Insecticidal activity of essential oils from two Eucalyptus species on Rhyzopertha dominica (coleoptera: bostrichidae) and its effects on digestive enzymes of progenies
Ramiro Reyes-Guzmán1, Jesús Borboa-Flores1*, Francisco J. Cinco-Moroyoqui1, Ema C. Rosas-Burgos1, Pablo S. Osuna-Amarillas1, Francisco J. Wong-Corral1, María M. Ortega-Nieblas2, Juan D. D. León-Lara3
1 Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos.
2 Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas.
3 Departamento de Ingeniería Industrial, Universidad de Sonora. Blvd. Luis Encinas y Rosales s/n, col. Centro. C. P. 83000. Hermosillo, Sonora, México. Correo-e: jborboa@guayacan.uson.mx (*Autor para correspondencia).
]]>Recibido: 10 de marzo de 2012
Aceptado: 17 de agosto de 2012
RESUMEN
La fracción volátil de los aceites esenciales de Eucalyptus globulus y Eucalyptus camaldulensis se utilizaron para evaluar su actividad insecticida sobre el barrenador menor de los granos Rhyzopertha dominica (F.). Muestras de granos de trigo fueron infestadas con el insecto y expuestas a los vapores de diferentes volúmenes (5, 10 y 15 µL) de los aceites por diferentes periodos (24, 48 y 72 h). La actividad enzimática amilolítica y proteolítica se determinaron en las progenies (F1) que emergieron de los granos. Ambos aceites ocasionaron una estimulación en la actividad enzimática amilolítica y proteolítica de las progenies; sin embargo, solamente E. globulus ocasionó la muerte de éstas (P < 0.05). Al incrementar el volumen de aceite de E. camadulensis, la actividad proteolítica del insecto aumentó, incluso al mayor tiempo de exposición. Los resultados de este estudio muestran que la fracción volátil de los aceites esenciales de eucalipto, especialmente la de E. globulus, es un agente insecticida efectivo para el control de R. dominica en trigo almacenado.
Palabras Clave: Eucaliptos, mortalidad, barrenador menor de los granos, amilólisis, proteólisis, trigo.
ABSTRACT
The volatile fraction of essential oils from Eucalyptus globulus and Eucalyptus camaldulensis was used to evaluate their effective insecticidal toxicity against the lesser grain borer Rhyzopertha dominica (F.). Wheat grain samples were infested with the beetle and exposed to the vapors of different volumes (5, 10 and 15 µL) of the essential oils for different periods (24, 48 and 72 h). Emerging adults from each wheat sample were counted and analyzed in terms of amylolytic and proteolytic activity. Both essential oils were effective at promoting high amylolytic and proteolytic activity in emerged progenies, but only E. globulus caused lethal effects on the progenies (P < 0.05). By increasing the volume of E. camadulensis oil, the proteolytic activity of the insect increased, even at longest exposure time. The results of this study show that the volatile fraction of the essential oils from eucalyptus, especially E. globulus, is an effective insecticidal agent for controlling R. dominica in stored wheat.
]]> Keywords: Eucalyptus, mortality, lesser grain borer, amylolysis, proteolysis, wheat.
INTRODUCCIÓN
El insecto Rhyzopertha dominica es una de las especies más destructoras y con mayor abundancia y distribución en grano de trigo almacenado (Cuperus, Prickett, Bloome, & Pits, 1986). Los insectos que infestan al grano de trigo durante su almacenamiento poseen un sistema enzimático muy eficiente que les permite alimentarse exitosamente causando grandes pérdidas económicas. En el caso de R. dominica, el insecto posee varias isoamilasas que hidrolizan eficientemente el almidón del grano de trigo (Cinco-Moroyoqui et al., 2008; Cinco-Moroyoqui, Rosas-Burgos, Borboa-Flores, & Cortez-Rocha, 2006), así como varias enzimas del tipo serina proteasas (Zhu & Baker, 1999). Diversos estudios han demostrado que la presencia de inhibidores en la dieta de los insectos los induce a producir enzimas más resistentes como un mecanismo de adaptación para contrarrestar el efecto de los inhibidores (Oppert, Morgan, Hartzer, & Kramer, 2005).
