Tizón suizo (Phaeocryptopus gaeumannii (Rhode) Petrak) en Pseudotsuga menziessi var. glauca (Beissn.) Mayr
Swiss needle cast (Phaeocryptopus gaeumannii (Rhode) Petrak) in Pseudotsuga menziesii var. glauca (Beissn.) Mayr
David Cibrián Tovar1, Omar Alejandro Pérez-Vera1, Silvia Edith García Díaz1, Víctor David Cibrián Llanderal2, Juan Cruz Juárez1 y Gabriela Hernández Acevedo1
1 División de Ciencias Forestales, Universidad Autónoma Chapingo. Correo-e: oalejandrovera@gmail.com
]]> 2 Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo.
Fecha de recepción: 3 de abril de 2013;
Fecha de aceptación: 20 de febrero de 2014.
RESUMEN
En México se localizan poblaciones nativas de Phaeocryptopus gaeumannii como colonizadoras de Pseudotsuga menziesii var. glauca. Este hongo es causante del tizón suizo (Swiss Needle Cast), enfermedad que causa defoliación prematura y reducción en el crecimiento. P. gaeumannii se distribuye en el bosque natural de la Sierra Madre Occidental, la Sierra Madre Oriental y en la Sierra Madre del Sur, así como en diversas plantaciones de Árboles de Navidad del centro del país. Los objetivos del presente trabajo fueron identificar y caracterizar molecularmente al patógeno en distintas áreas geográficas y esclarecer algunos aspectos de su ciclo biológico. Para ello, se recolectó follaje de P. menziesii var. glauca con pseudotecios maduros en ocho estados de la república mexicana y se obtuvo una muestra procedente de Oregon (Estados Unidos de América); se aislaron en agar - agua 1.5 % (AA) y se mantuvieron en un medio de cultivo de papa – dextrosa - agar (PDA) durante 60 días. Para identificarlas se consideraron características morfológicas así como los resultados de la amplificación de genes nucleares, a través de la PCR - ITS, que presentó de 99 a 100 % de identidad. El crecimiento se dio de forma radial, color verde olivo a gris, sin formar estructuras reproductivas. Las ascosporas alcanzaron su madurez en marzo y son detectables en la atmósfera; la dispersión principal ocurre entre junio y julio, en relación con las condiciones climáticas y de la localidad; en septiembre y octubre disminuye la cantidad.
Palabras clave: Árboles de Navidad, captura de esporas, PCR, plantación comercial, Phaeocryptopus gaeumannii (Rohde) Petrak, pseudotecio.
ABSTRACT
]]> There are native populations of Phaeocryptopus gaeumannii in Mexico as colonizing species of Pseudotsuga menziesii var. glauca. This fungus is the cause of the Swiss Needle Cast, a disease that provokes premature defoliation and a reduction in growth. The aims of the this paper were to identify and describe molecularly this pathogen in different geographical areas and to clear up some details of its biological cycle. Therefore, P. menziesii var. glauca leaves with ripe pseudothecia were collected in eight states of the country and a sample from Oregon (United States of America) was taken; they were isolated in 1.5 % water-agar (WA) and were kept in a potatoe – dextrose - agar (PDA) cultivation media for 60 days. To identify them, morphological features were considered as well as the results of the nuclear gene amplification, through the ITS - PCR which showed 99 to 100 % of identity. Growth was radial, olive green to grey color, without formation of reproductie structures. P. gaeumannii is found in the natural forests of Sierra Madre Occidental, Sierra Madre Oriental and Sierra Madre del Sur, as in several Christmas tree plantations at central Mexico. Ascospores became ripe in March and are visible in the atmosphere; the main dispersion occurrs from June and July; in regard to the climate and the locality; in September and October they diminish their amount.Key words: Christmas trees, spore catchment, PCR, commercial plantation, Phaeocryptopus gaeumannii (Rohde) Petrak, pseudothecius.
