Efectos de los RNAm maternos sobre la maduración del ovocito y el desarrollo embrionario temprano en mamíferos. Revisión

Effects of the maternal mRNA on the maturation of the oocyte and early embryonic development in mammals. Review

М. Eduviges Burrola-Barraza^a, Everardo González-Rodríguez^a

^a Facultad de Zootecnia y Ecología, Universidad Autónoma de Chihuahua. Perif. R. Aldama km. 1, 31453 Chihuahua, Chih. México. Teléfono 01(614)4340303, ext. 115. mburrola1@uach.mx Correspondencia al primer autor.

Resumen

Obtener ovocitos madurados in vitro, que sean competentes para fertilizarse y originar un porcentaje superior al 50 % de blastocitos viables, es una de las principales metas que existen en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. Es por ello necesario entender los procesos celulares, que desembocan en la maduración del ovocito durante la foliculogénesis y su subsecuente transición al embrión. La transición del ovocito al embrión es un proceso complejo que involucra la inactivación genómica del ovocito y la activación del genoma embrionario. Este proceso se da en bovinos en la etapa de 8 a 16 células y presenta una degradación selectiva de RNAm maternos, que fueron almacenados durante la ovogénesis y son la fuente para la codificación de proteínas en las etapas iníciales del desarrollo embrionario. La acción de los RNAm maternos es clave para que la activación del genoma embrionario se realice en tiempo y forma adecuados. Entender la participación de estos transcritos en la activación del genoma embrionario, es esencial para esclarecer los procesos celulares que fallan en los protocolos de maduración de ovocitos in vitro. Es por esto que el objetivo de esta revisión fue recopilar la información de los principales RNAm maternos que han sido identificados tanto en el modelo murino como el bovino, esto con el fin de integrar el conocimiento relacionado con los procesos genómicos que permiten el desarrollo del embrión en el bovino, y diseñar nuevas estrategias que permitan mejorar los protocolos de fertilización in vitro.

Palabras clave: Ovocito, Activación genoma embrionario, Bovino.

Abstract

Get in vitro matured oocytes that could be competent for in vitro fertilization with a result of 50 % viable blastocysts, is one of the main problems in the in vitro development of bovine embryos. For these reason, is necessary to understand the cellular processes that lead to the maturation of the oocyte during folliculogenesis and subsequent transition to the embryo. The transition from oocyte to embryo is a complex process that involves genomic inactivation of the oocyte and embryonic genome activation. This process occurs in cattle in the stage of 8 to 16 cells where there are a selective degradation of maternal mRNA, which were stored during oogenesis and are the source of protein in the early stages of embryonic development. The action of maternal mRNA is a key for that embryonic genome activation takes place in form and time. Understanding the involvement of these transcripts in embryonic genome activation is essential to elucidate the cellular processes falling in oocyte maturation in vitro protocols. The aim of this review was to gather information from maternal genes that have been isolated both in the murine model and cattle, this in order to incorporate knowledge related to genomic processes that enable the development of the embryo in cattle, and to design also new strategies to improve in vitro fertilization protocols.

Key words: Oocytes, Embryonic genome activation, Bovine.

INTRODUCCIÓN

En el campo de la reproducción animal, la identificación y caracterización de los genes que participaran en la regulación del crecimiento del ovocito y de la transición del ovocito al embrión, son requeridos para entender los mecanismos de maduración, fertilización y desarrollo embrionario de animales domésticos como el bovino^(1-3). El desarrollo potencial de un embrión depende del ovocito del cual se originó; por lo tanto el proceso de maduración por medio del cual el ovocito adquiere competencia, es crítico para generar embriones eficientes que originen individuos sanos después de ser implantados⁽⁴⁾. En los animales domésticos como el bovino, uno de los principales problemas a los que se enfrenta la fertilización in vitro es el bajo porcentaje de blastocistos viables obtenidos a partir de ovocitos madurados in vitrd^5,6). De acuerdo a la experiencia de diversos grupos de investigación^(7-9)' en los sistemas bovinos, del total de ovocitos que se someten a maduración in vitro (IVM) sólo se logra obtener aproximadamente un 40 % de blastocistos viables; lo que es muy diferente a lo observado a partir de ovocitos madurados in vivo, donde el porcentaje de blastocistos viables obtenidos es cercano al 80 % . Esto sugiere que la IVM modifica el microambiente del ovocito, al ocasionar un cambio celular y genético que impide que esta célula se desarrolle de manera normal⁽¹⁰⁾. Desde folículo primordial hasta el folículo preantral, el ovocito almacena transcritos⁽¹¹⁾, cuya traducción genera proteínas que son claves para su maduración⁽¹²⁾ y, después de ser fertilizado, para su transición hacia el embrión⁽¹³⁾.

Dado que estos RNAm se transcriben en el ovocito y permanecen hasta las primeras etapas de la embriogénesis, son denominados RNAm maternos⁽¹⁴⁾. La mayoría de los genes que codifican para este tipo de RNAm, han sido descritos en ratones (Cuadro 1) y pocos se han descrito en el bovino (Cuadro 2). Esclarecer el perfil de genes maternos que participan en la competencia y embriogénesis temprana en el bovino, es algo necesario para mejorar las condiciones de cultivo en IVM de ovocitos que eleven el porcentaje de éxito de blastocistos, que al ser implantados originen un animal sano. Es por esto que el objetivo de la presente revisión es mostrar la información conocida de los principales RNAm maternos que han sido identificados tanto en el modelo murino como el bovino, esto con el fin de integrar el conocimiento relacionado con los procesos genómicos que permiten el desarrollo del embrión en el bovino, y diseñar nuevas estrategias que permitan mejorar los protocolos de fertilización in vitro (FIV).

