Morphogenic responses in the in vitro propagation of pecan (Carya illinoinensis [Wangenh] K. Koch)

Jazmín A. Ávila-Treviño¹; Jesús G. Arreola-Ávila^*1; José L. Rodríguez-de la O²; Ricardo Trejo-Calzada¹; David Valdez-Cepeda³; Amparo Borja-de la Rosa⁴

¹ Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas, Universidad Autónoma Chapingo. C. P. 35230. Bermejillo, Dgo. Correo-e:jgarreola@chapingo.uruza.edu.mx. Tel:872 77601900 (^*Autor para correspondencia).

² Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Chapingo, Texcoco, Estado de México.

⁴ División de Ciencias Forestales, Universidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Chapingo, Texcoco, Estado de México.

Recibido: 15 de septiembre, 2013
Aceptado: 28 de noviembre, 2013

Resumen

Las respuestas embriogénicas y organogénicas en nogal (Carya illinoinensis [Wangenh] K. Koch) se observaron bajo el cultivo in vitro de segmentos de hojas, yemas axilares y embriones cigóticos. El necrosamiento se controló empleando carbón activado (CA: 1 %), polivinilpirrolidona (0.1 %), nitrato de plata (AgNO₃: 1 %), ácido cítrico (150 mg·L^-1) y ácido ascórbico (100 mg·L¹), con presencia de luz y en oscuridad. Se utilizó el medio básico de Murashige y Skoog suplementado con 0.40 mg·L^-1 de tiamina, 100 mg·L^-1 de myo-inositol, 3 % de sacarosa, incorporando 2,4-D para hojas, tidiazurón (TDZ) para embriones, y las combinaciones de benciladenina (BA), kinetina (KIN), ácido naftalenacético (ANA) y ácido indolbutírico (AIB) para yemas axilares. El necrosamiento de tejidos se redujo en 75 % y 83 % adicionando CA y AgNO₃, respectivamente. El 33 % y 66 % de los callos embriogénicos se indujeron a partir de hojas, utilizando 1 y 3 mg·L^-1 de 2,4-D. La mayor producción de callos (58 %) a partir de embriones se obtuvo con la concentración de 3 mg·L^-1 de TDZ. En yemas axilares, la combinación de KIN (3.0 μM), BA (1.0 μM) y AIB (0.3 μM) incrementó el número de hojas y plántulas, y longitud de brotes.

Palabras clave: Explantes, callogénesis, antioxidantes, reguladores de crecimiento.

Abstract

Keywords: Explants, callogenesis, antioxidants, growth regulators.

