Isolation and identification of sterols in a commercial strain of Pleurotus sp
Olivia Márquez-Fernández; Luis Á. Juárez Pacheco; Ángel Trigos*
Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX), Universidad Veracruzana. Calle Médicos 5, col. Unidad del Bosque, C. P. 91010. Xalapa, Veracruz. MÉXICO. Correo-e: atrigos@uv.mx Tel.: 228 8404255 (*Autor para correspondencia).
Recibido: 01 de diciembre, 2013 ]]> Aceptado: 28 de mayo, 2014
RESUMEN
Cinco compuestos de una cepa comercial del hongo Pleurotus sp. se obtuvieron a partir de extracciones con acetato de etilo y metanol. Los compuestos se aislaron por medio de técnicas como la cromatografía en columna y en capa fina. Los siguientes esteroles fueron identificados mediante espectroscopía RMN 1H: 1) ergosta-5, 7, 22-trien-3β-ol (ergosterol), 2) 5α, 8α-epidioxi-22E-ergosta-6, 22-dien-3β-ol (peróxido de ergosterol), 3) 3β, 5α, 6β, 9α-tetrahidroxiergosta-7, 22-dieno, 4) 3β, 5α, 6β, 9α-tetrahydroxyergosta-7, 22-dien y 5) 3β, 5α, 9α-trihidroxiergosta-7, 22-dien-6-ona.
Palabras clave: Setas, alimentos funcionales, metabolitos secundarios activos.
ABSTRACT
Five compounds in a commercial strain of the mushroom Pleurotus sp. were obtained from ethyl acetate and methanol extracts. The compounds were isolated using techniques such as column and thin layer chromatography. The following sterols were identified by 1H NMR spectroscopy: 1) ergosta-5,7,22-trien-3β-ol (ergosterol), 2) 5α, 8α-epidioxy-22E-ergosta-6, 22-dien-3β-ol (ergosterol peroxide), 3) 3β,5α,6β,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno, 4) 3β, 5α, 6β, 9α-tetrahydroxyergosta-7, 22-dien and 5) 3β, 5α, 9α-trihidroxiergosta-7,22-dien-6-one.
Keywords: Mushrooms, functional foods, active secondary metabolites.
]]> INTRODUCCIÓN
Los hongos basidiomicetos de podredumbre blanca, entre los que figuran casi todas las especies de Pleurotus, se caracterizan por la degradación eficiente de lignina en los tejidos leñosos (Eriksson, Blanchette, & Ander, 1990). Varias especies de hongos se consideran protagonistas importantes en los ciclos biológicos debido a que pueden modificar o degradar completamente los componentes de la madera. En este sentido, algunas especies del género Pleurotus se han investigado por su contenido de enzimas oxidativas y por su participación primaria como degradadores leñosos (Tuor, Winterhalter, & Fiechter, 1995).
