In vitro morphogenesis in Pseudotsuga menziesii var. glauca

María Guadalupe Carrillo–Benítez; José Luis Rodríguez–De la O^¶; José Guadalupe Álvarez–Moctezuma

Universidad Autónoma Chapingo, Carretera México–Texcoco, km 38.5, Chapingo Estado de México, C. P. 56230. Correo–e: jrguez@correo.chapingo.mx (^¶Autor para correspondencia)

Recibido: 23 de abril, 2010 ]]> Aceptado: 11 de abril, 2011

RESUMEN

Se evaluó la respuesta morfogénica a partir de embriones cigóticos cultivados in vitro de semilla almacenada (un año) de Pseudotsuga menziesii var. glauca recolectada en Tlaxcala. Las semillas fueron desinfestadas con detergente y H₂O₂ (3 % v/v) durante 48 h en agitación a 50 rpm, cultivadas en el medio de Murashige y Skoog (1962) sin reguladores. La germinación ocurrió después de siete días y posteriormente subcultivados a un medio MS con 2,4–D (3 mg·L^–1) y BA (1 mg·L^–1). Con los callos obtenidos en un medio HS se evaluaron tres concentraciones de ABA para promover formación de estructuras embrionarias, presentándose el mejor tratamiento con concentración de 10.0 mg·L^–1 (P<.0001). El mejor desarrollo de plántulas se presentó empleando un medio Murashige y Skoog (1962) con sacarosa al 6 %. Se usaron micorrizas para mejor adaptación de plántulas a suelo. No hubo formación de raíces.

Palabras clave: Embrión, callo, plántula, reguladores del crecimiento.

ABSTRACT

This study assessed the morphogenic response of in vitro cultured zygotic embryos obtained from Pseu–dotsuga menziesii var. glauca seed collected in Tlaxcala, Mexico and stored for one year. Seeds were disinfected with detergent and H₂O₂ (3 % v/v) for 48 h under stirring at 50 rpm and cultured on Murashige and Skoog (1962) medium without regulators. Germination occurred after seven days and then the explants were subcultured on MS medium with 2,4–D (3 mg·L^–1) and BA (1 mg·L^–1). With the calluses obtained on HS medium, three ABA concentrations intended to promote formation of embryonic structures were evaluated. The best treatment was with a concentration of 10.0 mgL^–1 (P<.0001). The best plantlet development curred using Murashige and Skoog (1962) medium with 6% sucrose. Mycorrhizae were used to improve plantlet adaptation to soil. No roots formed.

Key words: Embryo, callus, plantlets, growth regulators.

En México, Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco se localiza principalmente en el noroeste y noreste de México, además en el centro y sur aunque con poblaciones reducidas y aisladas (Domínguez, 1994; Reyes et al., 2005, 2006), su importancia es ambiental (captura de carbono), económico (árboles de navidad y plantaciones especializadas), social (empleos), ecológico y forestal (especie en riesgo y distribución fitogeográfica) (Álvarez et al., 2007; SEMARNAP, 2010). Mápula et al., (2007) mencionan que las amenazas estriban en escasa regeneración natural y deforestación, por lo que se ubica en vías de extinción. La Norma Oficial NOM–59–SEMARNAT–2010 (D.O.F., 2010) sitúa a la especie bajo protección especial. Estas poblaciones también se ven alteradas por factores antropogénicos, como incendios, cambio de uso de suelo, corta de árboles, plagas y enfermedades (Velasco et al., 2007), por ende reduce su variación, aumentando la endogamia y reduciendo capacidad reproductiva (Saccheri et al., 1998; Mosseler et al., 2000). En poblaciones naturales de P. menziesii se han detectado altos niveles de endogamia (Cruz et al., 2008), escasa producción de semilla (Mápula et al., 2007), problemas en la germinación y crecimiento inicial (Juárez et al., 2006; Mápula et al., 2008) y baja repoblación natural (Velasco et al., 2007); lo cual repercute seriamente en la conservación de dicha especie (Ventura–Ríos et al., 2010).