EFECTO DE LOS GENES MATERNOS SOBRE LA MADURACIÓN DEL OVOCITO

La ovogénesis es el proceso por el cual un ovocito crece y madura, y sucede de forma concomitante con la foliculogénesis, que es el proceso por medio del cual se desarrolla un folículo ovárico⁽¹⁵⁾. Ambas etapas se inician en la vida fetal; para ello las células germinales primordiales del saco vitelino migran hacia las gónadas en formación. Una vez ahí, las células germinales primordiales se multiplican por mitosis y forman grupos de ovogonias conectadas entre sí por interacciones citoplásmicas, que al asociarse con células pregranulosas planas dan origen a los folículos primordiales⁽¹⁶⁾. Los ovarios neonatos de la mayoría de los mamíferos, están poblados por este tipo de folículos en un rango de 100,000 a 400,000 folículos/hembra⁽¹⁷⁾. Cada folículo primordial consta de un ovocito primario detenido en la profase de meoisis I en la etapa de diploteno, que se rodea de una capa sencilla de células pregranulosas⁽¹⁸⁾. Durante el transcurso de la vida reproductiva de la hembra, un cohorte de folículos primordiales son reclutados continua y cíclicamente a partir del conjunto de folículos primordiales en reposo para crecer y diferenciarse⁽¹⁵⁾, de estos, más del 99.9 % no son utilizados debido a la atresia^(15,19). El inicio de la foliculogénesis se caracteriza por la transición de células pregranulosa planas a cuboidales de la granulosa, que dan lugar al folículo primario. En este punto, se da una transformación epiteloide de las células estromales que rodean al folículo y se generan las células de la teca⁽¹⁵⁾. Estas células quedan separadas de las células granulosas por una membrana basal y es en este espacio donde se forman capilares sanguíneos y linfáticos⁽²⁰⁾. En este momento, las células de la granulosa proliferan y se arreglan en múltiples capas concéntricas alrededor del ovocito, el cual comienza a aumentar de tamaño, dando así lugar al folículo secundario. En esta fase, el ovocito inicia la síntesis de la zona pelúcida, que es una capa extracelular de glicoproteínas conformadas por ZP1, ZP2 y ZP3⁽²¹⁾. Hasta aquí comprende la fase preantral que dura aproximadamente el 85 % del tiempo total de la foliculogénesis⁽¹⁵⁾.

A medida que proliferan las células foliculares y el ovocito alcanza mayor tamaño, entre las capas de las células de la granulosa se forma un espacio lleno de líquido denominado antro, el cual contiene una mezcla compleja de proteínas, hormonas y iones⁽²²⁾. Aquí comienza la fase antral, conformada por la presencia del folículo terciario o de Graaf⁽⁴⁾, donde los ovocitos alcanzan un mayor tamaño y las células granulosas se diferencian en dos subpoblaciones: células cumulares y células murales. Las células murales que se localizan en capas por debajo de la membrana basal, recubren la pared interna del folículo y se encargan de llevar a cabo las funciones endocrinas, incluida la esteroidogénesis⁽¹⁵⁾. Las células cumulares que rodean al ovocito, forman el complejo cúmulos-ovocito (COC), donde a través de una comunicación bidireccional promueven el crecimiento y la maduración del ovocito⁽²³⁾. Dentro del COC, el ovocito arrestado en la profase de la meiosis I es estimulado por la hormona luteinizante (LH), por lo que reanuda la meiosis, se libera el primer cuerpo polar, y es aquí donde sucede la primera división meiótica, y progresa a metafase II⁽⁴⁾, donde de nuevo detiene su desarrollo; en ese punto se considera ya un ovocito maduro y competente para ser fertilizado⁽²⁴⁾. En bovinos, la exhibición de competencia meiótica no ocurre hasta la etapa de folículo antral, cuando el diámetro del ovocito es mayor que 100 μm⁽⁴⁾.

Inactivación/Activación de los RNAm maternos

En mamíferos como el ratón, durante la maduración meiótica, aproximadamente 12 h antes de la ovulación, la transcripción en el ovocito comienza a ser inactiva; en este momento el único soporte de proteínas proviene de los RNAm almacenados en las etapas iniciales de la ovogénesis, y muchos de los RNAm almacenados comienzan a activarse y a ser traducidos⁽²⁵⁾. En organismos como Xenopus y Drosophila, está bien demostrado que durante la ovogénesis existe un proceso regulado que mantiene a los RNAm inactivos durante la etapa de crecimiento y activos cuando el ovocito empieza a madurar^(27-30). Tanto en el modelo de ratón⁽³¹⁾ como de Xenopus⁽³²⁾, además de la señal de poliadenilación (5'AAUAAA'3) ubicada en la región no traducida '3 (UTR'3) del RNAm, está presente la secuencia consenso (5'UUUUUAU'3) denominada elemento de poliadenilación citoplásmica (CPE), la cual es reconocida por la proteína de unión a CPE (CPEB). En Xenopus el estado inactivo de los RNAm maternos está mediado por la proteína CPEB, que interacciona al mismo tiempo tanto con la caja CPE en el extremo 3'UTR del RNAm materno, como al factor de inicio de la traducción 4E (eIF4E), que al no unirse al complejo de inicio de la traducción 4F (eIF4F) inhibe la traducción; por otro lado, la interacción CPEB/CPE ocasiona que el complejo proteico CCR4/NOT empiece a degradar la cola de poliadeninas⁽²⁹⁾. Una vez que la meiosis se reactiva y el proceso de maduración del ovocito inicia, la activación de los RNAm maternos se da a través del proceso de poliadenilación citoplásmica⁽³³⁾. Durante la maduración meiótica, la cinasa aurora (Eg2) fosforila la CPEB; de esta forma fosforilada CPEB se une a la proteína Maskin, por lo que se libera eIF4E, el cual puede ir y conformar el complejo eIF4F, dando lugar a la traducción⁽³⁴⁾. En ovocitos bovinos y porcinos, la unión de eIF4E al complejo eIF4F se relaciona con un aumento en la fosforilación de eIF4E y es un indicativo de que el ovocito está en metafase II^(35,36). Además, este proceso promueve la unión del factor específico de la poliadenilación citoplásmica (CPSF) con la secuencia 5'AAUAAA'3; que a su vez permite que la proteína embrionaria de unión de adeninas (ePAB) adicione adeninas al UTR'3, lo que provoca que el UTR'5 se estabilice para la correcta traducción del RNAm^(37-41). En ratón la expresión de ePAB se presenta en la profase I y metafase II de ovocitos y en embriones de 2 a 4 células, ya que se activa el genoma embrionario; esta expresión es suprimida, y debido a esto es considerada un RNAm materno⁽⁴²⁾.