INTRODUCCIÓN

El nogal pecanero (Carya illinoinensis [Wangenh] K. Koch) es una especie forestal cultivada, cuya importancia económica radica en la demanda de la nuez por el mercado de Estados Unidos y recientemente por el mercado asiático. Esta especie es originaria del norte de México, cuyas poblaciones de árboles silvestres se desarrollan principalmente en áreas con presencia de ríos o arroyos. Actualmente se han identificado materiales criollos de importancia biológica y comercial. Estas características se han tomado en cuenta en programas de mejoramiento llevados a cabo en otros países (Thompson & Grauke, 2012), incluyendo otras especies leñosas como Pinus pinaster Ait. (Álvarez, Majada, & Ordás, 2009). La especie C. illinoinensis es difícil de enraizar y los portainjertos utilizados en las huertas, cuya superficie es de 98,000 ha, provienen de semilla. La propagación sexual en esta especie es lenta y segrega individuos con variación fenotípica considerable, característica que limita la homogeneidad de los portainjertos utilizados en las plantaciones comerciales (Moore, Williams, Palma, & Lombardini, 2009). La reproducción in vitro constituye actualmente un excelente método potencial para la multiplicación clonal masiva en genotipos élite de nogal pecanero (Thompson & Grauke, 2012), incluyendo otras especies forestales (Lelu-Walter, Bernier-Cardou, & Klimaszewska, 2006; Percy, Klimaszwska, & Cyr, 2000). Existen estudios que describen protocolos de micropropagación de P. pinaster basados en organogénesis y embriogénesis somática, utilizando medios de cultivo que contienen tanto reguladores de crecimiento como antioxidantes (Álvarez et al., 2009). Varios antioxidantes se han aplicado en el medio de cultivo para disminuir el necrosamiento del tejido durante la etapa de iniciación de los explantes extraídos de especies leñosas (Aliyu, 2005; Nomura, Matsumoto, Masuda & Inoue, 1998; Poornima & Ravishankar, 2007; Vieitez, Vieitez et al., 2009. En la micro-propagación de nogal se han utilizado diferentes tipos de tejido de la planta (Rodríguez & Wetzstein, 1994), así como embriones somáticos (Long, Preece, & Sambeeck, 1995). El tipo de tejido, la edad de la planta, el tipo de reguladores de crecimiento, las sales adicionadas al medio, así como las condiciones durante el desarrollo del explante, son detalles que se han considerado en la micropropagación de especies leñosas (De la Viña, Barceló-Muñoz, & Pliego-Alfaro, 2001; Huang, Shaolin, Gaofeng, & Lanying, 2002; Labardi, Herry, Menabeni & Thorpe, 1995; Long et al., 1995). La creciente demanda de la nuez y la necesidad de una técnica efectiva de propagación masiva de materiales criollos de nogal con potencial productivo, incluyendo materiales nativos de importancia biológica para el uso en programas de mejoramiento genético, conducen al establecimiento de nuevas tecnologías de propagación. En la actualidad se generan nuevas tecnologías que prometen ser rentables en este ámbito, como el cultivo de tejidos in vitro (Long et al., 1995; Rugini & Muganu, 1998; Scaltsoyianes, Tsoulpha, Panetsos, & Moulalis, 1998; Valderrama, Chico, Tejada, & Vega, 2008). El presente estudio se llevó a cabo con el objetivo de evaluar las respuestas morfogénicas de explantes de nogal pecanero, provenientes de hojas, yemas y embriones, desarrollados en medio de cultivo adicionado con diferentes tipos y concentraciones de antioxidantes, reguladores de crecimiento y condiciones de luz.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fuente de explantes y condiciones de cultivo

El presente estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco, Estado de México. Se utilizaron plantas de nogal pecanero de un año de edad, germinadas en maceta en la Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas en Bermejillo, Durango. Las plantas fueron trasladadas a la Universidad Autónoma Chapingo cuando tenían una altura de 25 cm. En este sitio fueron acondicionadas en el invernadero por 21 días y regadas semanalmente con una solución de fungicida (Captan^®) al 2 %. Transcurrido este periodo, los explantes fueron extraídos de yemas, hojas y embriones de semillas. Las yemas axilares y las hojas fueron seleccionadas de la parte basal, media y terminal de las plantas. Previo a la extracción de los embriones, las semillas se estratificaron durante 24 h en una solución de agua oxigenada y destilada. Los explantes de hojas, yemas y embriones se colocaron en una solución de detergente Foca más surfactante Tween 80 (Thermo Scientific, USA) por 2 min. Posteriormente, los explantes se colocaron en alcohol al 70 % durante 3 min y, finalmente, en hipoclorito de sodio al 10 % por 15 min. Los tejidos se mantuvieron por 24 h en una solución de ácido ascórbico (100 mg·L^-1) más ácido cítrico (150 mg·L^-1) disueltos en 100 mL de agua destilada, aforada a 1 L. En el presente estudio se condujeron cuatro experimentos para evaluar las respuestas morfogénicas durante la propagación in vitro de nogal.