La aplicación del cultivo in vitro de células y tejidos vegetales, ofrece un apoyo a los métodos tradicionales de propagación, permitiendo la propagación masiva de esta especie para plantaciones comerciales de árboles de navidad, evitando la recolecta excesiva de semillas en su hábitat natural, incrementando multiplicación clonal de genotipos selectos. Además, coadyuva a crear bancos de germoplasma in vitro, para la conservación ex situ. El embrión fue utilizado con Pinus patula Schiede ex Schl. et Cham. var. patula para inducir formación de brotes (McKellar et al., 1994). La calidad del embrión somático es menor que el cigótico en cuanto a morfología, peso seco, germinación y estabilidad genética (Pullman, 2003). Sin embargo, aunque se presenten ciertas limitantes, la embriogénesis somática es una técnica exitosa y potencial para la producción de diversas especies forestales (Cheng y Voqui, 1977; Arya, et al., 2000). Uno de los problemas que se presenta en plántulas de coníferas obtenidas in vitro es la formación de raíz. El objetivo de este estudio fue evaluar las respuestas morfogénicas a partir del cultivo in vitro de embriones de P. menziesii var. glauca.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Fitotecnia (Universidad Autónoma Chapingo, México). El inóculo fue semilla (un año de almacenamiento) procedente de Tlaxco, Tlaxcala. Se muestrearon 20 árboles. La semilla tuvo un peso de 119.5 mg, de 5 a 6 mm de longitud encontrándose 40 % vana y 10 % dañada por insectos. Los explantes se lavaron con detergente vigorosamente y pasaron por tratamientos de desinfestación. Para el primer tratamiento, el embrión se mantuvo en H₂O₂ (3 % v/v), durante 48 h en agitación y después se aplicó Ca(OCl)₂ al 4 % durante 15 minutos, posteriormente con H₂O₂ (3 % v/v) durante 24 horas. En agitación a 50 rpm. En el segundo tratamiento se sumergieron las semillas en fungicida (BRAVO 720) al 2 % en agua estéril durante 24 h en agitación a 50 rpm. La tercera consistió en dejar las semillas en H₂O₂ (3 % v/v) durante 48 h en agitación a 50 rpm. La cuarta prueba, se realizó a cinco plantas aplicando AGRIMYCU 500^®, quince días antes de obtener los explantes (yemas, ápices, y tallos), mismos que se lavaron con detergente al chorro del agua, y se pasaron a una solución de alcohol al 70 % durante 15 minutos, se enjuagaron en agua con antioxidante (100 mgL^–1 de ácido ascórbico más 150 mg·L^–1 de ácido cítrico), para controlar el necrosamiento, posteriormente, se pasaron a una solución de cloro comercial al 6 % durante 5 minutos, enjuagándose con agua más antioxidantes, los explantes permanecieron en ésta hasta el momento de ser cultivados.

En la primera prueba se utilizaron las semillas desinfectadas con el fungicida (BRAVO 720), las que fueron colocadas en cajas Petri, con papel filtro húmedo, en cámaras de germinación a 20 y 30 °C, con 16 horas luz y 8 horas de oscuridad durante dos meses. En la segunda prueba de germinación se utilizaron las semillas desinfectadas con Ca(OCl)2 y H₂O₂, (3 % v/v), las que fueron cultivadas en medio nutritivo Murashige y Skoog (1962) al 100 %. Mientras que en la tercer prueba se utilizaron las semillas colocadas en el H₂O₂ (3 % v/v), mismas que se disectaron para extraer el embrión. El medio básico utilizado en las pruebas de germinación fue el de MS, al 100 %, sin reguladores de crecimiento, con Tiamina. Para inducir la formación de callos se utilizó el medio de Murashige y Skoog (1962) en dos tratamientos; en el primero se disminuyeron nitratos al 50 % y se aumentaron fosfatos al 200 %, con L–glutamina (450 mgL^–1), Caseina hidrolizada (100 mg·L^–1), 3 mg·L^–1 de 2,4–D y 1 mg·L^–1 de Benciladenina (BA). Para el segundo se utilizó las sales básicas del medio Murashige y Skoog (1962) y se adiciono Lglutamina (450 mg·L^–1), 1.5 % de malta, más 2.0 mg·L^–1 de ANA, 0.5 mg·L^–1 de BA, 0.5 mg·L^–1 de KIN y 1.0 mg·L^–1 de ABA.

