Hongos ophiostomatoides de galerias de Dendroctonus adjunctus Blandford en Pinus hartwegii Lindl.

Ophiostomatoid fungi of galleries of Dendroctonus adjunctus Blandford in Pinus hartwegii Lindl.

Omar Alejandro Pérez Vera¹*, Dionicio Alvarado Rosales¹, David Cibrián Tovar², Armando Equihua Martínez³ y Elizabeth Cárdenas Soriano¹

¹ Programa de Fitopatología. Colegio de Postgraduados. Campus Montecillo. *Correo-e: oalejandrovera@gmail.com

² División de Ciencias Forestales (DICIFO), Universidad Autónoma Chapingo.

Fecha de recepción: 20 de agosto de 2010.
Fecha de aceptación: 23 de diciembre de 2011.

RESUMEN

Los descortezadores (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) son vectores del hongo Ophiostoma spp., causante del manchado azul de la madera que contribuye a la muerte de árboles en coníferas y angiospermas. En México, Dendroctonus adjunctus es una de las principales plagas de los bosques de pino, pero se desconocen los hongos simbiontes que introduce en sus galerías. El objetivo del presente estudio fue identificar los hongos ophiostomatoides asociados al pino de las alturas ( Pinus hartwegii ). Se colectaron 20 muestras de corteza con galerías del insecto en la Estación Forestal Experimental Zoquiapan (EFEZ) de la Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México. Las muestras se desinfestaron con hipoclorito de sodio, se colocaron en cámaras con alta humedad relativa e incubaron a 25 ± 2 °C en oscuridad durante 30 días, para el desarrollo de estructuras reproductivas. Los hongos fueron aislados en extracto-malta-agar al 2%; se hizo su caracterización morfológica y molecular, esta mediante la amplificación de la región intergénica (ITS) de los genes ribosomales rADN, con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se registraron cinco hongos: Leptographium guttulatum , Ophiostoma angusticollis , O. nigrocarpum , O. olivaceapini y Pesotum sp., con la presencia del teleomorfo y del anamorfo en el medio de cultivo. Los análisis moleculares corroboraron las identificaciones, sin embargo, O. nigrocarpum y O.angusticollis mostraron una homología con el género Sporothrix (anamorfo) en un 99% y Pesotum un 98% con Ophiostoma (teleomorfo). Las secuencias se depositaron en el Banco de Genes del NCBI.

Palabras clave: Descortezador, Leptographium guttulatum M.J. Wingf. & K. Jacobs, Ophiostoma angusticollis (E.F. Wright & H.D. Griffin) M. Villarreal, Ophiostoma nigrocarpum (R.W. Davidson) de Hoog, Ophiostoma olivaceapini (R.W. Davidson) Seifert & G. Okada, Pesotum J.L. Crane & Schokn.

ABSTRACT

Key words: Bark beetle, Leptographium guttulatum M.J. Wingf. & K. Jacobs, Ophiostoma angusticollis (E.F. Wright & H.D. Griffin) M. Villarreal, Ophiostoma nigrocarpum (R.W. Davidson) de Hoog, Ophiostoma olivaceapini (R.W. Davidson) Seifert & G. Okada, Pesotum J.L. Crane & Schokn.

INTRODUCCIÓN

Ceratocystis sensu lato Ellis & Halst. pertenecen al grupo de los ophiostomatoides e incluyen más de 110 especies de ascomicetes que presentan características morfológicas similares y están adaptados a dispersarse por artrópodos, como los insectos del género Dendroctonus (Upadhyay, 1993; Malloch y Blackwell, 1993). Varios taxa de ophiostomatoides son patógenos importantes de coníferas y angiospermas (Wingfield , 1993; Jacobs y Wingfield, 2001), otros pueden causar un manchado en troncos y en la madera recién cortada (Wingfield, 1993) o afectar cultivos como algodón, camote, cacao, café, caña de azúcar, guayaba, mango, piña, plátano, tabaco y zanahoria (Kile, 1993).