INTRODUCCIÓN
Pseudotsuga menziesii var. glauca (Beissn.) Mayr habita en Canadá, Estados Unidos de América y México; en el último se conoce como pinabete o romero y se distribuye en la Sierra Madre Oriental, en la Sierra Madre Occidental (Martínez, 1963; Rzedowski, 1994) y en la Sierra Madre del Sur, de manera discontinua y en altitudes de 2 000 a 3 200 m (Debreczy y Rácz, 1995). La especie se cultiva para comercializarla como Árbol de Navidad en 14 estados, que en total, suman una superficie de 1 750 ha (Conafor, 2009).
Phaeocryptopus gaeumannii (Rohde) Petrak (tizón suizo) infecta individuos de diferentes edades en las plantaciones ubicadas en el centro del país (Cibrián et al., 2007); los huéspedes muestran clorosis, defoliación prematura del follaje y reducción en el crecimiento. En Estados Unidos de América y Canadá afecta grandes regiones del noroeste y daña principalmente a P. menziesii (Mirb.) Franco. Su primer registro data de 1920, en Suiza; después se le identificó en Norteamérica, en donde se le conoce como Rocky Mountain Douglas Fir o Swiss Needle Cast (SNC) (Hansen et al., 2000; Winton et al., 2007). Phaeocryptopus pertenece a la familia Venturiaceae, orden Pleosporales y a Rhizosphaera, como su anamorfo (Kirk et al., 2001); sin embargo, estudios moleculares recientes han clasificado a P. gaeumannii en la familia Mycosphaerellaceae, orden Capnodiales, con las especies Mycosphaerella y Rasutoria (Morales et al., 2012; Winton et al., 2007).
En la actualidad el hongo se ha expandido hacia Argentina, Chile, Nueva Zelanda, Turquía y algunos países de Europa, por lo que constituye un problema fitosanitario en los cultivos de árboles de Navidad (Osorio, 2007; Morales et al., 2012). En la zona costera de Oregon existen infecciones en aproximadamente 15 000 ha, lo que significa una merma en el desarrollo de hasta 50 % (Stone et al., 2007). En México, Cibrián et al. (2007) consignaron los primeros datos acerca de los daños y su ubicación. El objetivo del presente estudio fue identificar y caracterizar molecularmente la especie en diferentes áreas geográficas y esclarecer algunos aspectos de su ciclo biológico en plantaciones comerciales del centro del país.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo
]]> Se obtuvieron muestras de follaje de P. menziesii var. glauca con síntomas de tizón suizo tanto en bosque natural como en zona cultivada, entre junio y diciembre de 2007: cuatro correspondieron al estado de Coahuila, seis a Durango, tres al Estado de México y una a Quéretaro. De enero a diciembre de 2008 se recolectó en bosque natural, para añadir ocho colecciones de Chihuahua, cinco de Nuevo León, tres de Oaxaca y una de Puebla (Cuadro 1, Figura 1) y se recibió una última, con pseudotecios de un árbol de la especie de interés y con las mismas características, importado de Oregon, EUA.Aislamiento e identificación
Los especímenes de acículas con pseudotecios se lavaron con agua destilada estéril durante 5 minutos, se secaron y se adhirieron por el haz a la tapa de la caja de Petri; se dejaron expuestos los cuerpos fructíferos hacia el medio de cultivo de agar - agua (AA) y fueron incubados a 25 °C con luz blanca por 2 días. Pasado este tiempo, se aislaron las ascosporas germinadas de forma individual en papa – dextrosa - agar (PDA) y se mantuvieron ahí por 60 días. Se registró el crecimiento micelial, la formación de estructuras reproductivas y la pigmentación de las colonias en cajas de Petri con PDA.
