Identification of lanosterol derivates from the cultivated fungus Pisolithus arhizus (Scop.) Rauschert
Olivia Márquez-Fernández1; Eloy Herrera2; Olaya Castellanos-Onorio1; Arturo Estrada-Torres3; Ángel Trigos1*.
1 Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, Universidad Veracruzana. Calle Médicos 5, Col. Unidad del Bosque. C. P. 91010. Xalapa, Veracruz. Correo-e: atrigos@uv.mx (Autor para correspondencia).
2 Escuela de Biología-Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edificio 76, Cd. Universitaria, Av. San Claudio s/n. C. P. 72579. San Manuel, Puebla, Puebla.
3 Laboratorio de Biodiversidad, Centro de Investigación en Ciencias Biológicas-Universidad Autónoma de Tlaxcala. km 10.5 Autopista San Martín Texmelucan-Tlaxcala. C. P. 90122. Ixtacuixtla, Tlax.
]]>Recibido: 03 de octubre de 2012
Aceptado: 27 de junio de 2013
RESUMEN
Los hongos micorrizógenos se encuentran en asociación con las raíces de muchas plantas, incluyendo casi todas las especies de árboles como la familia Pinaceae. Algunos derivados triterpénicos de lanosterol se han aislado tanto del micelio como de los cuerpos fructíferos del hongo ectomicorrizógeno Pisolithus arhizus. En el presente trabajo, se cultivó una cepa de la especie P. arhizus, aislada de bosques de pino en Oaxaca en condiciones de laboratorio, con el fin de determinar qué tipo de compuestos se pueden encontrar en una cepa mexicana cultivada bajo condiciones asimbióticas y sus posibles implicaciones ecológicas. Los resultados confirman que, en la fermentación líquida in vitro del micelio, la cepa aislada de los bosques de México presenta el mismo tipo de triterpenos sin funcionalidad con el carbono-23 como otras cepas procedentes de bosques de Europa y Brasil, a pesar de que se utilizó un medio de cultivo PDA en lugar del medio de cultivo Melin-Norkrans.
Palabras clave: 22-R-lanostan-8, 24(28)-dien-3b-22-diol; 22-R-lanostan-28-metil-8, 24(28)-dien-3b-22-diol; pisolactona; 25-metil pisolactona; micelio.
ABSTRACT
Mycorrhizal fungi can be found in association with the roots of many plants, including almost all tree species such as the Pinaceae family. Some triterpene derivatives of lanosterol have been isolated both in the mycelium as well as in the fruiting bodies of the ectomycorrhizal fungus Pisolithus arhizus. In order to determine, what type of compounds can be found as well as any possible ecological implications involved in the case of a Mexican strain cultivated under asymbiotic conditions in the present research work, a strain isolated from P. arhizus from pine woods from Oaxaca was grown under laboratory conditions. These results confirm that the strain isolated from the forests of Mexico presents the same type of triterpenes unfunctionalized at carbon-23 in the in vitro liquid fermentation of mycelium, like other strains from forests in Europe and Brazil, despite the fact that they we used a PDA medium culture instead of a half Melin-Norkrans medium culture.
]]> Keywords: 22-R-lanostan-8,24(28)-dien-3β-22-diol; 22-R-lanostan-28-methyl-8,24(28)-dien-3β-22-diol; pisolactone; 25-methyl pisolactone; mycelium.
INTRODUCCIÓN
La simbiosis micorrizógena se produce con un gran número de plantas y aproximadamente 5,000 especies de hongos, en su mayoría ascomicetos y basidiomicetos. Este tipo de simbiosis se considera casi obligada tanto para el árbol como para el hongo en algunas especies, y desempeña un papel esencial en el ciclo de nutrientes y el funcionamiento de los ecosistemas (Brundett, 1991; Estrada-Torres & Santiago-Martínez, 2003; Santiago-Martínez, Varela, & Estrada-Torres, 1993; Smith & Read, 1997). El basidiomiceto Pisolithus arhizus (Scop.) Rauschert es un hongo ectomicorrizógeno que ha sido inoculado con éxito en plantas forestales en países de los cinco continentes. Este hongo puede establecer la simbiosis con más de 20 géneros de gimnospermas y angiospermas distribuidas en todo el mundo (Cairney & Chambers, 1997), incluyendo especies forestales de las familias Casuarinaceae, Dipterocarpaceae, Pinaceae y Myrtaceae (García-Rodríguez, Pérez-Moreno, Aldrete, Cetina-Alcalá, & Vaquera-Huerta, 2006; Pérez-Moreno & Read, 2004). Se sabe que los procesos fisiológicos que se requieren para establecer las ectomicorrizas, dependen en gran medida de la elaboración de las hormonas o metabolitos secundarios por ambos simbiontes, del mismo modo la comunicación química entre las asociaciones, raíz-hongo y la raíz-raíz, están mediados por estos compuestos (Dahm y Goliñska, 2011). Los compuestos de las raíces y los hongos juegan un papel importante en la fase presimbiotica principalmente mediante la modificación del tropismo de hifas de las raíces, lo que facilita la fijación y la invasión de los tejidos del huésped por hifas, la inducción de cambios morfológicos y fisiológicos en las raíces y el micelio y en el mantenimiento de la asociación micorrícica (Dahm & Goliñska, 2011).