La seta ostra o Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. es la variedad comestible más sencilla de cultivar, además presenta buenas propiedades culinarias y medicinales. En México se comercializan dos especies: P. ostreatus y P. pulmonarius (Fr.) Quél, que son cultivadas por los productores de hongos comestibles tanto a pequeña como mediana escala. La producción industrial se realiza con cepas importadas de Europa, Norteamérica y el suroeste de Asia (Mora & Martínez-Carrera, 2007). Estos hongos están ganando gran importancia biotecnológica y ambiental, debido a su capacidad de crecer sobre residuos lignocelulósicos agrícolas. Cabe señalar, que casi todas las producciones agrícolas generan cantidades enormes de rastrojo, que puede ser aprovechado para el cultivo de setas (Cohen, Persk, & Hadar, 2002; Ghorai et al., 2009). Por otro lado, durante la década pasada, P. ostreatus fue catalogado como alimento funcional, al igual que otros hongos, dados sus efectos benéficos para la salud. La propiedad principal que se atribuye a la especie es la capacidad de reducir el colesterol debido a la presencia de lovastatina (Alarcón et al., 2003; Trigos & Suárez, 2010; Wasser, 2011). Asimismo, los extractos de dicho hongo han sido investigados por sus propiedades hipoglucemiante, antitrombótica, antiinflamatoria, antioxidante e inmunomoduladora, lo que le confiere potencial terapéutico para el tratamiento de varias enfermedades crónico-degenerativas (Chegwin-Angarita, Nieto-Ramirez, Atehortúa, & Sepúlveda, 2012). Sin embargo, los estudios sobre la composición química del hongo se han dejado de lado, ya que la mayoría de los estudios se enfocan en la optimización de los procesos de producción de biomasa utilizando diferentes sustratos y en la producción de enzimas lignocelulósicas. Por tal razón, el objetivo principal de este trabajo fue conocer los componentes minoritarios, provenientes del metabolismo secundario de una especie comercial del género Pleurotus; asimismo, autentificar la existencia de componentes que lo posicionan como alimento funcional.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
El material de estudio se adquirió en un supermercado local, proveniente de Hongos San Miguel (Amycel Co) (Figura 1), en febrero de 2012. Las setas fueron cultivadas en rastrojo de maíz y cebada. La vida de anaquel fue de dos días a una temperatura entre 3 a 7 °C. Una muestra liofilizada se mantiene en resguardo en la colección de hongos macroscópicos de LATEX.
Extracción de compuestos
Los cuerpos fructíferos (1.5 kg) fueron macerados en una solución de HCl (2 L, 0.1 N, pH 2-3) durante 24 h en agitación (Alarcón et al., 2003). La extracción de compuestos se hizo con acetato de etilo (1 L) hasta agotamiento. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, obteniendo un peso de 5.07 g de extracto. Otra muestra de 1.5 kg fue liofilizada y extraída con metanol (1.5 L); el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El extracto obtenido se sometió a una segunda extracción con acetato de etilo (1 L) y se llevó a sequedad consiguiendo un peso seco de 6.6 g.
Separación y purificación de compuestos
]]> Los compuestos se separaron y purificaron a través de cromatografía en columna, utilizando gel de sílice (Merck tamaño de malla 0.2-0.5 mm y 0.040-0.062 mm) como soporte y un gradiente de polaridad hexano/acetato de etilo como fase móvil y, posteriormente, otro gradiente de acetato de etilo/metanol. El proceso se monitoreó mediante cromatografía en capa fina (CCF) (aluminio y gel de sílice 60 GF254, marca Merck de 0.2 mm de espesor) utilizando luz ultravioleta (254-365 nm), vapores de yodo, y solución de ácido fosfomolíbdico al 10 % como reveladores.Caracterización estructural de compuestos
Los puntos de fusión se tomaron en un aparato tipo Fisher-Johns (Cole Parmer, 12-144, USA). Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN1H) se obtuvieron en un espectrómetro Varian Gemini de 300 MHz (USA) y en un Bruker AVANCE AMX de 500 MHz (USA), empleando cloroformo y dimetil-sulfóxido deuterados (DMSO) como disolventes, y tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. Los desplazamientos químicos de las señales (δ) de los espectros se expresaron en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) en Hertz (Hz). Las señales en los espectros fueron: señal simple (s), señal doble (d), señal doble de doble (dd) y señal compleja (c).
1) Ergosterol. Sólido cristalino con punto de fusión de 166-170 °C que se descompone con la luz, obtenido a partir del extracto etil-acético y metanólico en las fracciones de 9:1 hexano-acetato de etilo. RMN 1H (300 MHz, CDCl3): δ 5.57 ppm (dd, J = 5.6, 2.3 Hz, H-6), 5.38 (dd, J = 5.3, 2.2 Hz, H-7), 5.19 (c, H-22-23), 3.63 (c, H-3), 1.03 (d, J = 6.8 Hz, H-21), 0.94 (s, H-19), 0.92 (d, J = 6.8 Hz, H-28), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, H-27), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, H-26), 0.63 (s, H-18).