Se realizaron cortes transversales de forma manual y se observaron las características morfológicas de 100 pseudotecios, 50 ascas y 50 ascosporas con un microscopio compuesto Carl Zeiss Microlmaging GmbH. Con las claves taxonómicas de Stone y Carroll (1985), Stone et al. (2008a) y Osorio (2007) se identificaron el género y la especie. Para analizar el desarrollo del hongo en la parte interna y sobre la superficie de las hojas se utilizó microscopía electrónica de barrido, que permitió revisar secciones de tejido con cuerpos fructíferos de 1 mm de longitud, que se fijaron en glutaraldehído al 3 % y se lavaron con amortiguador de fosfatos Sorensen's, para ser deshidratados en una serie de soluciones de etanol y secados en CO2 a punto crítico en un desecador Samdri - 780A®;; finalmente se recubrieron con oro en una ionizadora JFC - 1100®; y se observaron en un microscopio electrónico de barrido JSM - 35C®; en el laboratorio de Microscopía Electrónica del Colegio de Postgraduados de Montecillo, Estado de México.
Caracterización molecular
El ADN de los hongos se obtuvo a partir de cultivos de punta de hifa que crecieron en medio líquido de extracto malta (EM), con el método AP (Sambrooky Russell, 2001). Los aislamientos utilizados y la localidad del origen se indican en el Cuadro 1.
Se usó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en combinación con los iniciadores ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) e ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) (White et al., 1990) para amplificar las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (ARNr). El producto amplificado se purificó con el Kit Wizard SV (Promega®;, USA) y se secuenció en ambas direcciones en Macrogen (Corea). Cada secuencia se analizó con el Software BioEdit v7.0.9.1 (Hall, 1999) y se depositó en el GenBank.
Ciclo biológico y trampeo de ascosporas
Se realizaron visitas mensuales durante 24 meses (de 2006 a 2009) en las que se registró el desarrollo de la enfermedad causada por P. gaeumannii en plantaciones comerciales de Pseudotsuga menziesii var. glauca en dos sitios: Tres Encinos (19° 11'34.92'' N y 100°07' 50.51'' O) a 1 822 msnm (Valle de Bravo, Estado de México) y en el Rancho Chichicaxtla (19°43' 50" N y 97° 59' 17" O) a 2 852 msnm (área semillera en Aquixtla, Puebla).
Adicionalmente, se determinó el periodo de dispersión de las ascosporas con ayuda de "trampas de esporas fungales" (Ostrey y Nicholls, 1982) que consisten en cubrir con petrolato puro (vaselina) la cara de un portaobjetos dividido en cinco bandas de 250 mm2, para obtener un total de 1 250 mm2; se colocaron a una altura de 30 a 50 cm del suelo y 20 cm hacia el interior del follaje de P. menziesii var. glauca. Se determinaron dos áreas para colocarlas, en la primera se pusieron 104 (10 de marzo al 8 de septiembre de 2006) y en la segunda, 81 (7 de abril al 10 octubre de 2009); cada 16 días se cambiaron y se depositaron en cajas de preparaciones para realizar el conteo de esporas en el laboratorio de Patología Forestal de la División de Ciencias Forestales (DICIFO) de la Universidad Autónoma Chapingo, en donde se examinaron bajo un microscopio compuesto Leica (Mod. CME) con objetivo 40X.
]]>RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamientos
En total se obtuvieron 27 aislamientos de P. gaeumannii del follaje de P. menziesii var. glauca (Cuadro 1). El hongo se localizó en áreas de distribución natural del género Pseudotsuga a lo largo de los tres sistemas montañosos de México: la Sierra Madre Occidental (Chihuahua y Durango), la Sierra Madre Oriental (Nuevo León, Puebla y Querétaro) y en la Sierra Madre del Sur (Oaxaca) (Figura 1).
Síntomas para la identificación del hongo
En P. menziesii var. glauca, el hongo provoca la caída prematura de brotes jóvenes y acículas de 1 a 3 años de edad, por lo general, antes de que cambien de color; los árboles infectados se caracterizan por tener poco follaje y si la enfermedad es severa puede presentar coloración verde amarillenta, amarillenta, verde violácea o café rojiza, además de que su crecimiento se reduce hasta en 50 % (Figura 2 A). El periodo de vida de las acículas de P. menziesii var. glauca es de 7 años; sin embargo, cuando hay ataques frecuentes suelen persistir 5 años y en infestaciones severas solo permanecen las del último periodo vegetativo (Morales et al., 2012). En cualquiera de ellas se observan pseudotecios en diferentes etapas (Łakomy e Iwańczuk, 2010).