El medio utilizado para inducir crecimiento de callos fue el de Schenk y Hildebrandt (1972) con carbón activado al 0.1 %, con concentraciones de 0.0, 0.5, 1.0 y 3.0 mg·L^–1 BA, y con 0.0, 0.5, 1.0 y 3.0 mgL de cinetina. Para la inducción de embriones se utilizó como medio básico el de HS (1972), más carbón activado al 0.1 %, 0.0 y 0.5 mg·L^–1 BA, 0.0 y 0.5 mg·L^–1 de cinetina y 0.0, 10.0, 20.0 y 40.0 mg·L^–1 de ácido abscísico. El medio utilizado para inducir la organogénesis fue el medio básico el de MS, con carbón activado (50–100 mg·L^–1), maltosa al 1.5 %, 450 mg·L^–1 de L–glutamina, 0.3 mg·L^–1 de ácido naftalenacético, 0.5 mg·L^–1 de BA y 0.5 mg·L^–1 de cinetina. El medio usado para desarrollar plántulas fue el medio básico el de MS, con vitaminas WS (Aguilar, 1997), y carbón activado; al primer tratamiento se le adicionó azúcar al 3 y 6 %, y al segundo sacarosa al 3 y 6 %, como fuente de carbohidratos. Las semillas, embriones, callos, ápices, yemas, tallos y plántulas se mantuvieron a 27 °C ± 1 °C durante el día y de 23 °C ± 1 °C en la noche, con fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas oscuridad. La incubación de embriones, callos, yemas, ápices y tallos, se mantuvo con una intensidad luminosa de 17 µM·m^–2s^–1, y las plántulas a 29 µM·m²s^–1, la iluminación fue proporcionada por lámparas fluorescentes DURO–TEST (Labline®.Mexico de 75 W). Para semillas y embriones se utilizó la incubadora Lab–Line IMPERIAL^®, bajo oscuridad.

Para las semillas en las cámaras germinadoras, se evaluaron porcentaje de contaminación y número de semillas germinadas, el tiempo de observación fue de dos meses. Para la evaluación de la germinación de semillas en medio Murashige y Skoog (1962), las variables evaluadas fueron porcentaje de contaminación y de germinación, en condiciones de luz y oscuridad durante siete días. Posteriormente se evaluó porcentaje de contaminación en el medio MS en 3, 4 y 13 días. Se evaluaron los embriones que formaron callo y porcentaje de necrosamiento a los 20 días después de la siembra. Se evaluó el porcentaje de contaminación, necrosamiento, a los 5, 12,19, y 26 días en las yemas, ápices y tallos con una y dos hojas, cultivados in vitro. Para la evaluación de los callos en respuesta al medio HS (1972) con benciladenina (BA) y cinetina (KIN) se utilizó un diseño experimental de bloques completamente al azar, los datos se presentan a los nueve y 17 días; el diseño consta de dos bloques; cuatro tratamientos y siete repeticiones, la variable respuesta fue el diámetro por callo. Para el análisis estadístico se consideraron tres tratamientos en medio HS con 0.5, 1.0. y 3.0 mg·L^–1 de BA y 0.5, 1.0. y 3.0 mg·L^–1 de KIN.