Las esporas de estos hongos se producen en las galerías de insectos y son transportadas en el exoesqueleto, micangios o aparato digestivo del descortezador (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae); dicho grupo fúngico tiene un efecto nutricional mutualista o antagonista, o bien ninguno sobre el insecto (Paine et al., 1997; Ayres et al., 2000). Se ha consignado que ayudan a matar al árbol, por la reducción de agua, azúcares y acumulación de monoterpenoides potencialmente tóxicos en el floema y xilema (Popp et al., 1995; Croisé et al., 2001).

En América del Norte y Europa se tiene identificado a Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. y O. novo-ulmi Brasier como responsables de la enfermedad del olmo Holandés (Wingfield, 1993). Leptographium wageneri var. wageneri (W. B. Kendr). M. J. Wingf. se han observado en pinos piñoneros ( Pinus monophylla Torr. & Frém y P. edulis Engelm), L. wageneri (W.B. Kendr) M. J. Wingf. var. pseudotsugae T. C. Harr. & F. W. Cobb en Pseudotsuga menziesii (Mirb) Franco y L. wageneri (T. C. Harr. & F. W. Cobb) var. ponderosum T.C. Harr. & F.W. Cobb en pinos duros ( P. ponderosa Laws., P. contorta (Balf) Critchfield y P. jeffreyi Murr). Además son los agentes causales de la enfermedad del teñido oscuro de raíces, en Estados Unidos y Canadá (Harrington, 1988; Wingfield y Knox- Davies, 1980)

En México se han registrado 17 hongos ophiostomatoides asociados con insectos que se alimentan del floema y cambium vascular: Conophthorus cembroides Woods, Dendroctonus adjunctus Blandford, D. mexicanus Hopkins, D. valens LeConte, Ips calligraphus Germar y Pseudohylesinus spp. Blandford (Marmolejo, 1991; Marmolejo y Butin, 1993; Zhou et al., 2004; Cibrián et al ., 2007; Pérez et al ., 2009).

Los taxa más frecuentes que provocan manchado en la madera son Ophiostoma piliferum (Fr.) Syd. & P. Syd. y O. ips (Rumbold) Nannf. (Marmolejo y Butin, 1993; Marmolejo, 1991; Pérez et al., 2009). Ceratocystis fimbriata Ellis & Halst. se cita como un hongo vascular en Hevea brasiliensis Muell. Arg., cuya presencia induce la muerte del árbol, o manchados en la madera recién cortada y reduce la cosecha de goma en plantaciones forestales (Cibrián et al ., 2007). Las tres especies han sido registradas como patógenas en muchas partes del mundo (Seifert,1993). Se han aislado de insectos y de sus galerías y su identificación se ha hecho con base en sus características morfológicas aunque, la ausencia del estado sexual dificulta su separación taxonómica (Zhou et al., 2001).

Las secuencias de las regiones ITS de los genes ribosomales (rADN) se han usado con éxito para determinar las relaciones filogenéticas entre los hongos ophiostomatoides, ya que la morfología de sus ascosporas es un carácter taxonómico no confiable (Hausner et al., 1993; Wingfield et al., 1994). Zhou et al. (2001) amplificaron las regiones internas ITS de los genes rRNA y con ese método identificaron a Ophiostoma pulvinisporum X. D. Zhou & M. J. Wingf. y Sporothrix sp. Hektoen & C. F. Perkins) en México. El objetivo del presente trabajo fue identificar hongos ophiostomatoides asociados a Pinus hartwegii Lindl.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo en campo

Se colectaron 20 muestras de corteza de Pinus hartwegii con galerías del insecto descortezador Dendroctonus adjunctus en la Estación Forestal Experimental Zoquiapan (EFEZ) de la Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México. El material se etiquetó, colocó en bolsas de polipapel y se trasladó al Laboratorio de Patología Forestal del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo-Texcoco, Estado de México, donde se conservaron a 4 °C hasta su posterior análisis.