Los resultados de la microscopía, tanto de luz como electrónica de barrido, indicaron la formación de pequeñas estructuras globosas de color negro en el envés de las acículas, ordenadas en línea sobre los estomas, de los cuales emergen (Figura 2 B y C). El hongo crece y se desarrolla en la cámara subestomática y llega al exterior para formar un pseudotecio (Figura 2 D y E) que impide el intercambio de gases y la transpiración; el micelio en el tejido parenquimatoso provoca disminución de la fotosíntesis y por lo tanto, la caída prematura de las acículas (Manter et al., 2000). Los pseudotecios son negros de (44-) 65 (-96) µm de diámetro, en la base el micelio es de color café claro y se distribuye sobre la superficie; además, se interconecta con otros, lo que confirma las observaciones de Stone et al. (2008a) quienes registran anastomosis en el envés del follaje (Figura 2 D). Las ascas son hialinas, de ovoides a piriformes con ocho ascosporas (Figura 2 F), hialinas y bicelulares de (9-) 10.5 (-12) x (3-) 4 (-5) µm, con extremos obtusos en los ápices y una ligera constricción por un septo; presencia de 1 a 2 tubos germinativos (Figura 2 G y H), en los cuales una de las células es ligeramente más ancha y disminuye en tamaño hacia la base (Osorio, 2007).
P. gaeumannii crece en PDA al 2%, a 24 ± 2 °C y luz blanca constante. A los 30 días, la colonia registró 15 mm de diámetro y color verde olivo oscuro a gris claro, blanquecino en el centro y con un halo verde olivo (Figura 2 I). A los 60 días de cultivo el diámetro era de 35 mm, superficie corrugada y color negro en el reverso de la caja, así como ausencia de estructuras reproductivas. Kirk et al. (2001) no consideraron ningún anamorfo para P. gaeumannii; sin embargo, Stone y Carroll (1985) observaron células elongadas similares a fiálides con conidios que provienen de los estomas y lo identificaron como un anamorfo para este hongo. Morales et al. (2012) citan que distintos aislamientos de un mismo sitio pueden tener diferencias tanto morfológicas, como en su patrón de coloración, por lo que sugieren realizar estudios moleculares y de patogenicidad para determinar la diversidad poblacional.
Caracterización molecular
La banda de producto de PCR con los primeros ITS4 y ITS5 fue de 550 pb (pares de bases), aproximadamente. Los aislamientos ICCC, 3CEC, 5CL, 8DPP, 12DEP, 14EMAB, 16EMEZ, 17NLEP, 21NLEZ, 23OLC, 26PLJC, 27QLP, 30ORE (números de acceso GenBank JN408839, JN408840, JN408841, JN408842, JN408843, JN408844, JN408845, JN408846, JN408847, JN408848, JN408849, JN408850, JN408851) correspondieron a P. gaeumannii con 99 a 100 % de similitud, respecto a las secuencias de GenBank.
]]> Ciclo biológico y trampeo de ascosporasHay un solo periodo de liberación de ascosporas en el año, lo que significa que el ciclo biológico de P. gaeumannii comprende 12 meses y coincide con lo constatado por Stone et al. (2008a). El ciclo inicia con la liberación de ascosporas durante primavera y verano, continúa con la infección de nuevas acículas y el desarrollo asintomático del micelio en el interior de estas durante la parte final del verano, otoño y parte del invierno; lo que depende de las condiciones climáticas. Los nuevos pseudotecios se detectan desde noviembre, aunque la mayoría se reconocerán hasta febrero, marzo y abril, meses en el que los cuerpos fructíferos ya están maduros.
La liberación de ascosporas en el sitio Tres Encinos inicia a finales de marzo, pero la dispersión, como tal, ocurre entre la tercera semana de mayo y la segunda de julio, de forma que coincide con el periodo de lluvias y una temperatura promedio de 13 °C (Figura 3 A). Durante 2008 en el área semillera este parámetro se registró de mayo a agosto con una media de 17 °C (Figura 3 B); en ambos sitios la mayor dispersión de ascosporas ocurrió entre junio y julio.
