destilada estéril por 3 min, se secaron y sembraron en medio de cultivo papa-dextrosa-agar al 2 % (PDA, Bioxon). Las cajas de Petri se incubaron a 25 ± 2 °C por cinco días con luz natural de laboratorio. De cada aislamiento obtenido se realizaron cultivos de punta de hifa y se preservaron en tubos inclinados con PDA cubiertos con aceite mineral. Se seleccionaron seis aislamientos (Agustina Correa = AC, Agustina Correal = AC1, Francisco Mal donado = FM, Maravatío = MA, Mireya Tinoco = MT y Raúl Armas = RA) para su identificación, con base en el crecimiento del micelio, pigmentación y estructuras reproductivas (sexual o asexual). La morfología de los picnidios y pseudotecios se observó en un microscopio compuesto Cari Zeiss (Gottingen, Germany). La identificación de género se realizó con las claves de Barnett y Hunter (1998) y Sivanesan (1984), y la especie se identificó con base en lo señalado por Smith, Crous, wingfield, coutinho, y wingfield (2001).
]]> Identificación molecular del patógeno: Extracción de ADN, amplificación y secuenciaciónEl ADN se extrajo del micelio de los aislamientos (MA, AC, AC1, MT, FM y RA) con el protocolo de Dneasy® Plant Mini kit (Qiagen Inc, Valencia, CA, USA). La amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (RNAr) se efectuó por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando los iniciadores ITS4 (5 '-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') e ITS5 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3') (White, Bruns, Lee, & Taylor, 1990). Se utilizó un termocidador Multi-gene Gradient (modelo TC9600-9, Nueva Jersey, USA) con el siguiente programa: 1 ciclo 95 °C, 1 min; 35 ciclos a 94 °C, 1 min, 60 °C, 90 s 72 °C, 2 min; 1 ciclo 72 °C, 5 min. El producto amplificado se purificó con el Kit Wizard SV (Promega, USA) y se mandó a secuenciar en ambas direcciones a la compañía Macrogen (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias se compararon con las reportadas en la base de datos del banco de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov) por medio del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Pruebas de patogenicidad
In vitro. La patogenicidad de los aislamientos de Neofusicoccum (MA, AC, AC1, MT, FM y RA) se verificó en varetas de E. nitens (Michoacán) y E. globulus (Parque Estatal Molino de las Flores, Texcoco, Edo. de México). En cada prueba de inoculación se usaron 70 varetas (10 varetas por aislamiento y 10 varetas testigo) bajo un diseño experimental completamente al azar. Previo a la inoculación, los extremos de las varetas fueron sellados con parafinas para disminuir la desecación. Las varetas se desinfestaron con hipodorito de sodio al 5 % por 5 min, se lavaron tres veces por 3 min con agua destilada estéril y se secaron. La técnica de inoculación consistió en realizar una herida de 6 mm de diámetro en cada unidad experimental, luego la corteza se removió y se depositó un disco con crecimiento micelial de 12 días de edad. En la vareta testigo se colocaron discos de PDA sin el hongo. La zona inoculada de las varetas se cubrió con algodón y gasas húmedas estériles, y se selló con papel aluminio estéril; todas las varetas se mantuvieron en bandejas multiusos de 18 litros (60 x 40 x 20 cm). La longitud de lesión de cada vareta experimental se evaluó a los 10 días después de la inoculación (ddi). Para completar los postulados de Koch, el hongo desarrollado en las varetas se reaisló en cultivo puro y se comparó morfológicamente con el aislamiento que fue inoculado.
In vivo. Las inoculaciones en campo fueron realizadas en E. nitens de tres años de edad en la parcela Ma. del Carmen Alcantar (REXCEL). Se inocularon cinco árboles de eucalipto por aislamiento y cinco árboles inoculados con discos de PDA como testigos. La inoculación se hizo a una altura de 1.80 m de la base del tallo; una superficie de 10 cm de longitud se desinfectó con alcohol al 70 % y se lavó con agua destilada estéril. La corteza se removió (8 mm de diámetro) y se aplicó la misma técnica de inoculación utilizada en las pruebas de patogenicidad en varetas. La zona inoculada se cubrió con algodón y gasas húmedas estériles, y se sellaron con papel parafilm para evitar la desecación. A los 48 ddi se evaluó la longitud de la lesión. El hongo del tejido enfermo se reaisló para completar los postulados de Koch.
