Effect of culture medium on development of Suillus granulatus (L.) Roussel and S. brevipes (Pk.) Kuntze

Dulce Ma. Murrieta-Hernández¹*; Juan C. Noa-Carrazana¹; Martín Mata-Rosas²; María del R. Pineda-López¹; Ramón Zulueta-Rodríguez³; Norma Flores-Estévez¹.

¹ Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Universidad Veracruzana. Av. de las Culturas núm. 101, col. Emiliano Zapata. C. P. 91090. Xalapa, Veracruz, México. Correo-e: dulcemaria_m@yahoo.com Tel.: +52 228 8422773 (*Autora para correspondencia).

² Instituto de Ecología, A. C. Carretera antigua a Coatepec 351, El Haya. C. P. 91070. Xalapa Veracruz, México.

³ Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad Veracruzana. Circuito Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Zona Universitaria. C. P. 91090. Xalapa, Veracruz, México.

Recibido: 23 de junio, 2013
Aceptado: 10 de febrero, 2014

Resumen

La tasa de crecimiento micelial de los hongos ectomicorrícicos Suillus granulatus y S. brevipes, se evaluó en tres medios de cultivo (PDA, BAF y MNM) con dos valores de pH (4.8 y 5.8), con el fin de seleccionar el mejor medio de cultivo. Las cepas se aislaron de esporomas colectados en el bosque de Pinus hartwegii del Parque Nacional Cofre de Perote, Veracruz, México. Se encontraron diferencias significativas (Tukey, P ≤ 0.05) en el área de crecimiento de ambas especies; los valores más altos se registraron en el medio PDA. Respecto a los valores de pH evaluados, no hubo diferencias significativas. Cada uno de los medios evaluados se puede utilizar para el cultivo de las cepas S. granulatus y S. brevipes dependiendo de los objetivos. El medio PDA fue el mejor sustrato para el crecimiento de las cepas. Se sugiere utilizar el medio BAF para la producción masiva de micelio para inóculo y el medio MNM se recomienda ya sea para el mantenimiento de las cepas o para pruebas de micorrización.

Palabras clave: Boletaceos, bosque templado, ectomicorrizas, hongos comestibles, pinos.

Abstract

The mycelial growth rates of ectomycorrhizal fungi Suillus granulatus and S. brevipes were assessed in three culture media (PDA, BAF and MMN) at two pH values (4.8 and 5.8) in order to select the best culture medium. The strains were isolated from sporocarps collected in a Pinus hartwegii forest in Cofre de Perote National Park, Veracruz, Mexico. Significant differences (Tukey, P ≤ 0.05) in the growth area of both species were found. The highest values were recorded in the PDA medium. Concerning the pH values tested, there were no significant differences. Each of the tested media can be used for culturing the S. granulatus and S. brevipes strains, depending on the objectives. The PDA medium was the best substrate for the growth of the strains. We suggest using the BAF medium for mass production of mycelium for inoculum, and the MMN medium for either strain maintenance or mycorrhization testing.

INTRODUCCIÓN

Los hongos silvestres comestibles son uno de los grupos más importantes de la gama de productos forestales no maderables. Muchos de ellos forman una asociación micorrícica con especies forestales contribuyendo a mantener e incrementar la biodiversidad de los suelos, así como el funcionamiento del ecosistema (Smith & Read, 1997), especialmente en bosques de coníferas de zonas templadas (Sylvia, 1999). Algunas especies de hongos ectomicorrícicos pueden cultivarse en laboratorio para su posterior uso en micorrizaciones controladas de plantas en vivero. De este modo, la selección adecuada de hongos micorrícicos como simbiontes y su posterior manipulación, tanto en laboratorio como en vivero, pueden ser aspectos clave para el éxito del establecimiento de especies vegetales en campo (Honrubia, Torres, Díaz, & Cano, 1992).

El uso de la asociación micorrícica, a partir de inóculos, en la propagación de plantas en vivero se realiza por lo general con cepas de procedencia extranjera. Esta práctica es común pero tiene implicaciones importantes en la economía de los productores al adquirir productos importados y provoca impacto en la biodiversidad fúngica local (Pérez-Moreno, 2012), ya que cada especie tiene sus propias limitaciones ecológicas, y las condiciones del sitio pueden afectar el desarrollo o actividad de los hongos ectomicorrícicos. Por tanto, resulta significativo integrar a los programas de reforestación, plántulas con micorrizas de especies regionales adaptadas a las condiciones del sitio donde serán utilizadas. En este sentido, Pereira, Herrera, Machuca, y Sánchez (2007) sugieren que las primeras especies a estudiar sean aquellas que crecen en forma natural en los sitios de interés.