Para la evaluación de recuperación de callos del medio HS con BA y KIN se evaluó el diámetro de los callos proveniente de cada tratamiento incluyendo al testigo. Se utilizó un diseño completamente al azar, se consideraron cuatro tratamientos, se tuvieron cuatro repeticiones para el testigo, cinco para el tratamiento uno, dos para el tratamiento dos y cinco para el tratamiento tres. El periodo de cultivo fue de cuatro semanas. Para la evaluación del crecimiento de callos y formación de embriones en medio HS con ABA se utilizó un diseño experimental de bloques completamente al azar. Los datos se tomaron en la primera, segunda, tercera y cuarta semana. El diseño constó de cuatro bloques; cuatro tratamientos y cuatro repeticiones. Los tratamientos tuvieron concentraciones de 0.0, 10.0 20.0 y 40.0 mg·L^–1 de ABA más 0.5 mg·L^–1 de BA y 0.5 mg·L^–1 de KIN. Se evaluó el diámetro de callos y formaciones globulares (embriones).

El sustrato para el trasplante a suelo fue una mezcla de peatmoss, perlita y vermiculita (52, 23 y 25 %) más 40 mg de MycorTree™ Ecto–Inyectable™ (Pisolithus tinctorius y Scleroderma). Las plántulas se sumergieron en una solución de 20 ml con 25 mg de T–22 ™ PHC™ (Trichoderma harzianum). Posteriormente se trasplantaron en tubetes con el sustrato humedecido, y protegidos con una bolsa durante 15 días, para mantener la humedad relativa, misma que se fue disminuyendo gradualmente, hasta que las plántulas soportaron la humedad ambiental, expuestas a una intensidad luminosa de 61 µM·m^–2·s^–1 y una temperatura de 29 y 21 °C. Una semana después de ser trasplantadas fueron fertilizadas con sales inorgánicas del medio Murashige y Skoog (1962) al 50 %.

El modelo estadístico utilizado fue completamente al azar (DCA):

Donde:

Y: es la variable de respuesta de interés,

µ: es el promedio general de la muestra sobre la cual se está trabajando,

t: es la variación que se atribuye a los niveles del factor que se está evaluando (efecto de los tratamientos),

e: es la variación de los factores no controlados (el error experimental),

i: es el i –ésimo tratamiento,

j(i): es la variación de las unidades experimentales anidada en los tratamientos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuando los embriones fueron cultivados en el medio Murashige y Skoog (1962), sin reguladores y H₂O₂ hubo 27.8 % de contaminación a los tres días (por bacterias), la respuesta al medio fue de 44.4 % a los 13 días y el 27.8 % no respondieron. Monjarás (2004), menciona que en el proceso de desinfestación utilizó bactericidas y fungicidas. El H₂O₂ desinfectó efectivamente las semillas, sin embargo, la respuesta que tuvieron los embriones al medio de cultivo, no fue positiva. Los embriones maduros de Picea chihuahuana Martínez (López–Escamilla et al. ,2000) y Pseudotsuga menziesii (Galindo, 2000; Monjarás, 2004) forman brotes adventicios cuando se cultivan en medios con reguladores de crecimiento. En este trabajo, el medio M S sin reguladores promovió una germinación más rápida de los embriones (Figura 1).

En el tratamiento donde los nitratos se disminuyeron y bajo condiciones de luz, los embriones respondieron formando callos a los 20 días (Figura 1). Sin embargo, Tang et al. (2001a) mencionan que en Pinus taeda L. tardan nueve semanas en formar callos usando el mismo medio, y en el tratamiento con malta, en condiciones de luz y oscuridad, no respondieron necrosándose a los ocho días. Lo que tal vez se deba a la edad del embrión y a actividad de reguladores en el medio (Figura 1). Murashige y Nakano (1986) y Latkoska et al. (2000), mencionan que la luz y genotipo tienen gran influencia en el crecimiento del tejido embrionario. En nuestro estudio los callos fueron subcultivados en medio MS con 2,4–D, BA y KIN, manteniendo una color verde durante 14 días, necrosándose totalmente a los 19 días. Conger (1984) señala que una concentración no adecuada de carbón activado en el medio puede inhibir embriogénesis. En esta prueba los explantes no respondieron al medio de cultivo, el necrosamiento se presentó a los cinco días después de ser cultivados, con 56.5 % de necrosamiento total a los 26 días (Figura 2) y una contaminación total de 43.5 %, por presencia de hongos. McCown (1988) dice que la oxidación se da por una inadecuada concentración de sales, y reportó que los medios contienen bajos niveles de nitratos, que los que se encuentran en el medio MS.