Aislamiento del hongo

Las muestras se lavaron con agua destilada, se desinfestaron con hipoclorito de sodio comercial al 1.5% durante 2 min, se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se secaron con papel estéril y finalmente se colocaron en cámaras húmedas. Estas se incubaron a 25 ± 2 °C en oscuridad durante 30 días para inducir la formación de estructuras sexuales o asexuales. Las masas de ascosporas o conidios presentes en el ápice de las estructuras reproductivas se transfirieron con una aguja de disección estéril a cajas de Petri con extracto-malta-agar al 2% (EMA), cicloeximida (0.1g) y sulfato de estreptomicina (0.02g) e incubaron a 25 ± 2 °C en luz natural durante 20 días. Se transfirieron fragmentos del hongo desarrollado a cajas Petri con EMA (2%) e incubaron en las mismas condiciones del aislamiento. Los cultivos monoconidiales o monoascospóricos se realizaron en cajas Petri con agar-agua (AA) y se incubaron a 25 ± 2 °C durante 24 h. Las conidias y ascosporas germinadas se colocaron, individualmente, en cajas de Petri con EMA (2%) y se incubaron hasta que se formara la estructura sexual o asexual. Todos los aislamientos se conservaron en tubos de ensayo inclinados con EMA (2%) y cubiertos con aceite mineral.

Identificación morfológica

A partir de 10 cultivos puros (monoconidiales o monoascopóricos) en EMA (2%) a 25 ± 2 °C e incubados durante 40 días se identificaron los hongos a nivel de género con las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1972) y Hanlin (2001), y para las especies se emplearon las de Upadhyay (1981) y Jacobs y Wingfield (2001). Además, se observó la forma de crecimiento, color de la colonia, tipo de micelio, formación de estructuras reproductivas, tipo y forma de conidios o ascosporas, en las que se midieron en micras 200 ascosporas y conidios y 30 peritecios o sinemas. El seguimiento al desarrollo de conidios y tipo de ascosporas se hizo con microscopía de barrido; para ello se tomaron discos con crecimiento fungal de 5 mm de diámetro. Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 3% con amortiguador de fosfatos Sorensen 0.1M, pH 7.2, durante 24 h. Posteriormente, se lavaron tres veces con el amortiguador de fosfatos Sorensen por un minuto y se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%, las últimas tres soluciones se usaron dos veces) por 15 min. en cada cambio. Los discos se colocaron en una secadora de punto crítico de CO₂ Samdri-780A^® (TOUSIMIS Research Corporation, Rockville, EUA) a 31.1 °C y 1073 psi; enseguida, los discos se pegaron en un portamuestras de latón de 9 mm de diámetro con cinta adhesiva-conductiva de cobre y se recubrieron con oro durante 4 min en una ionizadora JFC-1100^® (JEOL LTD, Tokio, Japón). Las muestras se revisaron en un microscopio electrónico de barrido JSM-35C^® (JEOL LTD, Tokio, Japón) operado a 15 Kv en el laboratorio de Microscopia Electrónica del Colegio de Postgraduados.

Caracterización molecular

Los 10 aislamientos de hongos puros utilizados para extraer el ADN se cultivaron en matraces con 50 mL de medio líquido de extracto de malta (EM: 20 g de extracto de malta, 1,000 mL de agua destilada estéril), a una temperatura de 25 °C y oscuridad por 25 días. La extracción del ADN se hizo de acuerdo al método AP (Sambrook y Russell, 2001). Su calidad se evaluó por electroforesis en gel de agarosa al 1%. La amplificación de las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rADN), localizados entre la subunidad pequeña 18S.5.8S y la subunidad larga 5.8S-28S se realizó mediante la técnica de PCR con los iniciadores universales ITS1-F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGGAAGTAA-3') e ITS4 (5'-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3').