En primavera y verano las infecciones causadas por P. gaeumannii dependen de las condiciones de humedad, momento que concuerda con la emergencia de brotes y elongación de las yemas jóvenes, lo que coincide con lo publicado por Stone et al. (2008b), quienes documentan que las condiciones ambientales son factores indispensables para que se presente la liberación de ascosporas en la costa de Oregon; Michael y Chastagner (1984) registraron que en Washington, inicia en abril y se prolonga hasta septiembre, con la máxima dispersión entre junio y julio. La diseminación es 10 veces mayor en follaje con acículas de 1 año, en comparación con las de 2 años de edad; además, en condiciones de laboratorio, los ascostromas hidratados sueltan 75 % de las ascosporas en 20 minutos y el contenido completo en 4 horas; para ello, se considera un intervalo de temperatura de 5 a 30 °C, el máximo esparcimiento ocurre alrededor de los 20 °C.
Los pseudotecios pueden presentarse en abundancia sobre hojas de 2 años o más, o de manera escasa en las más jóvenes; sin embargo en las plantaciones forestales de la costa de Oregon se detectó abundancia de cuerpos fructíferos en la fronda del año en curso (Hansen et al., 2000). Las ascosporas son movilizadas por el viento; aquellas que se depositan en la superficie de la acícula germinan y su micelio penetra a través del estoma hasta alcanzar el mesófilo. Stone et al. (2008a) observaron que los extremos de cada célula de la espora dan origen a una hifa hialina, y cuando tiene una longitud aproximada de 20 µm cambia a color café oscuro. También consignaron anastomosis y el efecto de la topografía de la superficie de la acícula sobre la ramificación de la hifa; que la formación del apresorio se origina en las ramas laterales cortas del tubo germinativo principal o de algún extremo de la ascospora que se encuentre cerca de un estoma; y la penetración se da por una hifa infectiva que se introduce en las células guarda y avanza en la cámara subestomática, sitio donde se desarrolla e invade intercelularmente para llegar al mesófilo.
La colonización intercelular tiene lugar durante el otoño, a partir de células del primordio que se localizan dentro del mesófilo y en la cámara subestomática y darán origen a la emergencia del cuerpo fructífero a través del estoma. En esta temporada es cuando ocurre la infestación en la superficie de la acícula, vía el micelio epifítico. En el invierno, se observan estructuras esféricas de color obscuro y al final de la estación, los pseudotecios inmaduros, con dimensiones de 50 a 70 µm de diámetro se identifican a simple vista en el envés de las acículas. Manter et al. (2005) y Stone et al. (2007) consideran que la temperatura prevaleciente en el invierno y la humedad en la primavera se correlacionan con la severidad del tizón suizo en las plantaciones de Pseudotsuga en Oregon. Stone et al. (2007, 2008b) concluyen que el incremento de las temperaturas invernales y la humedad presente en primavera, por la abundacia de lluvias, son factores epidemiológicos que influyen sobre la distribución y la severidad de la enfermedad originada por P. gaeumannii.
CONCLUSIONES
Con base en las características morfológicas y moleculares se concluye que el hongo causante de la defoliación prematura en P. menziesii var. glauca es el hongo P. gaeumannii, que tiene amplia distribución en México y en este estudio se localizó en bosques naturales de P. menziesii var. glauca de la Sierra Madre Occidental, la Sierra Madre Oriental y la Sierra Madre del Sur, lo que permite concluir que es un hongo nativo que, también, está presente en las plantaciones de árboles de Navidad del centro de México.
Los periodos de inicio y final de la liberación de ascosporas se registraron de marzo a septiembre, y alcanzó su máximo entre junio y julio, cuando prevalece una alta humedad relativa (>90 %) y temperatura de 13±1 °C en las plantaciones del Estado de México y Puebla.
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