El necrosamiento se presentó a los 17 días (Figura 2). Salajova et al. (1996) reportaron en híbridos de Abies alba Mill. x Abies cephalonica Loud. y de Abies alba x Abiesnumidica Lannoy ex Carrière cultivados con 1 mg·L^–1 de BAP, que fue mayor para formación y crecimiento de callos. Los callos crecidos fueron limitados por actividad del 2,4–D, aunado a necrosamiento. Tang (2001b) menciona que en Pinus taeda, el crecimiento de masa embriogénica llegó a 17 % en medio básico MS al 50 % con 2,4–D y BA. (Figura 2). Para recuperar los callos del necrosamiento se subcultivaron en el mejor tratamiento del experimento anterior el cual fue 0.5 mg·L^–1 de BA y 0.5 mg·L^–1 de KIN, durante cuatro semanas. Con base en el análisis de varianza se encontró que al menos uno de los tratamientos se recuperó (P=0.0289), los diámetros de los callos presentaron diferencias significativas, al disminuir la concentración de BA y KIN. Al adicionar carbón activado al medio se absorben los fenoles y se retarda el necrosamiento (Figura 2).

Para la inducción de tallos (en gimnospermas o angiospermas) se utiliza comúnmente BA en sales Murashige y Skoog (1962) o medio de cultivo para leñosas (WPM), adicionado con calcio (por ejemplo en Pinus pinaster Ait. y Betula platyphylla Sukaczev (Debergh y Zimmerman, 1993). Sin embargo, el uso de sales minerales para gimnospermas, las cuales son muy variables y usualmente contienen bajos niveles de nitratos (Arya et al., 2000), como aquellos encontrados en las sales MS y WPM, sumado a las condiciones ambientales requeridas por la planta. Con base en el análisis de varianza (SAS, 1999) se encontró que al menos un tratamiento tuvo efecto sobre la formación de embriones en los callos (P<0.0001). El mejor efecto en la formación de embriones fue la concentración de 10.0 mg–L ^–1 de ABA (P=0.05) (Figura 2). Salajova et al. (1996) reportaron que el potencial embriogénico de los callos en Abies alba x A. cephalonica y A. alba x A. numidica depende del medio de cultivo y del tipo de explante. Monjarás (2004) señaló que en embriones maduros disectados de Pseudotsuga, cultivados en medio SH (Schenk y Hildebrandt, 1972) con ANA (Ácido Naftalen Acético)/BA (6–Bencil Adenina) o 2,4–D (ÁCIDO 2–4 (Diclorofenoxiacético)/ K (Cinetina)) en diferentes concentraciones se forman brotes adventicios, y los embriones cigóticos cultivados, comienzan a formar otros embriones entre la cuarta y sexta semana, sin embargo destaca el problema para inducir el enraizamiento de brotes. Tang (2001b) reportó que la inducción de la organogénesis somática directa en P. taeda, resultó de la formación de múltiples tallos inducidos en cotiledones e hipócotilo de embriones cigóticos maduros, en un medio con 2,4–D, ANA, BA y KIN, durante 2 y 3 semanas. Sin embargo, otras hormonas llamadas Brasinosteroides (Brasinolide) tienen un impacto en la inducción de la embriogénesis somática de Pinus taeda, Pseudotsuga menziesii y Picea abies (L.) Kars., afectando la elongación celular y la producción de etileno, y aumentando la resistencia al estrés abiótico y el peso del tejido embriogénico (Pullman, 2003). Arya et al. (2000), mencionan que se pueden obtener callos de embriones cigóticos de P. roxburghii Sarg., con diferentes etapas de desarrollo, en medio DCR con 2,4–D, ANA, y BA. Tang et al. (2001a), mencionan que la regeneración de plántulas a partir de embriones cigóticos de P. taeda cultivados en ocho formulaciones diferentes de sales básicas, con 2,4–D, BA, caseina hidrolizada y L–glutamina, en un periodo de nueve semanas, se forman tejido embriogénico y callos y reportó que la más alta formación de tejido embriogénico fue de un 17 % en medio básico de MS al 50 %, y los embriones en un periodo de 4–12 semanas.