La mezcla de reacción de PCR estuvo compuesta de: 12.5 µL agua libre de nucleasas, 2.5 µL solución amortiguadora Buffer 1X, 2.5 µL de MgCl₂ a 2.5 mM, 0.5 µL de dNTPs a 10 mM, 0.5 µL de cada oligonucleótido, 2 U de Taq-DNA polimerasa (Invitrogen) y 2 µL de DNA (10 ng), con un volumen final de 25 µL. Se utilizó un termociclador Applied Biosystems^MR (Mod. Termal Cycler 2720) con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 59 seg; alineamiento a 55 °C por 59 seg y extensión a 72 °C por 1 min, y una extensión final de 72 °C por 8 min. (Zhou et al., 2004).

Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.0%, se tiñeron con bromuro de etidio y las bandas se visualizaron en un fotodocumentador (Bio-Imagen Systems Mini Bis Pro). Los productos de la PCR fueron tomados directamente del gel y purificados con Wizard SV (Promega, USA).

Estos últimos fueron secuenciados en ambas direcciones (5' a 3' y 3' a 5') con los mismos iniciadores ITS, en el Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México con un secuenciador Genetic Analizer 3100 (Applied Biosystem Corp). Las secuencias se compararon por alineamiento con la información disponible en la base de datos del GenBank (NCBI: National Center for Biotechnology Information), mediante el método BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamientos e identificación

Se obtuvieron 10 aislamientos de galerías del insecto descortezador Dendroctonus adjunctus de Pinus hartwegii . Se identificaron cuatro hongos a nivel especie: Leptographium guttulatum M.J. Wingf. & K. Jacobs, Ophiostoma angusticollis (E.F. Wright & H.D. Griffin) M. Villarreal, O. nigrocarpum (R.W. Davidson) de Hoog y O. olivaceapini (R.W. Davidson) Seifert & G. Okada y una del género Pesotum J. L. Crane & Schokn.

Estas características morfológicas correspondieron a las descripciones de Jacobs et al. (2001) y Jacobs y Wingfield (2001). Barras y Perry (1971) aislaron del micangio de Dendroctonus adjunctus a Leptographium sp. (Lagerb y Melin Svenska). Six y Paine (1996) identificaron por características morfológicas, secuencias de ADNmt y RFLP al hongo micangial Leptographium pyrinum R.W. Davidson asociado a D. adjunctus . L. pyrinum puede distinguirse de otras especies de Leptographium por la conidia ovoide y la presencia de material granular sobre las hifas (Jacobs y Wingfield, 2001).

Ophiostoma angusticollis registró un crecimiento radial de 26 mm de diámetro a los 15 días, a una temperatura de 26 ± 1 °C, en medio de cultivo EMA (2%); coloración blanca cremosa y al reverso de la caja de Petri, blanca (Figura 1D). Los peritecios crecen superficiales o ligeramente inmersos en el medio de cultivo a los 15 o 20 días. Su base es globosa, oscura, de (84.60-) 96.30 (-115.20) μm de diámetro. El cuello del peritecio es café oscuro a negro, de 225 a 507 μm de largo y (12.00-) 15.60 (-21.30) μm de ancho de la base. El ápice del cuello romo, más claro, de (1.85-) 3.24 (-6.30) μm de ancho e hifas ostiolares ausentes (Figura 1E). Las ascas son evanescentes. Ascosporas hialinas, unicelulares, reniformes de (2.00-) 3.50 (-4.70) × (1.0-) 1.6 (-2.0) μm (Figura 1F). La masa de ascosporas está contenida en un mucílago blanco cremoso, en el ápice del cuello del peritecio (Figura 1G). La descripción anterior concuerda con las de Olchowecki y Reid (1974), Upadhyay (1981) y Aghayeva et al. (2004).