2) Peróxido de ergosterol. Sólido cristalino con punto de fusión de 154-156 °C, obtenido a partir del extracto etil-acético y metanólico en las fracciones de 7:3, hexano-acetato de etilo. RMN 1H (300 MHz, CDCl3 ): δ 6.50 ppm (d, J = 8.5 Hz, H-7), 6.25 (d, J = 8.5 Hz, H-6), 5.20 (c, H-22-23), 3.97 (c, H-3), 0.99 (d, J = 6.6 Hz, H-21), 0.91 (d, J = 6.6 Hz, H-28), 0.88 (s, H-19), 0.83 (d, J = 6.9 Hz, H-27), 0.82 (s, H-18), 0.81 (d, J = 6.9 Hz, H-26).
3) Cerevisterol. Sólido blanco con punto de fusión de 242-245 °C, aislado a partir del extracto etil-acético en las fracciones de 1:1, hexano-acetato de etilo. RMN 1H (500 MHz, CDCl3): δ 5.35 ppm (d, J = 5.3 Hz, H-7), 5.19 (c, H-22), 5.19 (c, H-23), 4.08 (c, H-3), 3.63 (c, H-6), 1.08 (s, H-19), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, H-21), 0.92 (d, J = 6.8 Hz, H-28), 0.84 (d, J = 7.4 Hz, H-27), 0.82 (d, J = 7.4 Hz, H-26), 0.60 (s, H-18).
4) 3β,5α,6β,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno. Sólido amorfo obtenido a partir del extracto metanólico en las fracciones con polaridad de 1:9, hexano-acetato de etilo. RMN 1H (300 MHz, DMSO-D6): δ 5.20 ppm (c, H-22), 5.17 (c, H-23), 5.08 (c, H-7), 3.79 (s, H-3), 3.60 (c, H-6), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, H-21), 0.90 (s, H-19), 0.88 (d, J = 6.9 Hz, H-28), 0.81 (d, J = 3.9 Hz, H-26), 0.79 (d, J = 3.9 Hz, H-27), 0.54 (s, H-18).
5) 3β,5α,9α-trihidroxiergosta-7,22-dien-6-ona. Sólido amorfo purificado a partir del extracto etil-acético en las fracciones con polaridad de 1:1, hexano-acetato de etilo. RMN 1H (500 MHz, CDCl3): δ 5.69 ppm (d, J = 2.0 Hz, H-7), 5.26 (c, H-22), 5.19 (c, H-23), 4.06 (c, H-3), 1.06 (d, J = 7.3 Hz, H-21), 1.05 (s, H-19), 0.95 (d, J = 7.3 Hz, H-28), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, H-27), 0.85 (d, J = 6.8 Hz, H-26), 0.65 (s, H-18).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
]]> Cinco esteroles de una cepa comercial del hongo Pleurotus sp. se purificaron a partir de la extracción ácida con acetato de etilo (5.07 g de extracto) y de la extracción con metanol (6.6 g de extracto). A través de los datos espectrales de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H) y mediante comparación con la literatura, los esteroles fueron identificados como: 1) ergosterol, 2) peróxido de ergosterol, 3) cerevisterol, 4) 3β,5α,6β,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno y 5) 3β,5α,9α-trihidroxiergosta-7,22-dien-6-ona (Figura 2) (Kawagishi et al., 1988; Trigos, Amezcua, Reyna, & Carrión, 1997; Trigos & Ortega-Regules, 2002; Trigos, Zayas, Ortuño, Sobal, & Morales, 1994).Así, en todos los espectros de resonancia RMN 1H (Cuadro 1) se aprecian, a campo alto, las seis señales características de los grupos metilos de este tipo de compuestos; es decir, dos singuletes que integran cada uno a tres protones, atribuibles a los dos metilos angulares, y cuatro dobletes que integran también cada uno a tres protones, correspondientes a los cuatro metilos existentes en sus cadenas laterales. Igualmente, en todos los espectros se aprecia una señal compleja entre 3.5 y 4.5 ppm aproximadamente, correspondiente al protón geminal al grupo hidroxilo en C-3, que por su anchura indica la estereoquímica en β del hidroxilo mencionado. Prácticamente, los espectros de RMN 1H del ergosterol y su peróxido son muy parecidos y sólo difieren en los protones vinílicos del anillo B