Sin embargo, estos mecanismos químicos aún no están totalmente entendidos. Se ha indicado que hay incluso una transferencia de componentes entre diferentes especies de hongos y plantas (Pérez-Moreno & Read, 2004). Por otra parte, se ha reportado la existencia de diferencias en el patrón de metabolitos, dependiendo del medio de cultivo y la tasa de crecimiento, ya sea in vitro o como micorrizas (Baumert, Schumann, Porzel, Schmidt, & Strack, 1997). Con respecto a esta especie, algunos derivados triterpénicos de lanosterol se han aislado tanto en el micelio, como en los cuerpos fructíferos. Sin embargo, se han encontrado diferencias cuantitativas y cualitativas en estos compuestos, ya que se cree que están involucrados en los mecanismos de colonización de las raíces de la planta (Baumert et al., 1997). Con el objetivo de identificar el tipo de compuestos que se pueden encontrar en una cepa mexicana cultivada en condiciones asimbiótica, y su posible implicación en el proceso de colonización de las raíces en el caso de esta micorriza, se aisló una cepa Pisolithus arhizus de bosques de pino en Oaxaca, se cultivó en condiciones de laboratorio. Los resultados confirmaron la presencia en el micelio de cuatro triterpenos menos oxidados, como se reportó anteriormente por De Abreu, Lobo, y Prabhakar (1991) and Baumert et al. (1997).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material fúngico
La cepa fue aislada de los bosques de pinos de las regiones de Oaxaca y se depositó en la colección de cepas de hongos micorrizógenos en la Universidad de Tlaxcala. Se mantuvo en agar de dextrosa de patata a 25 °C. Se inocularon discos de agar colonizados con P. arhizus micelio en matraces que contenían 300 mL de medio líquido de patata-dextrosa y se incubaron durante 15 días a 25 °C.
Extracción y separación
]]> El proceso para la obtención de los compuestos se realizó de acuerdo a Trigos, Reyna, y Matamoros (1995). El medio de cultivo de micelio se eliminó por filtración y se sometió a un baño de ultrasonido, posteriormente, el micelio se eliminó y se extrajo con acetato de etilo (5X), las extracciones se llevaron a sequedad bajo presión reducida. Del extracto total a través de una simple cristalización y posterior recristalización con hexano y acetona, se separó un sólido cristalino de color blanco que fue nombrado compuesto 1. El resto del extracto se separó por cromatografía en columna (Sistemas y Equipos de Vidrio, Puebla, México) utilizando gel de sílice Merck 60 (malla de 230-400) como la fase estacionaria y hexano-acetato de etilo con un gradiente ascendente de polaridad como eluyente. Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas por cromatografía en capa fina (gel de sílice 60 F254) y eluidas con acetato de etilo-hexano 9:1 y reveladas con luz ultravioleta y vapores de yodo. A partir de las fracciones eluidas con 09:01 y 08:02 acetato de etilo-hexano, se obtuvo una mezcla de compuestos que se separaron por cromatografía de columna, obteniéndose en orden de polaridad ascendente los compuestos 2, 3 y 4.Caracterización estructural
Los puntos de fusión se determinaron con un aparato Fisher-Johns (Cole Parmer [12-144], EE.UU.) y no están corregidos. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN 1H) se obtuvieron con la ayuda de un instrumento Gemini Varian 200 (EE. UU.)