En la propagación micelial, el crecimiento de las cepas de hongos ectomicorrícicos es afectado por las condiciones de cultivo, principalmente el pH, temperatura y composición de los medios. El estudio del comportamiento y requerimientos de estos microorganismos en cultivo puro, constituye la base de la producción de inóculo; etapa necesaria para la micorrización controlada en plantas de interés forestal y posterior producción de esporomas (Díaz, Flores, & Honrubia, 2009a; Hatakeyama & Ohmasa, 2004a).

Los medios más utilizados para hongos ectomicorrícicos, ya sea para el aislamiento (medios sólidos) o la micorrización (medios líquidos), son el BAF (biotina-aneurina- ácido fólico), MNM (Melin-Norkrans modificado) y PDA (papa-dex-trosa-agar) (Chávez, Pereira, & Machuca, 2009; Díaz, Carrillo, & Honrubia, 2009b; García-Rodríguez, Pérez-Moreno, Aldrete, Cetina-Alcalá, & Vaquera-Huerta, 2006; Vázquez-García, Santiago-Martínez, & Estrada-Torres, 2002). Estos medios de cultivo han sido probados con diferentes especies y se han obtenido diversos resultados respecto al éxito de crecimiento y desarrollo del micelio (Díaz et al., 2009b; García-Rodríguez et al., 2006; Pereira et al., 2007; Sánchez, Honrubia, & Torres, 2000; Torres & Honrubia, 1991; Vázquez-García et al., 2002). El objetivo de este trabajo fue seleccionar el medio que permita la mayor velocidad de crecimiento de dos especies de Suillus, la producción masiva de inóculo y su utilización en la micorrización de plantas de pino.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las cepas se aislaron de esporomas recolectados en el bosque de Pinus hartwegii del Parque Nacional Cofre de Perote, Veracruz, México. Las especies identificadas con base en sus características morfológicas fueron Suillus granulatus (L.) Roussel y S. brevipes (Peck) Kuntze, de acuerdo con las descripciones de Breitenbach y Fránzlin (1991) y Ground y Harrison (1976).

Con el fin de seleccionar el mejor medio de cultivo para Suillus, se realizaron pruebas con los siguientes medios sólidos: Papa-dextrosa-agar (PDA) (Bioxon, Bencton Dickinson, México), biotina-aneurina-ácido fólico (BAF) (Moser, 1960) y Melin-Norkrans modificado (MNM) (Marx, 1969). Además, para cada tipo de medio se probaron dos valores de pH (4.8 y 5.8) reportados por Pereira et al. (2007) para el género Suillus.

La tasa de crecimiento y el área de las colonias se determinaron utilizando discos (5 mm de diámetro) de medio de cultivo con micelio de cada cepa, los cuales fueron inoculados en el centro de las cajas de Petri (50 x 9 mm). Posteriormente, las cajas se incubaron a 25 °C en condiciones de oscuridad durante 30 días. El crecimiento de la colonia se midió cada seis días, delimitando el área en el fondo de la caja de Petri con un marcador indeleble. El área (cm²) se calculó con el programa Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., 2010). Al final del experimento, la tasa de crecimiento se estimó con la fórmula TC = [(crecimiento final - crecimiento inicial) / tiempo de incubación] (Guigón-López et al., 2010).

El experimento se llevó a cabo con un diseño completamente al azar con arreglo factorial, considerando tres factores: 1) cepas de hongos ectomicorrícicos (S. granulatus y S. brevipes), 2) medios de cultivo (PDA, BAF y MNM) y 3) pH (4.8 y 5.8); en total se aplicaron 12 tratamientos con cinco repeticiones. La unidad experimental fue la caja de Petri, considerando la colonia de crecimiento como unidad de estudio. Los datos se sometieron a una prueba de normalidad de acuerdo con la prueba de Levene (1960). Posteriormente se hizo un análisis de varianza (ANDEVA) y comparación de medias de Tukey (P < 0.05) con el paquete Statistica versión 7 (StatSoft, Inc., 2007).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A los tres días del aislamiento, el micelio comenzó a crecer en el medio observándose tejido de color blanco en la periferia del fragmento. A los 12 días, el micelio cambió a color beige con un margen blanquecino; la colonia se veía café rojizo por la parte posterior de la caja, coincidiendo con la descripción de Hutchison (1991). Simultáneamente, el medio de cultivo cambió de color amarillo café a café rojizo, debido a los metabolitos exudados por los hongos, lo cual fue más evidente en el medio BAR