Durante las últimas décadas, las medidas de control sobre las plagas que atacan los granos almacenados están limitadas al empleo de productos químicos líquidos o gaseosos, que resultan peligrosos para la salud de los animales y el ambiente (Isman, 2000). El control de R. dominica generalmente se lleva a cabo con pesticidas como fosfina (Schlipalius, Cheng, Reilly, Collins, & Ebert, 2002), con el cual el insecto presenta resistencia como resultado de una adaptación genética para contrarrestar su efecto letal (Rajendran & Gunasekaran, 2002). Los métodos alternativos para reducir la infestación de R. dominica han incluido el uso de tierras diatomáceas (Vardeman, Arthur, Nechols, & Campbell, 2006), formato de etilo en combinación con dióxido de carbono (Haritos, Damcevski, & Dojchinov, 2006), spinosad (Daglish & Nayak, 2006), así como la producción de variedades de trigo resistentes (Watts & Dunkel, 2003).
El empleo incorrecto e indiscriminado de biocidas ha propiciado el desarrollo de especies de insectos resistentes (Tyler, Taylor, & Rees, 1983). Para resolver estos problemas, se han llevado a cabo numerosos estudios utilizando compuestos naturales como los aceites esenciales de eucaliptos, en cuya composición se encuentran sustancias volátiles aromáticas (Zhang, An, Wu, Stanton, & Lemerle, 2010). Se ha encontrado que los compuestos fenólicos presentes en los aceites esenciales interaccio-nan con grupos químicos de enzimas a través de puentes de hidrógeno o interacciones hidrofóbicas aumentando su actividad antibacteriana (Ouattara, Simard, Holley, Piette, & Bégin, 1997). En este contexto, los objetivos de este trabajo fueron evaluar el efecto insecticida de la fracción volátil de los aceites esenciales de Eucalyptus camaldulensis (Dehnh) y Eucalyptus globulus (Labill) en el control de R. dominica en trigo almacenado, así como evaluar el efecto de dichos aceites en la actividad amilo-lítica y proteolítica de las progenies del insecto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materia prima
Los aceites esenciales evaluados en este estudio fueron obtenidos de E. camaldulensis y E. globulus. El primero fue obtenido de hojas de eucalipto colectadas en la primavera de 2011 en un sitio ubicado en las coordenadas geográficas 29° 00' 44'' LN y 111° 08' 02'' LE. La identificación de E. camaldulensis se hizo en el herbario del Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora (Voucher 2011225; catálogo del herbario 17277) (McClintock, 1993). El aceite esencial de E. globulus (marca Soria Natural) fue adquirido a través de la distribuidora Herbofarm (Madrid, España), el cual se obtiene por arrastre de vapor de agua en gran escala con un grado de pureza de 99 %.
]]> Extracción del aceite esencial de E. camaldulensisLas hojas de eucalipto fueron secadas a la sombra a 25 ± 5 °C por dos semanas acorde con lo recomendado por Moreno, López, y Siche (2010). La extracción del aceite esencial se hizo con la técnica de arrastre de vapor empleando un equipo extractor de destilación tipo Clevenger, de acuerdo con el método oficial 6.0006 de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1990).
Insectos de R. dominica
Los ejemplares de R. dominica provinieron de una colonia desarrollada en el laboratorio de Entomología del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos de la Universidad de Sonora. La colonia se desarrolló bajo condiciones controladas de temperatura (27 ± 2 °C), humedad relativa (70 ± 5 %) y fotoperio-do (12L:12O). Después de siete días durante los cuales se llevó a cabo la oviposición, los insectos progenitores fueron removidos y los granos infestados se mantuvieron en incubación por 45 días adicionales para la emergencia de nuevos insectos. La progenie resultante fue empleada para infestar las muestras de grano de trigo que se expusieron a los aceites esenciales de E. globu-lus y E. camaldulensis.