1 ) 22-R-lanostan-8, 24(28)-dien-3β, 22-diol. Agujas blancas, mp. 170-178 °C, Rf 0.4 (acetato de etilo-hexano 8:2). RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ, ppm: 4.85 (d, 2H, H-28), δ 3.81 (m, 1H, H-22), δ 3.23 (dd, 1H, H-3), δ 1.07 (d, 3H, H-27), δ 1.04 (d, 3H, H-26), δ 1.01 (s, 3H, H-31), δ 0.99 (s, 3H, H-19), δ 0.92 (d, 3H, H-21), δ 0.91 (s, 3H, H-29), δ 0.82 (s, 3H, H-30), 0.71 (s, 3H, H-18).
2 ) 22-R-lanostan-28-metil-8, 24(28)-dien-3β, 22-diol. Agujas blancas, mp 172-180 °C, Rf 0.81 (acetato de etilo-hexano 8:2). RMN 1H (200 MHz, CDCb) δ, ppm: 5.25 (q, 1H, H-28), δ 3.78 (t, 1H, H-22), δ 3.24 (dd, 1H, H-3), 2.85 (m, 1H, H-25), 1.65 (s, 3H, H-32), δ1.01 (d, 3H, H-26), δ 1.01 (d,3H, H-27), δ 0.99 (s, 3H, H-19), δ 0.92 (d, 3H, H-31), d 0.91 (s, 3H, H-21), d 0.82 (s, 3H, H-30), 0.71 (s, 3H, H-18).
3 ) 22-S-24 metil-lanostan-8-en-22,24'-epoxi-3β-ol-24 'one (pi-solactona). Agujas blancas, mp 268-273 °C, Rf 0.78 (acetato de etilo-hexano 8:2). RMN »H (200 MHz, CDC13) d, ppm: 4.48 (m, 1H, H-22), 3.24 (dd, 3H, ,H-3), 2.60 (m, IH, H-24), 2.20 (m, IH, H-25), 1.05 (s, 3H, H-26), 1.00 (d, 3H, H-28), 0.98 (s, 3H, H-19), 0.96 (d, 3H, H-21), 0.91 (d, 3H, H-27), 0.90 (s, 3H, H-30), 0.81 (s, 3H, H-29), 0.71 (s, 3H, H-18).
4 ) 22-S-24, 25-dimetil-lanostan-8-en-22, 24'-epoxi-3β-ol-24-one (25-metil-pisolactona). Agujas blancas, mp. 311-317 °Q Rf 0.75 (acetato de etilo-hexano 8:2). RMN 1H (200 MHz, CDC13) δ, ppm: 4.45 (m, 1H, H-22), 3.24 (dd, 3H, H-3), 2.45 (m, 1H, H-24), 1.07 (s, 3H, H-26), 1.07 (s, 3H, H-27), 1.07 (s, 3H, H-31), 1.01 (d, 3H, H-28), 0.98 (s, 3H, H-19), 0.95 (d, 3H, H-21), 0.86 (s, 3H, H-29), 0.72 (s, 3H, H-18).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La extracción de acetato de etilo del micelio de P. arhizus (11.3 g), seguido por la cromatografía del residuo orgánico, permitió el aislamiento de cuatro derivados triterpénicos de lanosterol (1-4), que estaban presentes en pequeñas cantidades. Los compuestos mostraron ser: 1) 22-R-lanostan-8, 24 (28)-dien-3 b, 22-diol, 2) 22-R-lanostan-28 metil-8, 24 (28)-dien-3 b, 22-diol, 3) pisolactona y 4) 25-metiol-pisolactona (Figura 1), en comparación con muestras auténticas y sus datos espectrales (Baumert et al., 1997; De Abreu et al., 1991; Lobo, De Abreu, Prabhakar, Godinho, & Williams, 1983; Lobo et al., 1988).