ya que en el caso de ergosterol aparecen en δ 5.57 ppm (1H, J = 5.6, 2.3 Hz) y 5.38 ppm (1H, J = 5.3, 2.2 Hz) y en el peróxido a δ 6.50 ppm (1H, J = 8.5 Hz) y 6.25 ppm (1H, J = 8.5 Hz). En el caso del cerevisterol y el 3β,5α,6α,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno (espectro realizado en dimetil sulfóxido deuterado), también sus espectros de RMN 1H son prácticamente iguales, difiriendo estructuralmente en el grupo hidroxilo en C-9 adicional en el compuesto 3β,5α,6α,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno. Esto se evidencia, entre otras señales, con los desplazamientos de H-7 que en el cerevisterol se observa en 5.35 ppm y en 3β,5α,6α,9α-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno en 5.08 ppm; mientras que el metilo angular en C-10 se observa en 1.11 y 0.90 ppm, respectivamente. Finalmente, en el espectro de RMN1H realizado en cloroformo deuterado, la estructura del 3β,5α,9α-trihidroxiergosta-7,22-dien-6-ona se evidencia principalmente en relación con los compuestos anteriores, por el desplazamiento a campo bajo del protón H-7 en 5.69 ppm.
Cabe señalar que son varios los estudios donde se ha demostrado que el ergosterol y el peroxi-ergosterol pueden contribuir con beneficios potenciales para la salud, incluyendo la reducción de dolor relacionado con la inflamación por inhibición de la enzima ciclooxigenasa (Takaku, Kimura, & Okuda, 2001), la reducción de accidentes por enfermedad cardiovascular e inhibición del crecimiento tumoral favoreciendo la apoptosis (Bok, Lermer, Chilton, Klingeman, & Towers, 1999; Subbiah & Abplanalp, 2003; Yazawa, Yokota, & Sugiyama, 2000). También existen reportes de que dichos compuestos inhiben directamente la angiogénesis (Takaku et al., 2001) y actúan como antioxidantes o como agentes antiinflamatorios (Wiseman, 1993). Adicionalmente, el peróxido de ergosterol ha demostrado actividad antitripanocida y antitumoral (Kobori, Yoshida, Ohnishi-Kameyama, & Shinmoto, 2007; Ramos-Ligonio, López-Monteon, & Trigos, 2012). En cuanto al cerevisterol, existen reportes donde se informa su actividad citotóxica al inhibir la actividad del α-ADN polimerasa, impidiendo la replicación celular (Kawagishi et al., 1998; Mizushina et al., 1999).
CONCLUSIONES
Nuestros resultados confirman que el hongo comercial Pleurotus sp. contiene esteroles reportados como bioactivos y potencialmente anticancerígenos; sin embargo, dado que las cantidades de los compuestos no fueron cuantificadas y que no existen estudios clínicos suficientes de la aplicación in vivo, no se puede afirmar que el consumo del hongo estudiado sea la solución para afecciones crónico-degenerativas, entre otras. Ahora bien, se cree que la inclusión regular de este hongo en la dieta nos puede aportar beneficios para la salud y, en este contexto, la demanda en el sector alimentario y productor cada vez aumenta. Con la premisa de que la alimentación contribuye en gran medida a la salud y al bienestar; hoy en día, los alimentos no sólo deben satisfacer una necesidad vital, sino prevenir enfermedades y proveer de bienestar físico a los consumidores, lo cual define a un alimento funcional.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo financiero de CONACYT mediante el proyecto de Ciencia Básica 2012: 181820, así como a la empresa Hongos San Miguel por el apoyo técnico.
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