Evaluación de antioxidantes

Organogénesis en explantes de hojas

Para el estudio de organogénesis en hojas se utilizaron 1, 3 y 10 mg·L^-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) como tratamientos, los cuales se adicionaron al medio de cultivo MS, mismo que se suplementó con 0.4 mg·L^-1 de tiamina, 100 mg·L^-1 de myo-inositol, 3 % de sacarosa y 7.5 g·L^-1 de agaragar a un pH de 5.7 ± 0.1. Segmentos foliares de 1 cm², seleccionados de la parte basal, media y terminal de la planta, fueron sembrados en forma abaxial en frascos tipo Gerber^® conteniendo el medio de cultivo. Las muestras se mantuvieron en oscuridad permanente a una temperatura de 25 ± 1 °C, durante cuatro semanas. Los tratamientos se aplicaron considerando un diseño completamente al azar con doce repeticiones. La variable cuantitativa encallamiento, expresada como peso fresco, fue evaluada mediante análisis de varianza utilizando el paquete estadístico Minitab versión 15 (2009) y efectuando una comparación de medias entre tratamientos con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). La variable estructura de callo fue evaluada cualitativamente; de acuerdo con su característica física se asignaron tres valores: 0 (sin respuesta), 1 (estructura compacta) y 2 (estructura friable). La variable color de callo se midió con la siguiente escala: 1) blanco, 2) rosa y 3) café.

Organogénesis en explantes de yemas

Se usaron yemas axilares de 1 cm de longitud obtenidas de la porción basal, media y apical de la planta. Las yemas se sembraron en tubos Erlenmeyer que contenían medio de cultivo MS suplementado con 0.4 mg·L^-1 de tiamina, 100 mg·L^-1 de myo-inositol, 3 % de sacarosa, 7.5 g·L^-1 de agar-agar, a un pH de 5.7. Se establecieron dos tratamientos con auxinas y citocininas en diferentes combinaciones y concentraciones agregadas al medio de cultivo (Cuadro 2). Las muestras se incubaron durante 12 semanas bajo un periodo de luz/oscuridad (18:6), a una temperatura de 25 ± 1 ºC. Las variables número de brotes, número de hojas y longitud de la planta fueron evaluadas. Los datos se sometieron a un análisis de varianza con el paquete estadístico PASW versión 18 (2009). Se utilizo un diseño experimental completamente al azar con doce repeticiones y se hizo comparación de medias entre tratamientos con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

Callogénesis en explantes de embrión

En este experimento se establecieron los tratamientos de tidiazurón (TDZ) en cantidades de 1, 3 y 10 mg·L^-1 adicionados al medio de cultivo MS, suplementado con 0.4 mg·L^-1 de tiamina, 100 mg·L^-1 de myo-inositol, 3 % de sacarosa, 7.5 g·L^-1 de agar-agar, a un pH de 5.7 ± 0.1. Los embriones extraídos de las nueces maduras, previamente tratadas con agua destilada, fueron sembrados en frascos Erlenmeyer que contenían medio de cultivo. Doce muestras de cada tratamiento se incubaron en condiciones de oscuridad, a 25 ± 1 ºC, durante 12 semanas. Se evaluaron las variables peso fresco de callo, grado de encallamiento desarrollado, así como estructura y color. La variable grado de encallamiento se midió de acuerdo con la siguiente escala numérica: 1) desarrollo de callo con volumen ≤ 30 %; 2) desarrollo calloso con volumen > 30 % y < 60 %; 3) desarrollo de callo con volumen > 60 %. Los grados de encallamiento establecidos se definieron a partir de la referencia visual, considerando que el mayor volumen de encallamiento correspondió a 100 %. El tipo de estructura de callos (compacta y friable) se caracterizó visualmente, así como el color de los mismos (blanco, amarillo y café). Se consideró un diseño experimental completamente al azar, con doce repeticiones. La variable grado de encallamiento se sometió a un análisis de varianza con el paquete estadístico Minitab versión 15 (2009). La comparación de medias entre tratamientos se hizo mediante una prueba de Tukey (P ≤ 0.05) con el paquete estadístico PASW versión 18 (2009).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación de antioxidantes

Respecto a la condición de luz-obscuridad, no se observó efecto significativo (P ≤ 0.05) sobre el necrosamiento de los explantes desarrollados. Por lo anterior, se induce que cualquier condición ambiental durante la iniciación de explantes en C. illinoinensis puede ser adecuada. No obstante, parece ser que la ausencia de luz durante esta etapa es más conveniente, según lo señala el estudio llevado a cabo en Anacardium occidentale L. por Aliyu (2005), quien obtuvo brotes de explantes desarrollados en un medio de cultivo con CA, en condición de oscuridad. Mulwa y Bhalla (2006) obtuvieron resultados similares durante la iniciación de explantes de cotiledones de macadamia en condiciones de oscuridad. En aguacate, el incremento de radiación no tuvo efecto sobre la brotación de explantes (De la Viña et al., 2001). Por otra parte, Lelu-Walter et al. (2006) observaron desarrollo de epicotilos largos y en buen estado en embriones de P. pinaster desarrollados sin luz, lo cual no sucedió en los embriones iniciados en presencia de luz, cuyos epicotilos estresados mostraron un color rojo necrosado, causado posiblemente por la síntesis de antocianinas. La condición ambiental relacionada con la radiación o su régimen con oscuridad parece no ser factor limitante, según las observaciones efectuadas en el presente estudio.