En el micelio de O. angusticollis se observó un tipo de célula conidiogénica de apariencia denticulada, similar a su anamorfo Sporothrix y con conidios hialinos, unicelulares, ovoides, de (2.0-) 3.5 (-7.0) × (1.0-) 1.2 (-2.0) μm, con desarrollo simpodial (Upadhyay, 1981). Morfológicamente Ophiostoma angusticollis (E.F. Wright & H.D. Griffin) M. Villarreal M. Villarreal, Arenal, V. Rubio & De Troya son muy parecidos. Sin embargo, el anamorfo de O. sejunctum es Hyalorhinocladiella H.P. Upadhyay & W.B. Kendrick (Villarreal et al., 2005); además, O. angusticollis contiene la masa de ascosporas en un mucílago, a diferencia de O. sejunctum (Olchowecki y Reid, 1974). Se ha aislado O. angusticollis y otros Ceratocystis sensu lato de la cámara pupal de un cerambícido asociado con Bursaphelenchus xylophilus Steiner et Buhrer; así como, del nemátodo de la madera del pino en Pinus resinosa Aiton y P. banksiana Lamb. (Wingfield, 1987). Ophiostoma nigrocarpum presentó un crecimiento radial en medio de cultivo EMA (2%) y alcanzó un diámetro de 30 mm, a los 15 días. La coloración de la colonia fue de blanca a gris oscuro, en función la edad del cultivo (Figura 1H). Conidios unicelulares, ovoides, elipsoides a cilíndricos de (2.0-) 3.5 (-7.0) × (1.0-) 1.2 (-2.0) μm y contenidos en micelio blanco, similar al del género Sporothrix (Figura 1I). Los peritecios crecen superficiales o ligeramente inmersos en el medio de cultivo, desarrollándose a los 10 - 15 días (Figura 1J). Su base es globosa, oscura, de (188-) 107.82 (-84.6) μm de diámetro (Figura 1K). Cuello del peritecio café oscuro a negro, de 180 a 210 μm de largo y (18-) 22 (-36) μm de ancho de la base; el ápice es más claro, de (15-) 13 (-21) μm de ancho e hifas ostiolares, aceptadas, de color café claro de (1.5-) 3.2 (-3.8) μm de ancho. Ascas de tipo evanescente. Ascosporas hialinas, unicelulares, de forma lunada, de (2.90-) 3.50 (-4.90) × (1.0-) 1.6 (-2.0) μm (Figura 1K y L). La masa de ascosporas está contenida en un mucilago blanco cremoso en el ápice del cuello del peritecio. Esta descripción morfológica coincide con las de Upadhyay (1981) y Aghayeva et al. (2004)

En Ophiostoma olivaceapinii se registró un crecimiento radial en medio EMA (2%), con un diámetro de 45 mm, a los 15 días y a una temperatura de 26 ± 1 °C. La coloración de la colonia fue café claro, café oscuro en cultivos jóvenes y café grisáceo a los 30 días. El micelio inmerso de color café (Figura 2A). Conidióforos sinematosos café a café oscuro, de 480 a 560 μm de largo incluyendo el aparato conidiogénico. Sinemas solitarios o agrupados (2 a 6), de color café a café oscuro, a los 10 o 12 días (Figura 2B). Células conidiogénicas aparentemente con proliferación percurrente y anelaciones de apariencia simpodial, cilíndrica y hialina. Conidios hialinos, unicelulares, elipsoides a ovoides, de (7.64-) 4.82 (-1.97) × (5.33-) 2.65 (-1.37) μm. La masa de conidios contenida en un mucílago hialino a grisáceo en el ápice del sinema, dependiendo de la edad del cultivo. Los peritecios crecen superficiales o ligeramente inmersos en el medio de cultivo y se desarrollan a los 25 días, solitarios o agrupados (Figura 2C); base globosa, oscuros, de 190 a 200 μm de diámetro. El cuello del peritecio café oscuro a negro de 250 a 618 μm de largo sin incluir hifas ostiolares, de (20-) 26 (-38) μm de ancho de la base, de (13-) 16 (-21) μm de ancho del ápice y ápice del cuello ligeramente curvo. Hifas hialinas, de 20 a 25 μm de largo y de (1-) 1.5 (-2.0) μm de ancho. Las ascas son de tipo evanescentes. Ascosporas hialinas, reniformes (Figura 2D). Estas características concuerdan con las descripciones de Barnett y Hunter (1972); Upadhyay (1981) y Mouton et al. (1993).