Papel de los RNAs pequeños durante la ovogénesis

Como su nombre lo indica los RNAs pequeños, son pequeños oligonucleótidos con una longitud aproximada de 18 a 24 bases, que hibridan con el 3'UTR de un RNAm para promover su degradación⁽⁴³⁾. En los ovocitos de Zebrafish^(44,45), ratón^(46,47) y bovino⁽⁴⁸⁾, abundan RNAs pequeños, conocidos como microRNAs (miRNAs) y los RNAs pequeños de interferencia endógena (endo-siRNAs).

Los miRNAs están codificados dentro de regiones intergénicas⁽⁴⁹⁾ y dentro de regiones intrónicas⁽⁵⁰⁾. Los que están codificados en regiones intergénicas se expresan bajo la acción de la RNApol II y se denominan pri-miRNAs (miRNA primario), estos son procesados por un complejo ribonucleico proteico, compuesto por la enzima DROSHA y la proteína DGCR8 que cortan al pri-miRNA y lo dejan en estructura de tallo burbuja^(51,52). Los miRNAs que se encuentran codificados en regiones intrónicas se expresan de acuerdo al gen donde se encuentren, formando lo que se conoce como Mirtron y son liberados durante el empalme de exones en forma de tallo burbuja⁽⁵³⁾. Sea cual sea la vía de procesamiento del tallo-burbuja, el resultado es el mismo, un precursor de miRNA (pre-miRNA) con estructura tallo-burbuja, el cual pasa al citoplasma a través de la proteína EXPORTINA5, donde es cortado por DICER, una RNasa III, para obtener 2 miRNAs de aproximadamente 20 pb. Una de las cadenas se selecciona para funcionar como un miRNA maduro, mientras que la otra cadena es degradada^(50,53,54). En ocasiones, las dos hebras de la horquilla del pre-miRNA dan lugar a dos miRNAs maduros⁽⁵¹⁾. Para continuar con el procesamiento, los miRNAs son ensamblados en un complejo de ribo nucleoproteínas llamado complejo de silenciamiento inducido por miRNA (RISCs) conformado por proteínas de la familia de las Argonautas. Una vez que los miRNAs son ensamblados en el RISCs, los nucleótidos de la posición 2 al 8 en el extremo 5' del miRNA participan en el reconocimiento del extremo 3'UTR del RNAm blanco para promover que las proteínas AGO repriman la expresión del RNAm blanco, de forma tal que, si el acoplamiento es completo se induce una degradación endonucleótica, o bien, si el acoplamiento es desigual se inhibe la traducción y se promueve una degradación por exonucleasas⁽⁵⁵⁾.

Los endo-siRNAs se derivan de un RNA de doble cadena (dsRNA) resultado de la hibridación de dos cadenas independientes de RNA, lo cuales son el resultado de la expresión de pseudogenes⁽⁵⁶⁾, transposones⁽⁵⁷⁾ y retrotransposones⁽⁵⁸⁾. Una vez que se genera la dsRNA, ésta es exportada al citosol, donde es procesada por la enzima Dicer, generándose múltiples endo-siRNAs de tamaños de 21 nucleótidos que son ensamblados en RISCs acoplados a la Ago2^(56,59) y siguen el mismo proceso que el mencionado para el caso de los miRNAs.

Murchinson et al⁽⁶⁰⁾ y Tang et al⁽⁴⁶⁾ realizaron estudios con ovocitos provenientes de ratones dicer-/- y encontraron que estos gametos sufrían un arresto meiótico debido a un defecto en el huso mitótico, que provocaba una total desorganización de los cromosomas en el ecuador de la célula. En los experimentos de Tang et al⁽⁴⁶⁾ se demostró que hay una gran cantidad de miRNAs en el ovocito maduro, mismos que disminuyen abruptamente en el estadio embrionario de dos células; además se observó que estos embriones detenían su desarrollo y no progresaban al estadio de cuatro células. De la misma manera, Murchinson et al⁽⁶⁰⁾ llegan a la conclusión de que dicer es requerido para que se culmine el proceso de meiosis I y se de paso al arresto del ovocito en metafase II. Además de lo anterior, ambos autores demostraron por medio de microarreglos, que hay una sobre expresión de RNAm materno en ovocitos y embriones dicer-/-^(46,60). Dado que dicer es quien genera tanto los miRNAs como los endo-siRNA, no quedaba claro si la maduración meiótica en el ovocito estaba relacionada con la acción de ambos RNAs pequeños o sólo por alguno de ellos. Esto quedó aclarado por Suh et al⁽⁵²⁾ quienes demostraron que ovocitos de ratones dgcr8-/- no mostraban ninguna anomalía en la organización del huso mitótico; por el contrario cuando estos fueron fertilizados, los embriones mostraron un desarrollo normal hasta la etapa de blastocisto. Además no hubo diferencias significativas en la expresión de RNAm maternos entre ovocitos dcgr8-/- y ovocitos normales. Ya que DGRC8 es la enzima que genera el pri-miRNA⁽⁵¹⁾, el estar ausente significa que no habrá estructuras tallo-burbuja para ser procesadas por DICER, por lo tanto no habrá miRNAs. Estos resultados implicaron que si los miRNAs no son los responsables del fenotipo observado tanto en ovocitos como en embriones dicer-/-, esto podría ser resultado del efecto de los endo-siRNA⁽⁵²⁾. Ma et al⁽⁴⁷⁾ encontraron que los 3'UTR de los transcritos maternos sobre expresados en ovocitos dicer-/-, no presentaban secuencias de reconocimiento para miRNAs; así mismo al microinyectar, en ovocitos normales inmaduros y maduros, reporteros con UTR'3 con secuencias blanco para los miRNA let-7 y miR30, no hubo ninguna disminución del gen reportero, lo que indicó que la vía de degradación por miRNA estaba suprimida. Con todos estos estudios es claro que los miRNAs a pesar de estar presentes en el ovocito, no forman parte en la regulación del proceso de maduración del mismo, esto es intrigante dado que desaparecen después de la fertilización una vez que se activó el genoma embrionario^(52,61).