Organogénesis en explantes de hojas

Las concentraciones de 1 y 3 mg·L^-1 de 2,4-D indujeron el mayor peso fresco de callos desarrollados en los explantes a las 12 semanas de iniciado el cultivo (Figura 2). Estas concentraciones agregadas al medio de cultivo incrementaron dos y tres veces más la presencia de callo en los explantes, en relación con la concentración de 10 mg·L^-1 (Figura 3). La posición del tallo de la cual se extrajeron las hojas no tuvo efecto sobre la producción de biomasa producida por los ex-plantes. Esto significa que las hojas ubicadas en la porción basal, media o apical tienen la misma capacidad organogénica. La respuesta en el incremento de callo a bajas concentraciones de 2,4-D difiere con lo reportado por Huang et al. (2002), quienes observaron mayor producción callogénica en explantes de hojas jóvenes de Citrus grandis en medio que contenía 0.9 y 4.5 mM de 2,4-D. Salvi, Singh, Tivarekar, y Eapen (2001) indujeron brotes en explantes de hojas jóvenes de neem, desarrollados en medio con benciladenina y ácido indolacético. Estos resultados indican que en la regeneración de explantes de especies leñosas, el medio de cultivo y las cantidades apropiadas de sus componentes es importante, como lo es también la edad del tejido seleccionado. No obstante, en el presente estudio, la posición de la hoja en el tallo no marcó diferencia por tratarse de plantas jóvenes de cuatro meses de edad. Los tratamientos tuvieron un efecto significativo (P ≤ 0.01) sobre el tipo de estructura y color del callo. Las concentraciones de 1 y 3 mg·L^-1 de 2,4-D indujeron una estructura friable (Figura 3). Este tipo de estructura fue encontrada por Kryvenki, Kosky, Guerrero, Domínguez, y Reyes (2008), quienes obtuvieron callos friables de tipo globular, cultivados en un medio con 2.26 μM de 2,4-D bajo condiciones de oscuridad. Los callos presentaron colores blanco, rosa y café (Figura 3), aunque se observó mayor secuencia de callos color blanco. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Kryvenki et al. (2008) al obtener callos de los mismos colores. Tavakkol, Angoshtari y KalantariI (2011), al evaluar los efectos de los reguladores del crecimiento sobre el color de callo, encontraron que las auxinas tenían un efecto inhibidor sobre la formación de la clorofila. Estos autores agregan que en ausencia de luz y con ausencia de pigmentos clorofílicos, distintos colores pueden surgir debido a la manifestación de otro tipo de pigmento, como lo observado en este estudio.