Los embriones cultivados en Murashige y Skoog (1962) con vitaminas WS (Aguilar, 1997) más Azúcar al 6 % formaron tres plántulas, las cuales se necrosaron a partir de los 21 días, mientras que embriones cultivados con azúcar al 3 %, formaron tres plántulas (de 200 semillas), necrosándose una a los 10 días. Los embriones cultivados en medio nutritivo MS con vitaminas WS más sacarosa al 6 %, formaron tres plántulas (de 200 semillas), el necrosamiento se presentó en una plántula a los 14 días y los embriones cultivados en el mismo medio más sacarosa al 3%, formaron dos plántulas, el necrosamiento se presentó en una plántula a partir de los 14 días. Las plántulas obtenidas in vitro no desarrollaron raíz (Figura 3). Existen reportes de mínima formación de raíz en brotes de Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. con un medio libre de hormonas y las plántulas en un sustrato con turba y perlita, tuvieron un 20 % de formación de raíces. En Pseudotsuga menziesii el crecimiento de tallos adventicios fue estimulado por un medio de cultivo de baja concentración de sales inorgánicas sin adición de reguladores de crecimiento (Cheng, 1975). En las plántulas provenientes de los tratamientos con azúcar al 3 % y sacarosa al 3 % que se transfirieron al sustrato, la supervivencia fue nula a los 25 días, sobreviviendo una plántula a los 29 días cumplidos proveniente del tratamiento con sacarosa al 6 %, ésta formó raíz con la ayuda de hongos ectomicorrízicos (AGROTERRA), aunque su crecimiento fue muy lento. Agregar hongos micorrízicos al sustrato permitió la formación de raíz y la supervivencia. Li et al. (2006) mencionan que las raíces micorrizadas tienen mayor capacidad para absorber nutrientes del suelo, multiramificación, y el crecimiento de las hifas dentro del suelo incrementan la absorción de agua y nutrientes.

CONCLUSIONES

La mejor prueba de germinación fue cultivar los embriones en medio básico Murashige y Skoog (1962) al 100 %, sin reguladores de crecimiento. El medio MS promovió la formación de callos (modificando las cantidades de nitratos, fosfatos y adicionando L–glutamina y caseína hidrolizada). Se recomienda disminuir los niveles de nitratos en el medio y utilizar otro inhibidor de la oxidación diferente al carbón activado para reducir los niveles de oxidación. La mejor respuesta para la formación de estructuras embriogénicas, fue en el medio Hildebrandt y Schenk. con 10.0 mg·L^–1 de ABA. El mejor tratamiento para desarrollar plántulas fue en medio MS con vitaminas WS y azúcar al 3 %, y para desarrollar plántulas más resistentes para ser aclimatadas fue en medio MS con vitaminas WS y sacarosa al 6%. No se obtuvieron raíces a pesar de que se dio el tratamiento con auxinas. En la última etapa, durante la transferencia a suelo, las raíces se pudieron promover gracias a la adición de hongos ectomicorrízicos (AGROTERRA).

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