EFECTO DE LOS RNAm MATERNOS SOBRE LA EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA

Si bien el espermatozoide aporta el genoma masculino, el inicio del desarrollo embrionario depende casi en su totalidad de los componentes proteicos, derivados de la traducción de genes maternos presentes en el ovocito al momento de la fecundación⁽¹¹⁾. Estos componentes son utilizados en las primeras divisiones y son clave para que se dé una adecuada activación, en espacio y tiempo, del genoma embrionario, lo que involucra su participación durante el establecimiento de la epigénesis y durante la preimplantación del embrión⁽⁶⁶⁾.

Efecto materno sobre la epigénesis

Para que el desarrollo embrionario suceda de forma adecuada, se requiere que tanto el genoma materno como el paterno sean debidamente expresados. En los mamíferos, la mayoría de los genes son expresados en ambos alelos parentales de forma bialélica, los pocos que son transcritos de una forma monoalélica están relacionados con la epigénesis. La reprogramación epigenética se define como cualquier alteración meiótica o mitótica sobre el DNA, que no resulta en un cambio en su secuencia, pero que tendrá un impacto significativo sobre el desarrollo del organismo⁽⁶⁷⁾. Durante la gametogénesis tanto el genoma haploide femenino como masculino sufre un proceso de epigénesis conocido como impronta genética (del inglés genomic imprinting) que consiste en metilar secuencias dinucleotídicas CpG, lo que directamente se relaciona con la represión genética⁽⁶⁸⁾. La impronta genética se da en regiones de control de impresión (ICR) cuyas metilaciones se establecen de manera sexo específica en las células germinales y deben conservarse durante todo el desarrollo embrionario⁽⁶⁹⁾. Cerca de 100 genes impresos han sido identificados en los mamíferos, la mayoría se encuentran agrupados y su expresión es dirigida por la metilación ICR, las cuales son regiones diferencialmente metiladas entre el genoma de ambos gametos^(69-71). Queda claro que el proceso de epigénesis es esencial para que se lleve a cabo un correcto desarrollo embrionario. Dentro de este mecanismo, los RNAm maternos juegan un papel crucial para que el proceso de metilación se realice en forma y tiempo adecuado⁽¹¹⁾.

La mayoría de los factores maternos que participan en la regulación de la epigénesis embrionaria se han descrito en el modelo del ratón (Cuadro I), muchos de los cuales están ya bien caracterizados con una función muy definida. DNMT3a y su cofactor DNMTL3, son proteínas maternas requeridas en el establecimiento de la impronta génica en células germinales femeninas^(72,73). DNMTL3 se une al residuo desmetilado en la lisina 4 de la histona H3, lo que provoca que DNMT3a metile de novo las secuencias ICRs maternas. Ovocitos de ratón con alguno de estos dos genes eliminados, muestran una hipometilación en los sitios ICR. Estos ovocitos al ser fertilizados generan embriones con un desarrollo aberrante mostrando expresión de genes no metilados, cuya expresión es nula en los embriones normales donde si están metilados, el resultado final de este proceso es la muerte del embrión en el día embrionario 9.5 a 10.5 con malformaciones relacionadas con defectos en el cierre del tubo neural^(72,73). Antes del proceso de fertilización, el DNA de ambos gametos está muy compactado e hipermetilado, el DNA masculino está empaquetado en protaminas, mientras que el DNA del ovocito lo está en histonas⁽⁷⁴⁾. Una vez que se lleva a cabo la fecundación, la membrana del espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática del ovocito y el núcleo espermático es depositado en el citoplasma del ovocito⁽¹¹⁾. En este punto se generan dos pronúcleos, uno femenino y otro masculino, donde ambos genomas altamente especializados deben combinarse, integrarse y reprogramarse, para permitir la pluripotencia y el desarrollo embrionario.

Después de la fertilización, el genoma masculino se somete a una descondensación y es reempaquetado con histonas presentes en el citoplasma del ovocito⁽⁷⁵⁾. Una vez que ambos genomas haploides se encuentran empaquetados con histonas, comienza la replicación del DNA de forma independiente en cada pronúcleo. En este punto del desarrollo embrionario, los niveles de transcripción son bajos, siendo más altos en el pronúcleo masculino que en el femenino. Las histonas que empaquetan el genoma masculino están más acetiladas que las encontradas en el pronúcleo femenino⁽⁷⁶⁾, además el DNA masculino está más metilado⁽⁷⁷⁾. HR6A, es una proteína materna que está implicada en la reparación y la modificación de histonas; ovocitos provenientes de ratones que son deficientes de esta proteína, pueden ser fertilizados, pero los embriones resultantes son arrestados en embriones de 2 células⁽⁷⁸⁾. NPM2, es una proteína materna nuclear identificada en la rana Xenopus, la cual está relacionada con el proceso de descondensación del DNA espermático⁽⁷⁹⁾. Embriones de ratones npm2-/- presentan un arresto en la etapa de cigoto mostrando severos daños en la heterocromatina a nivel de la desacetilación de histonas⁽⁸⁰⁾.