Organogénesis en explantes de yemas

La respuesta organogénica de explantes de yemas fue afectada por el tipo y concentración de auxinas y citocininas en el medio de cultivo. La combinación de kinetina (KIN), benciladenina (BA) y ácido indolbutírico (AIB) indujo mayor número de brotes y hojas, así como mayor crecimiento de plántulas, en comparación con la adición de KIN, BA y ácido naftalenacético (ANA) (Figura 4). Los efectos de BA y AIB en explantes de Juglans regia, procedentes de árboles élite, también han sido observados por Scaltsoyiannes, Tsoulpha, Panestos, y Moulalis (1998). Los autores reportan un incremento de brotes laterales desarrollados en explantes iniciados en medio de cultivo, adicionando BA (4.4 µM) en combinación con AIB (0.005 µM). Ollero, Muñoz, Segura y Arrillaga (2010) observaron, en Nerium olander L., la presencia de brotes axilares en explantes de yemas desarrollados en medio de cultivo, agregando una combinación de BA y potasio. Por su parte, Uribe y Cifuentes (2004) desarrollaron plántulas de Legrandia concinna a partir de explantes de yemas axilares, desarrollados en un medio con la combinación hormonal de 0.1 y 0.5 mg·L^-1 de AIB y BA, respectivamente. En el presente estudio se ha evidenciado el efecto de la combinación de auxinas y citocininas en diferentes concentraciones en el medio de cultivo, sobre la iniciación de explantes de yemas. Cuando estas hormonas se han aplicado de manera separada, la respuesta de explantes tratados también ha sido positiva (Hang et al., 2002; Labardi et al., 1995; Rugini & Muganu, 1998). Basado en esta evidencia, se asume que la respuesta potencial de un explante puede estar asociada a su edad, así como a la naturaleza, la concentración, la combinación o la acción por separado de la hormona.

Figura 5

Callogénesis en explantes de embrión

El desarrollo de callos en explantes de embriones fue afectado por la concentración de TDZ en el medio de cultivo. La mejor respuesta callogénica expresada en peso fresco fue inducida por la concentración de 3 mg·L^-1de TDZ (Figura 6). El nivel de callosidad producida por el embrión bajo esta concentración fue mayor de 60 %, observándose esta biomasa en el 58 % de los explantes. Una menor respuesta se observó en explantes desarrollados en el medio con 1 y 10 mg·L^-1 de TDZ. En la embriogénesis somática, la germinación incrementa con la presencia y concentración de citocininas de diferente tipo en el medio. La efectividad de las citocininas para promover organogénesis de embriones y cotiledones se ha documentado en especies como P. pinaster (Humanez, Blasco, Brisa, Segura, & Arrillaga, 2011) y Cupressus sempervrens (Labardi et al., 1995). El desarrollo embriogénico también ha sido favorecido con la adición de auxinas en el medio de cultivo en especies como J. regia (Long et al., 1995) y C. illinoinensis (Rodríguez & Wetzstein, 1994), cuya formación de callos incrementa al aumentar la concentración de ANA y 2,4-D. Las concentraciones de 1 y 10 mg·L^-1 de TDZ en el medio indujeron estructura callogénica compacta que sólo mostraron estructuras pre-embrionarias de tipo globular, mientras que la concentracion de 3 mg·L^-1 de TDZ indujo una estructura friable mostrando actividad embriogénica de tipo nodular, torpedo y corazón (Figura 7). Valderrama et al. (2008) observaron que los callos de tipo compacto de Fragaria virginiana no indujeron desarrollo embriogénico. Los autores agregan que el callo de tipo friable es blando y tiene alta capacidad de regeneración, la cual es fundamental para iniciar la suspensión embriogénica. En el presente trabajo, el color amarillo predominó en callos desarrollados en concentraciones de 3 y 10 mg·L^-1 de TDZ en el medio, mientras que la concentración de 1 mg·L^-1 de TDZ indujo una mayor secuencia de callos color blanco. Según Valderrama et al. (2008), el color del callo tiene relación con el tipo del explante o con la iniciación embriogénica.

Los antioxidantes carbón activado (1 %) y AgNO₃ (1 %) redujeron el necrosamiento en los explantes de hojas y yemas. El factor luz no tuvo efecto sobre esta variable. La mayor producción callogénica en explantes de hojas se obtuvo con la adición al medio de 2,4-D en concentraciones de 1 y 3 mg·L^-1. Se observó mayor presencia de callos con estructura friable y de color blanco; sólo fueron obtenidos callos de tipo globular. La mayor respuesta callogénica en embriones se obtuvo en el medio que contenía 3 mg·L^-1 de TDZ, encontrando presencia de callos con estructura friable de tipo globular, torpedo y corazón; no obstante, los callos con estructura compacta predominaron. La combinación de auxinas y citocininas (KIN [3.0 μM], BA [1.0 μM], AIB [0.3 μM]) indujeron mayor número de brotes, número de hojas y mayor longitud de brotes.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada para realizar estudios de Maestría en Ciencias a través del Programa Nacional de Posgrados de Calidad.

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