Análisis estadístico
Las mediciones de longitud de la lesión en las varetas (in vitro) y en los árboles (in vivo) fueron sujetas a un análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias por diferencia mínima significativa (DMS, P = 0.0001) con el programa SAS v8.1 (Statistical Analysis System [SAS], 2000).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Síntomas en campo
]]> La incidencia de la enfermedad ocasionada por especies de Neofusicoccum en plantaciones de eucalipto se presentó en forma de manchones y los síntomas fueron la muerte regresiva en la parte aérea y la presencia de cancros en el fuste de E. globulus y E. nitens (Figura 1A). En la muerte regresiva hay necrosis de puntas, ramas, muerte de hojas y reducción de la copa de los árboles. En la corteza se observaron cancros de color negro, fusiformes, de tamaño variable y hundido; en la superficie de éstos se observaron estromas de color negro creciendo de manera agregada. Los cancros causaron hinchamientos en el fuste, algunas veces emitieron flujo de resina de color rojo y se desarrollaron brotes epícormicos. En la parte interna se observó necrosis de color café claro a oscuro que alcanzó al xilema, causando la muerte del árbol. En México, estos síntomas son provocados por N. parvum en aguacate, causando cancros y muerte regresiva en ramas (Molina-Gayosso, Silva-Rojas, García-Morales, & Ávila-Quezada, 2012). También N. parvum induce síntomas similares en plantaciones de E. globulus en España (Iturritxa, Slippers, Mesanza, & Wingfield, 2011). Por otra parte, Gezahgne, Roux, Slippers, y Wingfield (2004) describen los mismos síntomas causados por Botryospheria sp. en E. globulus, E. saligna Smith., E. grandis y E. citriodora Hook. en Etiopía.Aislamiento e identificación morfológica del patógeno
Seis hongos de la familia Botryosphaeriaceae se aislaron de las dos especies de eucalipto (E. nitens y E. globulus). En los predios Agustina Correa, Maravatío y Mireya Tinoco se aisló Neofusicoccum eucalyptorum (teleomorfo Botryosphaeria eucalyptorum Crous, H. Smith & M. J. Wingf.) de árboles de E. nitens. En Agustina Correa 1 se aisló Neofusicoccum parvum de E. nitens y en Francisco Maldonado y Raúl Armas se encontró el mismo patógeno pero en plantaciones de E. globulus. En Agustina Correa hubo presencia de pseudotecios de B. eucalyptorum sobre la corteza de E. nitens, y en Agustina Correa 1, Francisco Maldonado y Raúl Armas se observaron picnidios de N. parvum.
El hongo N. eucalyptorum creció 8 cm en forma radial a los 10 días en medio PDA. La colonia de color blanco y aspecto algodonoso a los cuatro días, se tornó gris oscura a negra a los 10 días, con abundante micelio aéreo (Figura 1 B); al reverso de la caja de Petri, la coloración fue negra. En algunos aislamientos, a los 15 días, se formaron picnidios inmaduros agrupados de color negro. Se observó estroma de color negro de 312.15 µm inmerso en el tejido del hospedante. El hongo N. eucalyptorum no formó el teleomorfo en el medio de cultivo. Los pseudotecios de N. eucalyptorum fueron de color café oscuro a negro con diámetro de 380 a 440 µm (Figura 1C); las aseas fueron clavadas y bitunicadas de (70)40 x 15(-21) µm con ocho ascosporas (Figura ID) e intercaladas con parafisos filiformes; las ascosporas fueron hialinas, no septadas y con apariencia granular, de forma ovoide a claviforme con el ápice obtuso o ligeramente redondeado de (20-)23-26(-28) x (7-)8-9(-11) µm.
El aislamiento de N. parvum creció en medio PDA, la cual se observó de color blanco a los cuatro días, se tornó blanco grisáceo a los seis u ocho días y completamente negra a los 10 días, con abundante micelio aéreo (Figura 1E). En la superficie del medio de cultivo se observó la presencia de pienidios globulares de color negro oscuro, cubierto de micelio color gris a los 14 días, sin la formación de conidios. Slippers y Wingfield (2007) mencionan que para inducir la formación de conidios en picnidios, el hongo se debe cultivar en el medio de agar-agua (AA) o extracto-malta-agar (EMA), suplementado con acículas de pino o pequeños trozos de tejido del hospedante e incubar a 25 °C. El desarrollo de N. parvum en medio de cultivo PDA es similar a N. eucalyptorum, bajo las mismas condiciones de laboratorio. Además, N. parvum desarrolló picnidios solitarios o agrupados en estromas de color negro de 299 µm, creciendo en ramas y tallo de E. nitens y E. globulus (Figura 1 F). Los conidios son hialinos, fusiformes y aseptados de 18.9 (-23) x4 (-4.9) µm (Figura 1 G), similar alo reportado por Iturritxa et al. (2011).
En campo, N. eucalyptorum y N. parvum muestran los mismos síntomas y signos causando cancros y muerte regresiva, expresándose la enfermedad en condiciones de estrés ocasionado por las heladas y sequías prolongadas en la zona. En medio de cultivo se observó similitud en el desarrollo con una coloración blanca que posteriormente se tornó negra y en algunas cepas hubo presencia de picnidios.