Dentro de las primeras horas post-fertilización, el genoma masculino sufre una desmetilación muy activa que involucra la acción de la proteína citidina deaminasa AID⁽⁸¹⁾, que provoca una pérdida abrupta de los metilos presentes en el DNA, esto sucede durante el primer ciclo de división celular⁽⁸²⁾; este proceso ha sido confirmado en mamíferos como ratón^(83,84) y bovinos^(85-87). La desmetilación del genoma paterno está mediada por la oxidación de 5 metilcisoticina (5mC) a 5-hidromethilcitosina (5 hmC)⁽⁸⁸⁾, cuya reacción esta catalizada por una enzima proteica de origen materno denominada Tet metilcytocina dioxygenasa 3 (TET3)⁽⁸⁹⁾. tet3 es un gen que se expresa predominantemente en ovocitos; dicha expresión persiste después de la fertilización en el cigoto y es abatida durante el estadio de dos células⁽⁸⁸⁾. Embriones de ratón tet3-/- muestran que hay pérdida de desmetilación en el pronúcleo masculino en la etapa de cigoto⁽⁸⁹⁾; esto coincide con los resultados obtenidos por inmunofluorescencia, donde se observa que esta proteína está enriquecida en el pronúcleo masculino de embriones de ratón normales⁽⁸⁹⁾.

GSE es una proteína materna que se expresa desde el ovocito inmaduro hasta la etapa de blastocisto, aunque la abundancia de esta proteína disminuye a partir de este estadio^(90,91). En el cigoto la proteína GSE se encuentra de forma preferencial en el pronúcleo masculino unida a la cromatina⁽⁹¹⁾. Embriones de ratones deficientes de GSE mostraron una significante disminución de la cantidad de 5hmC y un aumento en 5mC en el pronúcleo masculino; donde el pronúcleo femenino no mostró ninguna diferencia con el cigoto normal⁽⁹¹⁾. Estos resultados abren la posibilidad de que el proceso de desmetilación en el genoma masculino es debido a que GSE se une a la cromatina, y actúa en sincronía con la enzima TET3 para oxidar 5mC a 5hmC. Al mismo tiempo, a diferencia del genoma paterno, en el genoma materno la desmetilación sucede de forma paulatina a través de varios ciclos de división celular⁽⁹²⁾. Esto es debido a que la proteína materna STELLA, también conocida como PGC7, protege al DNA de la desmetilación, impidiendo la oxidación de 5mC a 5hmC⁽⁹³⁾. STELLA está presente en las células primordiales germinales y su función es requerida para el desarrollo embrionario^(94,95), se une a la proteína Ran de unión 5 y es transportada hacia el núcleo, donde se une a la lisina 9 de la histona 3 en la cromatina materna, lo que reduce la unión de la enzima TET3, lo que implica los sitios de 5mC sin oxidarse^(92,96). Ovocitos stella-/- tienen una metilación normal en los ICRs, pero los embriones derivados de ellos están hipometilados en dichas regiones, tanto en el genoma materno como paterno⁽⁹²⁾, y específicamente el pronúcleo femenino presenta una pérdida global de la metilación, que por ensayos de inmunofluorescencia se ha relacionado con la de la enzima TET3 presente en este pronúcleo, lo que no se observa en los embriones normales^(69,93). Al pasar de cigoto a embrión de 2 células, la mayor parte del genoma masculino está desmetilado y sólo persisten metilados los ICRs de expresión monoalélica, en el caso del genoma materno las regiones ICRs permanecen metiladas debido a la protección brindada por STELLA; sin embargo en el genoma paterno dada la velocidad que se da en el proceso de desmetilación, el mantener las regiones ICRs metiladas es un problema, el cual es resuelto gracias a la acción de la proteína materna TRIM28⁽⁹⁷⁾. Ya para el estadio de mórula, la mayor parte de todo el genoma, independientemente de su origen, debe de estar desmetilado y las únicas señales de metilación que deben estar presentes son las correspondientes a los ICRs de expresión monoalélica específicos de cada genoma haploide^(77,98).

Después de esto, ya en el estadio de blastocisto, la metilación comienza a volverse activa, de forma tal que se observa más metilación en las células de la masa celular interna que dan origen al embrión, que en las células del trofoectodermo que da origen a la placenta⁽⁶⁸⁾. El mantenimiento de la metilación de los ICRs, es punto clave para que el desarrollo embrionario ocurra de manera adecuada; en este proceso intervienen diversas proteínas, la mayoría de ellas con actividad de metiltransferasas y con un origen de expresión materno. DNMT1o proviene de la expresión de un RNAm materno de forma específica en el ovocito⁽⁹⁹⁾, es una DNA metiltransferasa responsable del mantenimiento de la metilación en los ICR a lo largo de la embriogénesis temprana, previo a la implantación del blastocisto. En embriones de ratón, derivados de ovocitos dnmt1o-/-, presentan la mitad de la regiones ICRs metiladas en embriones de 9.5 días a diferencia de los embriones normales, los que tienen completado este proceso⁽¹⁰⁰⁾. Otro RNAm con efecto materno es zfp57, el cual codifica para un factor de transcripción requerido para el establecimiento de la metilación a nivel de la línea germinal y además participa en el mantenimiento de los patrones de metilación en la embriogénesis temprana. Embriones a los que se les eliminó este gen presentan una pérdida total de los patrones de metilación y mueren en la etapa de cigoto⁽¹⁰⁾.