En la Figura 1 se puede observar la tasa de crecimiento de S. granulatus en cada medio con los dos tipos de pH. La cepa alcanzó su mayor tasa de crecimiento en el día 24 y empezó a descender hacia los 30 días. En el medio MNM con pH 4.8 se observó un comportamiento diferente debido a una disminución a los 18 días y un incremento a los 24 días; este tratamiento presentó la menor tasa de crecimiento. Las mayores tasas de crecimiento se registraron en el medio PDA con pH 5.8 (0.64 cm²·día EE = 0.11) y 4.8 (0.56 cm²·día EE = 0.12).

En general, el mayor incremento de las colonias ocurrió a los 24 días. Lo anterior indica que posiblemente en este punto es necesario renovar el medio, pues los nutrientes pudieron haberse agotado, lo cual también coincide con el cambio de color amarillo a café.

En la Figura 3 se puede observar el área alcanzada por las colonias de S. granulatus y S. brevipes. Las mayores áreas de crecimiento se observaron en el medio PDA, sin diferencia significativa entre los dos pH probados (F = 1.4, P = 0.24). En cambio, entre las dos especies de hongos si se observaron diferencias estadísticas significativas (F = 18.6; P = 0.00). En general, la especie S. granulatus creció más que S. brevipes en todos los tratamientos, a excepción del PDA con pH 4.8. El ANDEVA mostró diferencias significativas (F = 44.8, P = 0.00) entre los medios de cultivo. De acuerdo con la prueba de Tukey, el medio PDA fue el mejor pues indujo las mayores áreas de crecimiento de S. granulatus (13.0 cm², EE = 0.85) y S. brevipes (12.4 cm²,EE = 0.67), seguido por el medio BAF (S. granulatus: 11.2 cm², EE = 0.98; S. brevipes: 8.1 cm²,EE = 0.36). Las áreas más pequeñas se obtuvieron con el medio MNM (S. granulatus: 10.1 cm², EE = 0.44; S. brevipes: 7.3 cm²,EE = 0.86).

El PDA fue el mejor medio de cultivo. Este resultado es conveniente para la selección y el aislamiento de las cepas pues es un medio fácil de preparar. Sin embargo, para la producción de inoculo, donde se necesita medio líquido, se sugiere utilizar el medio BAF que fue el mejor después del PDA. En el medio MNM, las cepas de Suillus se desarrollaron muy poco, coincidiendo con lo reportado por Torres y Honrubia (1991) quienes evaluaron S. granulatus en el mismo medio. Los resultados obtenidos son similares a los observados en los hongos S. bellini y S. luteus, con áreas promedio de 14.5 y 6.2 cm² en pH 5.8 y 4.8, respectivamente (Pereira et al., 2007). Vázquez-García et al. (2002) mencionan que las cepas del género Suillus presentaron gran variabilidad en los patrones de crecimiento, aunque en general prefirieron pH ácido (3-6).

Los hongos ectomicorrícicos tienen poca habilidad de descomponer polisacáridos como la celulosa o hemicelulosa y crecen lento en medio artificial (Ohta, 1997). Por tanto, únicamente la glucosa y algunos otros monosacáridos y disacáridos pueden utilizarse para el crecimiento (Kusuda et al., 2007). Es posible que el bajo contenido de glucosa en el medio MNM (10 g·litro^-1) fue la causa de que el micelio creciera menos pues, según lo reportado por Hatakeyama y Ohmasa (2004a), muchas cepas de Suillus y Boletinus crecieron mejor en concentraciones relativamente altas de glucosa (3.33 a 10 %), como es el caso del medio BAF (30 g·litro^-1), mientras que el crecimiento de otras especies se inhibió a esta concentración (Hakateyaa & Ohmasa, 2004b). El medio PDA es un medio rico en almidón; Otha (1997) mostró que Tricholoma matsutake tiene la habilidad de utilizar almidón como fuente de carbón. Seguramente S. granulatus y S. brevipes también utilizan el almidón del medio.