Identificación molecular del patógeno
El análisis molecular confirmó la identificación morfológica de N. eucalyptorum (B. eucalyptorum (aislamientos MA, AC y MT) y N. parvum (aislamientos AC1, FM y RA) como asociados a la muerte regresiva en las dos especies de eucalipto (E. nitens y E. globulus). Las secuencias genéticas de N. eucalyptorum (números de acceso en el NCBI: KC479184 y KC4799188) y N. parvum (KC479185, KC479186 y KC479187) mostraron 100 % de similaridad con las reportadas para estos hongos en el GenBank.
Pruebas de patogenicidad in vitro e in vivo
Todos los aislamientos de Neofusicoccum inoculados en las pruebas son patogénicos y ocasionan lesiones necróticas en las varetas de E. nitens y E. globulus. En E. globulus, la lesión con mayor longitud (21.7 cm) la causó el aislamiento FM de N. parvum y la menor longitud de lesión (18.6 cm) fue provocada por el aislamiento MA (N. eucalyptorum). En las varetas de E. nitens, el aislamiento AC1 causó la mayor lesión con longitud media de 16.63 cm y la menor fue ocasionada por el aislamiento RA con 11.5 cm; ambos identificados como N. parvum. No hubo desarrollo de lesión en las varetas inoculadas con discos de PDA; las lesiones desarrolladas por los aislamientos fueron diferentes significativamente respecto al testigo (P < 0.0001). La longitud de las lesiones producidas fue estadísticamente diferente entre algunos aislamientos (P < 0.0001) (Figura 2). En las zonas necróticas hubo picnidios inmaduros creciendo de forma agregada y solitaria (Figura 1H).
]]> En las inoculaciones en campo, el intervalo de lesión en E. nitens fue de 13.12 a 20.92 cm a los 48 ddi; de forma fusiforme, color café oscuro y de apariencia hundida (Figura 1I y 1J). La lesión mayor fue causada por N. eucalyptorum (AC) y la menor longitud de lesión, por N. parvum (RA); estadísticamente no hubo diferencias significativas entre los aislamientos pero sí con respecto al testigo (P < 0.0001), el cual no desarrolló lesión (Figura 2). Smith et al. (2001) mencionan que N. eucalyptorum causa lesiones de 5.3 cm a los 30 ddi y que fue menos agresivo que B. dothidea en E. grandis. El patógeno N. eucalyptorum se ha reportado en Chile, Uruguay (Pérez et al., 2009), Sudáfrica (Smith et al., 2001) y Australia (Burgess, Sakalidis, & Hardy, 2006) por causar cancros en E. globulus y E. nidens; también Pérez et al. (2009) reportan que el patógeno se encuentra de forma endófita en E. dunnii Maiden, E. grandis, E. maidenii F. Muell, E. tereticornis Sm. y E. viminalis Labill y en otros hospedantes como Blepharocalyx salicifolius (Hum., Bompl. &Kunth) Berg., Myrceugenia glaucescens (Camb.) Legr. et Kausel, y Myrrhinium atropurpureum var. octandrum Benth. En Etiopía y República del Congo, N. parvum causa muerte regresiva, induce cancros en el fuste de Eucalyptus y puede llegar a causar lesiones de 2.5 a 9.2 cm de longitud a los 48 ddi (Gezahgne et al., 2004). En el presente estudio se confirma la capacidad de N. eucalyptorum y N. parvum para causar cancros y muerte de eucaliptos plantados en zonas afectadas por factores abióticos como heladas y sequías prolongados durante el año (Schoeneweiss, 1981). Varias especies de Botryosphaeriaceae son endófitos que causan enfermedad después de un periodo de estrés (Slippers & Wingfield, 2007).
CONCLUSIONES
Los hongos causantes de cancros, muerte regresiva en ramas y tallos en eucaliptos fueron identificados morfológicamente, y confirmados molecularmente, como N. eucalyptorum y N. parvum. El hongo B. eucalyptorum, teleomorfo de N. eucalyptorum, sólo se encontró en árboles de E. nitens, y N. parvum en árboles de E. globulus y E. nitens. Este es el primer reporte de los hongos N. eucalyptorum y N. parvum causando enfermedad en México; además se confirma la habilidad de dichos patógenos para la infección de especies de eucalipto.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación forma parte del proyecto del Fondo Sectorial para la Investigación y Desarrollo y la Innovación Tecnológica Forestal, CONAFOR-CONACYT 148206 (Diagnóstico y alternativas para la prevención, control y manejo de diversas plagas y enfermedades que afectan las plantaciones forestales comerciales).
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