Efecto materno sobre la activación del genoma embrionario

Una vez que sucede la fertilización, durante la transición ovocito a embrión, comienza una degradación masiva de los RNAm maternos, lo que es clave para que se dé una adecuada activación del genoma embrionario^(25,101). En Zebrafish, Xenopus y ratón este mecanismo se da debido a que sucede una desadenilación del extremo 3'UTR del RNAm promovida por el complejo CCR4/NOT, que a su vez fue activado por su unión con la proteína GW182, que a su vez interacciona con el RISCs vía miRNA o endo-siRNA^(102,103). La acción de miRNAs sobre la degradación de RNAm maternos ha quedado clara en embriones del Zebrafish, donde se observa que el miR430 es abundante en el punto de la activación embrionaria, justo en el momento en que sucede la degradación de los transcritos maternos⁽⁴⁴⁾. Estudios recientes han demostrado que en el bovino, RNAm maternos como NOBOX y NPM2 son regulados bajo la acción de los miR-181a y miR196a, respectivamente^(104,105). Es importante señalar que la vía de degradación mediada por los miRNAs está presente sólo durante la activación del genoma embrionario, y se encuentra ausente durante la ovogénesis y en las etapas iniciales del embrión^{(47,52,54,106)}.

La activación del genoma embrionario requiere la remodelación de la cromatina, donde se reestructuran o mueven los nucleosomas con regiones a ser transcritas. De las proteínas mejor caracterizadas encargadas de este proceso destacan la SWI/SNF (descrita primeramente en levaduras), ISWI (descrita en Drosophila), CHD (Descrita en Xenopus) y la INO88 (descrita en levaduras)⁽¹⁰⁷⁾. brg1 es un transcrito materno de ratón que codifica para un componente de la familia de proteínas SWI/ SNF, encargadas de los procesos de remodelación de la cromatina durante la activación del genoma embrionario. Embriones de ratones brg1-/- se arrestan en el estadio de 2 a 4 células⁽¹⁰⁸⁾.

Después de la remodelación de la cromatina, el genoma embrionario comienza a ser accesible a la acción de factores de transcripción, que son de origen materno. HSF1, es un factor de transcripción que actúa como un gen maestro regulando la expresión de genes inducibles al estrés, y es altamente expresado en ovocitos de ratón. Aunque su expresión no está limitada a los ovocitos, hembras deficientes de este gen tienen defectos a nivel de la meiosis⁽¹⁰⁹⁾ y los embriones derivados de los ovocitos de estas hembras son arrestados en cigotos⁽¹¹⁰⁾. Basonuclina1, codificada por el RNAm materno bnc1, es un factor de transcripción con dominios de dedos de zinc, abundante en células germinales; actúa sobre la transcripción mediada por las enzimas RNA polimerasas I y II. Ovocitos de ratón con este gen eliminado, presentan defectos en la ovogénesis, fertilización y en la transición ovocito-embrión⁽¹¹¹⁾. Otro factor de transcripción de origen materno, es la proteína CTCF, que está implicada con la regulación del genoma a nivel epigenético, incluyendo la inactivación del cromosoma X en células madre embrionarias; su ausencia está relacionada con defectos a nivel de la meiosis y durante la preimplantanciación del embrión⁽¹¹²⁾.

Posterior a la fertilización, el cigoto generado a partir de la conjugación de los dos pronúcleos haploides, ya con el genoma reprogramado, adquiere totipotencia, que es la capacidad de estas células de formar un organismo completo a partir de los tres linajes embrionarios: endodermo, ectodermo y mesodermo⁽¹¹⁾. OCT-4, es una proteína materna cuya acción se relaciona con el proceso de transición del ovocito al embrión, el gen oct-4 es expresado durante la ovogénesis, su expresión persiste hasta embriones de dos células y su eliminación provoca un arresto durante la formación del cigoto⁽¹¹³⁾. Es importante aclarar que la forma materna del gen oct-4, es diferente a la forma expresada de este gen en la ICM en el blastocisto del embrión; esta forma de expresión conduce al fenotipo de pluripotencia en las células madre embrionarias^(114,115), en otras palabras el RNAm de oct-4 expresado durante la ovogénesis desaparece antes de la activación del genoma embrionario; después de esto, el embrión activa su propia maquinaria de trascripción y es cuando expresa su propio RNAm de oct-4 que es específico de la ICM. Un factor de transcripción materno más relacionado con pluripotencia, es SOX2, el cual al igual que OCT-4, es altamente expresado en ovocitos y atraviesa el núcleo de los embriones de dos células, donde se mantiene hasta la etapa de blastocisto, encontrándose en el núcleo de las células de la ICM, mientras que se redistribuye en el citoplasma de células del trofoectodemo. Su expresión embrionaria no es detectada hasta el estadio de mórula, y embriones deficientes del gen sox2 no sobreviven pasada la implantación temprana⁽¹¹⁶⁾.

Efecto materno sobre la degradación de RNAm maternos

Como ya se mencionó, después de la activación del genoma embrionario la mayoría de los RNAm maternos son degradados. Este mecanismo es llevado a cabo irónicamente por proteínas de origen materno. Las proteínas DICER y AGO2 son de origen materno y actúan en el procesamiento de los microRNAs⁽⁵¹⁾. Ovocitos murinos Dicer-/- son incapaces de completar la meiosis debido a un defecto en la organización del huso mitótico que conlleva a una mala migración de los cromosomas en el ecuador de la célula^(11,60). Por su parte la pérdida del gen ago2, ocasiona un arresto en embriones de dos células⁽¹¹⁷⁾. Otro gen implicado en la degradación de detritos maternales es zfp3612 quien codifica para una proteína con dominios de dedos de zinc, la cual está involucrada en la promoción de la degradación de RNAm al unirse a los elementos AU en el UTR'3 de RNAm blancos; embriones de ratones deficientes de este gen, son incapaces de pasar más allá del estadio de dos células⁽¹¹⁸⁾. ATG5, es una proteína materna, relacionada con los procesos de degradación por autofagia en los lisosomas; embriones derivados de ovocitos de ratones atg5-/- no pasan más allá del estadio de 4 a 8 células⁽¹¹⁹⁾. Esto coincide con lo encontrado en el modelo porcino, donde se demostró que el proceso de degradación de RNAm maternos está relacionado con el proceso de autofagia en embriones tempranos previo a la activación del genoma embrionario⁽¹²⁰⁾. El trabajo de Xu et al⁽¹²⁰⁾ no indica si este proceso de autofagia actúa después de la acción de los miRNAs, sólo muestra que al adicionar el inhibidor de autophagia 3-metiladedina a cultivos embrionarios tempranos, la expresión de RNAm maternos como c-mos, gdf9 y bmp15 permanece aún en estadios embrionarios de 4 células. Sería interesante dilucidar si las vacuolas autofagocíticas se conforman con los detritos de RNAm maternos.