Se puede considerar que el medio MNM fue el mejor para el mantenimiento de las cepas en estudio, pues al crecer más lento, el cambio de medio se hará en un tiempo mayor al sugerido por Brundrett, Bougher, Dell, Grove y Malajczuc (1996); es decir, de dos a tres meses. Por otra parte, el medio BAF sería el más indicado para la producción de inoculo en sustratos inertes, pues indujo mayor velocidad de crecimiento, lo cual es importante para la producción masiva del micelio.

CONCLUSIONES

El medio PDA fue el mejor sustrato para el crecimiento de las cepas, por lo que se sugiere utilizarlo para aislamiento, mientras que el medio BAF se sugiere utilizar para la producción masiva de micelio para inoculo, donde se requiere de medio líquido. El medio MNM se recomienda ya sea para el mantenimiento de las cepas o para pruebas de micorrización porque contiene poca glucosa, lo que puede facilitar la asociación hongo-planta.

AGRADECIMIENTOS

La primera autora agradece a CONACYT por la beca 54427 para estudios de posgrado en INBIOTECA, U. V, y a los doctores Enrique Alarcón y Antero Ramos por la revisión crítica del manuscrito.

REFERENCIAS

Adobe Systems, Inc. (2010). Adobe Photoshop Extended CS5®. Computer software para Windows vista 7, XP. San José, CA, USA: Autor.         [ Links ]

Breitenbach, J., & Kránzlin, F. (1991). Fungi of Switzerland. Vol. 3 Boletes and agarics. Lucerne, Switzerland Mykologia Lucerne.         [ Links ]

Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T., & Malajczuc, N. (1996). Working with mycorrhizas in forestry and agriculture. Camberra, Australia: ACIAR. Obtenido de http://aciar.gov.au/files/node/2241/mn32_pdf_66358.pdf.         [ Links ]

Chavez, D, Pereira, G., & Machuca, A. (2009). Efecto de tipos de inóculos de tres especies fúngicas en la micorrización controlada de plántulas de Pinus radiata. Bosque, 30,4-9. Obtenido de http://www.scielo.cl/pdf/bosque/v30n1/art02.pdf.         [ Links ]

Díaz, G., Flores, R., & Honrubia, M. (2009a). Descripción de cultivos miceliares de Boletales neotropicales y europeos (Boletus grupo edulis, Boletellus y Suillus) y formación de primordios de B. edulis en cultivo puro. Revista Mexicana de Micología, 30, 1-7. Obtenido de http://www.scielo.org.mx/pdf/rmm/v30/v30a1.pdf.         [ Links ]

Díaz, G., Carrillo, C, & Honrubia, M. (2009b). Production of Pinus halepensis seedlings inoculated with the edible fungus Lactarius deliciosus under nursery conditions. New Forests, 38, 215-227. doi: 10.1007/sll056-009-9142-y.         [ Links ]

García-Rodríguez, J. L., Pérez-Moreno, J., Aldrete, A., Cetina-Alcalá, V. M., & Vaquera-Huerta, H. (2006). Caracterización del hongo silvestre ectomicorrízico Pisolithus tinctoreus (Pers.) Coker et Couch en cultivo y en simbiosis con eucalipto y pino. Agrociencia, 40, 665-676. Obtenido de http://www.colpos.mx/agrocien/Bimestral/2006/sep-oct/art-11.pdf.         [ Links ]

Guigón-López, G, Guerrero-Prieto, V, Vargas-Albores, E, Carvajal-Millán, E., Ávila-Quezada, G. D., Bravo-Luna, L.,...Lorito, M. (2010). Identificación molecular de cepas nativas de Trichoderma spp. su tasa de crecimiento in vitro y antagonismo contra hongos fitopatógenos. Revista Mexicana de Fitopatología, 28, 87-96. Obtenido de http://www.redalyc.org/pdf/612/61218468002.pdf.         [ Links ]

Ground, D. W., & Harrison, K. A. (1976). Nova Scotian Boletes. Germany: J. Cramer.         [ Links ]

Hatakeyama, T., & Ohmasa, M. (2004a). Mycelial growth of strains of the genera Suillus and Boletinus in media with a wide range of concentrations of carbon and nitrogen sources. Mycoscience, 45,169-176. doi: 10.1007/sl0267-003-0169-1.         [ Links ]