Bioensayo de mortalidad de R. dominica
Se acondicionaron tubos de polipropileno (Corning, 50 mL), modificándolos en la parte interna de las tapas para adherirles un trozo de esponja de poliuretano (0.5 x 0.5 cm). En cada uno de los tubos se agregaron 20 g de trigo y se infestaron con 20 ejemplares no sexados de R. dominica. Las esponjas fueron impregnadas con 5, 10 o 15 µL de aceite de E. globulus o de E. camaldulensis. Un tubo con trigo infestado y sin aceite fue empleado como control. Las tapas de los tubos fueron selladas con parafilm para impedir pérdidas de compuestos volátiles de los aceites y después se colocaron en una cámara de incubación (VWR Scientific Inc.) a 27 ± 2 °C y 70 ± 5 % HR. Los tiempos de exposición del insecto al aceite fueron de 24, 48 y 72 h. El experimento se realizó por triplicado. Al final de cada tiempo de exposición, los insectos fueron removidos y la tasa de mortalidad fue calculada de acuerdo con la siguiente ecuación publicada por Abbott (1925):
Los granos de trigo fueron nuevamente incubados por 45 días sin exposición a los aceites esenciales, bajo las condiciones anteriormente descritas para la emergencia de nuevos individuos. Las progenies resultantes fueron colectadas y empleadas para evaluar su actividad enzimática amilolítica y proteolítica.
Obtención de extractos enzimáticos de progenies de R. dominica
Los extractos enzimáticos se prepararon utilizando el procedimiento de Cinco-Moroyoqui et al. (2008). Las progenies que emergieron de las muestras de trigo expuestas a los vapores de aceites esenciales se colectaron y maceraron en un mortero de porcelana. En el macerado se utilizaron 10 mL de solución amortiguadora de Tris-HCl 20 mM, pH 8, conteniendo NaCl 20 mM y CaCl2 10 mM (solución A). Posteriormente, el macerado se centrifugó a 4 °C por 30 min a 10,000 g. Los sobrenadantes fueron pasados a través de filtros de nylon Cameo 17N (0.45 µm; Osmo-nics Laboratory Products, Minnetonka, MN, USA). De cada extracto enzimático se tomaron alícuotas de 2 mL y se purificaron parcialmente mediante cromatografía de interacción hidrofóbica en columnas de vidrio (1 x 5 cm) empacadas con fenil sefarosa CL-4B (Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) y equilibradas con Tris-HCl 20 mM, pH 8, conteniendo NaCl 20 mM, CaCl2 10 mM y sulfato de amonio al 25 % de saturación (solución B). Las proteínas que no se unieron a la columna fueron eluidas con aproximadamente 15 mL de la solución B. Por otra parte, las proteínas con actividad amilolítica y proteolítica fueron eluidas agregando aproximadamente 20 mL de Tris-HCl 20 mM, pH 8, conteniendo NaCl 20 mM, CaCl2 10 mM y etilenglicol al 20 % (v/v) (solución C). Se colectaron fracciones de 3 mL y se analizó la actividad enzimática correspondiente. Las fracciones con actividad amilolítica y proteolítica fueron combinadas y empleadas como fuente de actividad enzimática sin purificación adicional.
]]> Determinación de la actividad enzimática de las progenies de R. dominicaLa determinación de la actividad amilolítica y proteolítica de las progenies de R. dominica se realizó mediante el procedimiento descrito por Cinco-Moro-yoqui et al. (2008) y Kakade, Rackis, Mcghee, y Puski (1974), respectivamente.
Determinación de proteína en extractos enzimáticos
La determinación de proteína en los extractos enzimáticos obtenidos de la cromatografía de interacción hidrofóbi-ca fue llevada a cabo de acuerdo con el procedimiento de Bradford (1976) usando seroalbúmina como estándar.