Después de la fertilización, una vez que los cromosomas están empaquetados en histonas y que el genoma ha sido replicado, ocurre la singamia. En este momento, tanto el pronúcleo femenino como el masculino se encuentran muy próximos el uno del otro, de forma tal que ambas membranas nucleares comienzan a interdigitarse. Posterior a esto, la membrana nuclear se rompe dando oportunidad para que los microtúbulos del huso mitótico se unan al centrómero de los cromosomas y se lleve a cabo la primera división mitótica⁽¹¹⁾. En ratón, ya como cigoto o embrión de 1 célula, la transcripción empieza a activarse y la síntesis de nuevas proteínas se observa antes del estadio de dos células, dando lugar a la activación del genoma embrionario^(121,122). Este proceso dependiendo de la especie, ocurre en diferentes etapas del desarrollo embrionario, para los bovinos la activación ocurren en el embrión de 8 a 16 células⁽¹²³⁾, a diferencia del ratón que ocurre en la etapa de 2 células⁽¹²⁴⁾, mientras que en Xenopus sucede en la etapa de gástrula media⁽¹²⁵⁾; en el caso del humano la activación del genoma embrionario ocurre durante la etapa del embrión en 8 células⁽¹²³⁾. Durante este mecanismo se ha observado que la acción de la proteína materna ZAR-1 es importante para que la singamia se dé en forma adecuada. ZAR-1, es una proteína citoplasmática de origen materno altamente conservada en diversas especies como el zebrafish, humano, cerdo y bovino^(126-129). Su ausencia está relacionada con defectos en el proceso de singamia observándose un arresto embrionario en el estadio de 1 célula⁽¹³⁰⁾.

Existe un grupo de proteínas maternas que son agrupadas en la parte subcortical del embrión y, al menos en el ratón, están relacionadas con la progresión del cigoto a embriones de dos células. Las proteínas que componen este grupo son MATER⁽¹³¹⁾, FLOPED⁽¹⁰⁾, TLE6⁽¹⁰⁾, FILIA ⁽¹³²⁾ y PADI6⁽¹³³⁾. La ausencia de cualquiera de estas proteínas no afecta el desarrollo del folículo ovárico ni el desarrollo de células germinales; sin embargo, la ausencia de cualquiera de ellas, produce individuos aparentemente normales pero estériles, las hembras producen ovocitos capaces de ser fertilizados, pero durante el desarrollo embrionario no sucede la formación del complejo subcortical materno, y los fenotipos observados en embriones deficientes de los genes que codifican para algunas de estas proteínas, presentan arrestos en embriones de dos células(10,131,134,135).

RNAm MATERNOS EN EL BOVINO

Durante la fase de crecimiento los ovocitos bovinos sintetizan una gran cantidad de RNAm, esto se observa a partir del folículo secundario y es mantenida hasta el folículo terciario^(136,137). En otras palabras, en el sistema bovino la transcripción de RNAm empieza a decaer cuando el ovocito termina su crecimiento y reactiva la meiosis II rumbo a metafase II⁽¹³⁸⁾. Así mismo este proceso es mediado por la desadenilación del extremo 3'UTR del RNAm, a través de la acción de proteínas como CPEB y eIF4G⁽¹³⁹⁾. Se ha demostrado que los ovocitos maduros presentan RNAm con colas de poliadeninas más cortas que en aquellos ovocitos que son inmaduros; sin embargo estos RNAm con colas largas de adeninas, después de la fertilización en el estadio de 2 células son eliminados⁽¹³⁷⁾. En el bovino el almacenaje de RNAm maternos durante la ovogénesis es necesario para que se lleve a cabo un correcto desarrollo embrionario⁽¹³⁷⁾. A la fecha, en el bovino se han descrito pocos factores maternos (Cuadro 2), dentro de los que destacan DICER, DROSHA, NMP2, MATER, ZAR1, NOBOX, ALPHA8, JY1 y DMT1.

Burrola-Barraza et al^(60,140) y Mondou et al⁽¹⁴¹⁾ al analizar el patrón de expresión del gen DICER y DROSHA, respectivamente, en ovocitos inmaduros y maduros, así como en los diferentes estadios embrionarios tempranos, encontraron una expresión muy similar a la ya reportada en el ratón, la cual consistió en un incremento de la expresión en ovocitos maduros que se mantuvo sin cambios hasta embriones de 2 a 8 células, para luego disminuir significativamente en embriones de 16 células y reactivarse en la etapa de blastocisto. Esto pudiera implicar que DICER y DROSHA participan durante la maduración del ovocito en la represión genética vía miRNAs, y es necesaria en los estadios previos a la activación del genoma embrionario, donde es reprimida⁽⁶⁰⁾. Así mismo, la expresión del gen MATER ha sido detectado en los ovocitos de folículos primarios, disminuyendo fuertemente durante la maduración, así como durante la división embrionaria, encontrándose mínima en mórula y blastocisto⁽¹⁴²⁾. ZAR1, a diferencia del ratón donde sólo se ve en ovario, cigoto y embrión de 2 células, en el bovino adulto se encuentra en ovario, testículos, músculo, esqueleto y miocardio. También se expresa en el ovocito, cigoto y en todos los estadios embrionarios hasta la formación del blastocisto⁽¹²⁹⁾. Su nivel de expresión es constante en embriones desarrollados in vitro, a excepción del estadio de 4 células donde hay un aumento significativo, por lo tanto la traducción de este gen sucede durante esta etapa de desarrollo del embrión, lo cual indica que se encuentra presente en el bovino, pero su patrón de expresión es diferente a la del ratón⁽¹²⁶⁾.