Pesotum sp. (sinónimo de Graphium corda creció 80 mm en 15 días en EMA (2%), a una temperatura de 26 ± 1 °C; su coloración fue café, café olivo a gris a los 70 días, al reverso de la caja es café oscuro (Figura 2E). Micelio inmerso café y micelio aéreo hialino. Sinemas café oscuro a negro oscuro de (450.16-) 236.99 (-150.40) × (37.60-) 22.65 (-9.40) μm (Figura 2F). Célula conidiogénica percurrente, anélida, cilíndrica y hialina. Conidia holoblástica, hialina, unicelular, elipsoide a ovoide de (7.64-) 4.82 (-1.97) × (6.33-) 2.65 (-1.37) μm y la masa de conidias se acumula en el ápice del sinema (Figura 2G). La descripción anterior coincide con las descripciones de Barnett y Hunter (1972) y Upadhyay (1981).

Caracterización molecular

El producto de PCR de las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rADN) fue de 700 pb (pares de bases). Las secuencias de ZOQ2 y ZOQ8 de Leptographium guttulatum ; ZOQ5, ZOQ15, ZOQ17 de Ophiostoma olivaceapini ; ZOQ9 y ZOQ16 de O. angusticollis se alinearon con las secuencias de estas mismas especies depositadas en el Banco de Genes del NCBI (Cuadro 1), con una homología de 98 a 100%. A excepción del género Pesotum (ZOQ6) que se alineó con Ophiostoma sp. (Número de acceso: AY649781), con una homología de 98%, considerado su teleomorfo (Harrington et al., 2001). Ophiostoma nigrocarpum (ZOQ12) mostró una homología de 99% con el género Sporothrix (número de acceso AY546722). Con base en sus características morfológicas O. nigrocarpum es similar al complejo de O. stenoceras (Robak) Nannf.; sin embargo, se pueden separar por comparación de secuencias de ADN (Aghayeva et al., 2004; Zhou et al., 2004). O. abietinum (Marm. & Butin) aislado de Abies vejari (Mart.) Liu y descrito por Marmolejo y Butin (1993) se considera una forma intermedia entre O. stenoceras y O. nigrocarpum, a partir de la morfología del peritecio (De Beer et al., 2003). O. angusticollis (ZOQ13) se alineó con Sporothrix (Número de acceso: AY546722), con una homología de 99%; este género se cita como el estado asexual para O. angusticollis y O. nigrocarpum (Upadhyay, 1981).

Las secuencias de nucleótidos de los aislamientos se depositaron en el Banco de Genes del NCBI con los siguientes números de acceso L. guttulatum (HM236498 y HM236499); O. olivaceapini (HM236500, EU109670 y EU109669); Pesotum sp. (HM236501); O. angusticollis (EU109668, EU109672 y EU109671) y O. nigrocarpum (EU109667).

CONCLUSIONES

En las galerías de Dendroctonus adjunctus en la corteza de Pinus hartwegii se aislaron e identificaron morfológicamente y por análisis molecular los hongos ophiostomatoides Leptographium guttulatum , Ophiostoma angusticollis , O. olivaceapinii , O. nigrocarpum y Pesotum sp. Se registró la presencia del teleomorfo y anamorfo o ambos en el medio de cultivo. Sin embargo, O. nigrocarpum y O. angusticollis mostraron una homología con el género Sporothrix (anamorfo) en 99% y Pesotum en 98% con Ophiostoma (teleomorfo).

Wangari Muta Maathai. Dominio público.

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