Análisis estadístico
El experimento se realizó con tres réplicas empleando un diseño completamente al azar con arreglo factorial teniendo como fuentes de variación: fuente de aceite con dos niveles (E. globulus y E. camaldulensis), volumen de aceite con cuatro niveles (0, 5, 10 y 15 µL) y tiempo de exposición con tres niveles (24, 48 y 72 h). Las variables respuestas fueron porcentaje de mortalidad, emergencia de insectos y actividad enzimática amilolítica y proteolítica de las progenies. Se hizo un análisis de va-rianza y una comparación de medias mediante la prueba de Tukey (P < 0.05), empleando el paquete estadístico JMP versión 8.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Mortalidad de R. dominica
En el Cuadro 1 se puede apreciar que la fracción volátil del aceite esencial de E. globulus causó significativamente una mortalidad mayor de la población de R. dominica que el aceite de E. camaldulensis (P < 0.05). El aceite de E. globulus ocasionó el 100 % de mortalidad del insecto a cualquier dosis del aceite y en todos los tiempos de exposición del grano. El volumen de aceite más elevado (15 µL) y el mayor tiempo de exposición del grano de trigo (72 h) a E. camaldulensis, ocasionaron sólo una mortalidad máxima de aproximadamente 32 %. Sin embargo, se observó un comportamiento de segundo orden (r = 0.88) al hacer un análisis gráfico (no mostrado) de los datos de mortalidad en los tres tiempos de exposición del grano infestado al aceite. En este análisis se encontró que la máxima mortalidad de R. dominica que E. camaldulensis ocasionó al insecto se alcanzó a las 48 h sin observarse un cambio significativo a tiempos mayores de exposición (P < 0.05) (Cuadro 1). El aceite de E. camaldulensis ha sido reportado como uno de los causantes de mayor mortalidad en insectos que dañan granos almacenados (Negahban & Moharramipour, 2007), aunque en este estudio R. dominica fue más resistente al efecto tóxico de dicho aceite.
]]> Los resultados obtenidos sugieren que las diferencias en la mortalidad ocasionada por la fracción volátil de los aceites de los dos tipos de eucalipto pueden deberse a la concentración de componentes activos. La variación de éstos puede ser producto de factores tales como la edad de la planta, estación climática del año y sitio de recolecta (Siramon & Ohtani, 2007; Zhang et al., 2010). Sin embargo, la eficiencia de E. globulus en la alta mortalidad de R. dominica a dosis bajas y tiempos cortos de exposición, deja de manifiesto que sería el aceite a seleccionar para controlar la infestación del insecto en el trigo almacenado.
Emergencia de R. dominica
En el Cuadro 2 se muestra el número de insectos emergidos de las muestras de trigo expuestas a los vapores de los aceites de eucaliptos. Se puede observar que el número de las progenies emergidas del trigo expuesto a cualquier dosis del aceite de E. globulus fue significativamente menor solamente hasta las 72 h de exposición. Además, se observó que a medida que se incrementó la dosis de aceite, el número de progenies emergidas fue progresivamente menor, siendo nulo a dosis de 10 y 15 µL a las 72 h de exposición (P < 0.05). Se ha reportado que el uso del aceite de E. globulus disminuye la ovoposición de R. dominica (Batish, Pal-Singh, Kohli, & Kaur, 2008) y afecta la emergencia de Sitophilus zeamais en granos de maíz causando altas tasas de mortalidad (Mossi et al., 2011). En contraste con E. globulus, la emergencia de progenies de R. dominica en el trigo expuesto al aceite de E. camaldulensis, con todos los volúmenes evaluados y en todos los tiempos de exposición, no fue afectada significativamente (P < 0.05) (Cuadro 2). El aceite esencial de E. camaldulensis ha sido reportado como un agente efectivo para reducir la población de insectos de granos almacenados (Naseem & Khan, 2011; Negahban & Moharramipour, 2007); sin embargo, en el presente estudio no fue eficaz para reducir la emergencia de progenies de R. dominica.