Hatakeyama, T., & Ohmasa, M. (2004b). Mycelialgrowth characteristics in a split-plate culture of four strains of the genus Suillus. Mycoscience, 45, 188-199. doi:10.1007/sl0267-003-0174-4.         [ Links ]

Honrubia, M., Torres, P., Díaz, G., & Cano, A. (1992). Manual para micorrizar plantas en viveros forestales. Madrid, España: Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, ICONA.         [ Links ]

Honrubia, M., Torres, M., Díaz, G., & Morte, A. (1995). Biotecnología forestal: Técnicas de micorrización y micropropagación de plantas. Murcia, España: Universidad de Murcia.         [ Links ]

Hutchison, L. J. (1991). Description and identification of cultures of ectomycorrrhizal fungi found in North America. Mycotaxon, 42, 387-504.         [ Links ]

Kusuda, M., Ueda, M., Konishi, Y., Yamanaka, K., Terashita, T., & Miyatake, K. (2007). Effects of carbohydrate substrate on the vegetative mycelial growth of an ectomycorrhizal mushroom, Tricholoma matsutake isolated from Quercus. Mycoscience, 48, 358-364. doi: 10.1007/sl0267-007-0384-2.         [ Links ]

Levene, H. (1960). Robust test for equality of variances. In I. Olkin, H. Hotelling, W. Hoeffding, W. C. Madow, & H. B. Mann (Eds.), Contributions to probability and statistics: Essays in honor of Harold Hotelling (pp. 278-292). USA: Stanford University Press.         [ Links ]

Marx, D. H. (1969). The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine roots to pathogenic infections I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic fungi and soil bacteria. Phytopathology, 59, 153-163.0btenido de http://www.apsnet.org/publications/phytopathology/backissues/Documents/1970Articles/Phyto60n10_1472.pdf.         [ Links ]

Moser, M. (1960). Die Pilze Mitteleuropas: Die Gattung Phlegmacium (Schleimköpfe). Heibrunn, Österreich: J. Klinkhardt.         [ Links ]

Ohta, A. (1997). Ability of ectomycorrhizal fungi to utilize starch and related substrates. Mycoscience, 38, 403-408. doi:10.1007/ BF02461680.         [ Links ]

Pereira, G., Herrera, J., Machuca, A., & Sánchez, M. (2007). Efecto del pH sobre el crecimiento in vitro de hongos ectomicorrícicos recolectados en plantaciones de Pinus radiata. Bosque, 28, 215-219. Obtenido de http://www.scielo.cl/pdf/bosque/v28n3/art05.pdf.         [ Links ]

Pérez-Moreno, J. (2012). Los hongos comestibles ectomicorrícicos y su biotecnología. In J. E. Sánchez, & G. Mata (Eds.), Hongos comestibles y medicinales en Iberoamérica: Investigación y desarrollo en un entorno multicultural (pp. 19-28). Tapachula, Chiapas: Colegio de la Frontera Sur.         [ Links ]

Sánchez, E, Honrubia, M., & Torres, P. (2000). Características culturales de algunos hongos ectomicorrícios en cultivo puro. Revista Iberoamericana de Micología 17, 127-134. Obtenido de http://www.reviberoammicol.com/2000-17/127134.pdf.         [ Links ]

Smith, S. E., & Read, D. J. (1997). Mycorrhizal symbiosis (2nd ed.). London: Academic Press.         [ Links ]

Sylvia, D. M. (1999). Mycorrhizal symbiosis. In D. M. Sylvia, J. J. Fuhrmann, P. G. Hatel, & D. A. Zuberer (Eds.), Principles and applications of soil microbiology (pp. 408-426). New Jersey, USA: Prentice Hall.         [ Links ]

StatSoft, Inc. (2007). STATISTICA (Data analysis software system). Version 7.0 para windows. USA.         [ Links ]

Torres, O., & Honrubia, M. (1991). Dinámica de crecimiento y caracterización de algunos hongos ectomicorrícicos en cultivo. Cryptogamie Mycologie, 12, 183-192.         [ Links ]

Vázquez-García, A., Santiago-Martínez, G., & Estrada-Torres, A. (2002). Influencia del pH en el crecimiento de quince cepas de hongos ectomicorrizógenos. Anales del Instituto de Biología, 73, 1-15. Obtenido de http://www.ejournal.unam.mx/bot/073-01/BOT73101.pdf.         [ Links ]