]]> Los espectros RMN 1H de los compuestos 1 y 2 difieren principalmente en el grupo metileno exocíclico H-28. Estos protones se observan como una doble señal (δ 4,85, J = 2,4 Hz) en el 1, y como una señal cuádruple (δ 5.26, J = 6,6 Hz) en el 2. Mientras, en los espectros de ambos compuestos, hay cinco señales simples, que integran para tres protones cada una, que corresponden a H-18, H-19, H-29, H-30 y H-31 (δ 0,71, 0,99, 1,01, 0,81 y 0,91, respectivamente). Además, dos señales dobles en δ 3,23 (3,22) y 3,82 (3,79) corresponden a los dos grupos hidroxilo germinales H-3 y H-22. Una señal doble a δ 0,92 (0,91), J = 6,6 Hz, se asignó a los protones del metilo H-21 y dos señales dobles a δ 1,04 (1,01) y 1,07 (1,02), J = 6,8 Hz, que integraron para tres protones cada una, se asignaron a H-26 y H-27. Con estos datos y de acuerdo con la literatura, los compuestos 1 y 2 fueron identificados como 22-R-lanostan-8, 24 (28)-dien-3β, 22-diol y 22-R-lanostan-28-metil-8,24(28)-dien-3β, 22-diol, respectivamente (Baumert et al., 1997; Zamuner, Cortez, Dias-Filho, Lima, & Rodrigues-Filho, 2005).En los espectros de RMN 1H de los compuestos 3 y 4, destacan una señal múltiple a δ 4.48 (4.45) debido a H-22, una señal doble en δ 3.24, J = 11.4, 4.5 Hz que corresponde a H-3 y cinco señales simples integradas en tres protones cada una, fijadas a H-18, H-19, H-28, H-29, H-30 (d 0.71,0.98,1.0,0.81 y 0.9, respectivamente). Sin embargo, el espectro 1H NMR del compuesto 4 muestra una señal adicional a 1,08 (3H, s) que corresponde a metilo H-31 y la señal doble asignada a H-21 (δ 0.95, 3H, s) aparece ligeramente desplazada. Estos compuestos fueron asignados como 22-S-24-metil-lanostan-8-en-22, 24'-epoxi-3-ol-24bna (pisolactona) y 22-S-24, 25-dimetil-8-lanostan en-22, 24'-epoxi-3-ol-24bna (25-metil-pisolactona) de acuerdo con sus datos espectrales con respecto a las referencias consultadas (Baumert et al., 1997; Lobo et al., 1983). Baumert et al. (1997) reportaron la presencia de triterpenos sin funcionalidad en el carbono-23, igual a los reportados en este trabajo, a partir del cultivo superficial del micelio, cultivo en suspensión y micorriza, difiriendo sólo en su concentración, obteneindo una mayor proporción de los triterpenos 2 y 4, cuando precedieron de la asociación micorrícica que en cultivo in vitro (Zamuner et al, 2005).
Por otro lado, los derivados de lanosterol aislados en los cuerpos fructíferos de esta especie muestran pequeñas diferencias sutiles de las que se encuentran en el micelio (Tabla 1), tal como 24-metil y 24-etil-lanostan-8, 24 (28)-dien-3,22,23-triol-22-acetat (Lobo, De Abreu, Prabhakar, & Godinho, 1985; Zamuner et al., 2005), pisosterol, pisosterol acetato (Gill, Kiefe, Skelton, & White, 1989; Zamuner et al., 2005), 3-oxo-pisolactona (De Abreu et al., 1991; Lobo et al., 1988), epi-pisosterol y pisosteral (Zamuner et al., 2005. Algunos autores distinguen estas diferencias en el carbono-23 y proponen que los derivados de lanosterol menos oxidados participan en los procesos de fijación y la formación de micorrizas (Baumert et al., 1997; Zamuner et al., 2005). También se sabe que, incluso en la misma especie, los aislados de micorrizas de diferentes fuentes muestran variaciones morfológicas y causan efectos diferenciales en el crecimiento de las planta cuando se utiliza como inoculantes (Castellano y Molina, 1989), lo cual podría estar mediado por metabolitos secundarios, no obstante, es necesario confirmar esto con más estudios sobre las micorrizas de P. arhizus in vivo, debido a las limitaciones de las condiciones de cultivo asimbiótica de este tipo de investigación. Además, es interesante observar que algunos de los compuestos o extractos mencionados anteriormente a partir de especies de Pisolithus exhiben actividad antibiótica y antifúngica (Ameri, Ghadge, Vaidya, & Deokule, 2011; Tsantrizos, Kope, Fortin, & Ogilvie, 1991) y se ha reportado que pisosterol ha mostrado actividad citotóxica (Montenegro et al., 2004).
CONCLUSIONES
Finalmente, los resultados confirman que la cepa aislada de los bosques de México presenta el mismo tipo de triterpenos sin funcionalidad en el carbono-23 en micelio obtenido a través de fermentación líquida in vitro, al igual que otras cepas de bosques en Europa y Brasil, a pesar del hecho de que se utilizó un medio de cultivo PDA en lugar de un medio de cultivo Melin-Norkrans. La pruebas indican la hipótesis de que los triterpenos de micelios sin funcionalidad con el carbono-23 están probablemente involucrados en los procesos de fijación y formación de micorrizas.
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