Actividad enzimática de progenies de R. dominica
Actividad amilolítica. Las progenies de R. dominica que emergieron del trigo expuesto a los vapores de aceites esenciales de E. globulus y E. camaldulensis mostraron valores de actividad amilolítica que incrementaron a medida que aumentó el tiempo de exposición y el volumen de aceite empleado (Cuadro 3). Sin embargo, la actividad amilolítica de las progenies del insecto expuestas al aceite de E. globulus fue mayor que las expuestas al de E. camaldulensis (P < 0.05). El aceite de E. globulus fue más eficaz causando la muerte de las progenies desde la dosis de 5 µL a 72 h de exposición. En el caso de las progenies expuestas al aceite de E. camaldulensis, la actividad amilolítica aumentó pero sin provocar la muerte de éstas. Los resultados sugieren que los aceites esenciales ejercen un efecto activador del metabolismo de los insectos para sintetizar una mayor cantidad de enzimas amilolíticas, y así contrarrestar el efecto insecticida, permitiéndole al insecto digerir el almidón del grano. Es interesante notar que las progenies que emergieron de las muestras de trigo expuestas a 72 h a cualquier dosis del aceite presentaron los valores más elevados de actividad amilolítica (P < 0.05). Adicionalmente, se observó que la actividad amilolítica está relacionada de manera inversa con el número de individuos de las progenies; es decir, las progenies con menor número de individuos presentaron los valores más altos de actividad amilolítica. Estos resultados sugieren que las progenies de R. dominica activan mecanismos metabólicos de resistencia a los compuestos químicos que afectan su sobrevivencia. En otras palabras, esto se puede describir como una adaptación fisiológica del insecto para sobrevivir y nutrirse del grano de trigo que se encuentra infestando. Cinco-Moroyoqui et al. (2006) observaron que variedades de trigo con altas concentraciones de inhibidores de la enzima a-amilasa ocasionaron un incremento en la actividad amilolítica de progenies del insecto desarrolladas en los mismos granos. Hamedo y El Shamy (2008) observaron que el aceite esencial de Eucalyptus rostrata ocasionó un aumento en la actividad amilolítica de Trichoderma virens y Fusarium solani. Otros estudios han reportado la adaptación enzimática de los insectos en presencia de fumigantes para sobrevivir, lo cual ocasiona un costo metabólico para la adaptación y resistencia al estrés ocasionado (Silva, Lopes, Oliveira, & Guedes, 2010).
Actividad proteolítica. Los aceites esenciales de E. globulus y E. camaldulensis promovieron un incremento en la actividad proteolítica de las progenies de R. dominica (Cuadro 4). Una excepción fue la observada con el aceite de E. globulus que ocasionó una disminución de la actividad proteolítica con respecto al control, cuando se empleó un volumen de aceite de 5 µL a tiempos de exposición de 24 y 48 h. Sin embargo, este volumen de aceite fue suficiente para ocasionar la muerte de la totalidad de los insectos a las 72 h (P < 0.05). Es importante hacer notar que en el resto de los casos, la actividad proteolítica se incrementó a medida que se aumentaron los volúmenes de aceites en cada tiempo de exposición. Entre los dos tipos de aceite, los valores observados en la actividad proteolítica no mostraron diferencias estadísticas claras en comparación con las observadas en la actividad amilolítica. El efecto de los aceites esenciales para exterminar microorganismos ha sido atribuido a su efecto inhibitorio de la actividad de enzimas como proteasas (Thoroski, Blank, & Biliaderis, 1989) y descarboxilasas (Wendakoon & Sakaguchi, 1995).
CONCLUSIONES
]]> Los resultados del presente estudio mostraron que la fracción volátil del aceite de E. globulus fue más efectivo que E. camaldulensis causando tasas altas de mortalidad. La medición de la actividad amilolítica y proteolítica de las progenies del insecto emergidas de granos expuestos a los vapores de los aceites permitió evaluar el efecto tóxico de éstos de una mejor forma. Las actividades de ambas enzimas en las progenies aumentan cuando los insectos son expuestos a los aceites esenciales, lo que puede interpretarse como una forma fisiológica para contrarrestar los efectos tóxicos que éstos ocasionan. Los resultados indican que la actividad amilolítica es mayor que la actividad proteolítica. En esta última no se observaron diferencias entre las progenies emergidas de granos de trigo expuestos a las dos fuentes de aceites. Lo anterior lleva a concluir que los aceites esenciales ocasionan a las progenies un gasto energético, lo que eventualmente les ocasiona la muerte.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) por el financiamiento otorgado para la realización del presente estudio (PRO-MEP/103.5/10/4593). El autor I.B.Q. R. Reyes Guzmán agradece a CONACyT por el apoyo económico otorgado para la realización de sus estudios de posgrado.
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