Otro factor materno involucrado en el desarrollo embrionario de bovinos, es la importina alfa 8 (KPNA7), la cual pertenece a la familia de importinas alfa, que son transportadores proteicos encargados de transportar proteínas nucleares como la proteína DNMT1⁽¹⁴³⁾ y factores de transcripción como Stat3⁽¹⁴⁴⁾. La expresión del mensajero que codifica para KPNA7, es abundante en ovocitos inmaduros y en ovocitos en metafase II, así como en embriones en estadios tempranos antes de la activación del genoma embrionario, pero es apenas detectable en mórula y blastocisto; además embriones con el gen KPNA7 inactivo resultan en un decremento en la proporción de embriones desarrollados hasta el estadio de blastocisto⁽¹⁴⁵⁾. Bettegowda et al⁽¹⁴⁶⁾ descubrieron y caracterizaron el gen JY-1, cuya proteína es específica del ovocito, se encarga de la regulación de las células de la granulosa y tiene una función clave en la regulación de la fertilidad en mamíferos, que se relaciona con la presencia de polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) dentro del exón 3 del gen⁽¹⁴⁷⁾. El RNAm de JY-1 es detectable a lo largo de la folículogénesis desde ovocitos inmaduros hasta el ovocito en metafase II; después de la fertilización está presente en embriones tempranos de bovino hasta la etapa de 8 células⁽¹⁴⁶⁾. NOBOX es una proteína que actúa como factor de transcripción⁽¹⁴⁸⁾, cuyo mensajero es preferentemente expresado en ovario del bovino. Esta proteína está presente durante toda la foliculogénesis en los ovocitos y actúa en el desarrollo temprano de embriones dado que embriones con este gen inactivo son incapaces de llegar a la etapa de blastocisto⁽¹⁴⁹⁾. Recientemente se encontró que el mensajero del gen materno NOBOX tiene sitios de unión para el miR-196a en su extremo UTR 3', demostrando que este miRNA es un regulador negativo durante la embriogénesis temprana en el bovino. El miR-196a está presente en el ovocito y en el embrión, su expresión se incrementa en el estadio embrionario de 4 y 8 células⁽¹⁰⁵⁾. La Nucleoplasmina 2 (NPM2) es una proteína específica del ovocito que actúa en la organización nuclear en el desarrollo embrionario temprano⁽⁸⁰⁾. Tanto el perfil de expresión como el nivel de proteína de NMP2 en bovinos, muestran que es más abundante en ovocitos inmaduros y maduros, que en embriones de estadios tempranos. La abundancia del RNAm de NMP2 decrece a partir de cigotos, aumentando un poco en embriones de 2 células, disminuye de nuevo en embriones de 4 células y decrece drásticamente a partir de embriones de 16 células; a partir de mórula la expresión de NPM2 es mínima. Esto indica que NMP2 podría ser requerida para la organización nuclear durante la activación del genoma embrionario. El transcrito de NMP2 tiene un sitio de unión en su extremo UTR'3 para el miR-181a y en experimentos en bovino se demostró que la traducción de NPM2 es reprimida por este miRNA⁽¹⁰⁴⁾.

Otro RNAm materno identificado en el bovino por el grupo de Golding et al⁽¹⁵⁰⁾ es DMT1, que genera la metiltransferasa 1; análisis de la expresión de este gen en embriones tempranos reveló que está expresada en embriones en estadios de 2 células y empieza a decaer en el estadio de 8 células, para suprimirse significativamente en la etapa de blastocistos. Este mismo grupo realizó en cigotos microinyecion con un siRNA artificial que bloqueaba la expresión de este gen y observó que los embriones tenían un desarrollo normal hasta el estadio de 8 células, después de aquí el crecimiento era detenido⁽¹⁵⁰⁾.

En lo que respecta a la acción de los RNAs pequeños, al igual que Tanget al⁽⁴⁶⁾ en 2077, Tesfaye et al⁽¹⁵¹⁾ encontraron un perfil diferencial de miRNAs tanto en ovocitos inmaduros como maduros, miRNAs como el miR-145, miR-292-3p y el miR-496 muestran un aumento significativo de expresión en ovocitos maduros lo que implica que estos miRNAs puedan estar involucrados en el proceso de competencia de ovocitos bovinos. Dentro los miRNAs que Tesfaye et al⁽¹⁵¹⁾ encontraron, destacan aquéllos que estando presentes ya desde el ovocito maduro después de la fertilización; permanecen presentes hasta estadios previos a la activación del genoma embrionario; dentro de estos se encuentran el miR-145, miR-208, miR-207 y miR-125a. Aunado a lo anterior, Abd El Naby et al⁽¹⁵²⁾ identificaron que los miR-205, miR-150, miR-96, miR-122, miR-146a y miR-146b-5p se expresan de forma constante en el ovocito bovino y su expresión empieza a caer después de 8 h de maduración in vitro de los ovocitos, pero permanecen después de la fertilización hasta los estadios de 4 células, donde empiezan a decaer abruptamente en el estadio de 8 células. En concordancia con esto, Miles et al⁽¹⁵³⁾ demostraron que los miR-let7b, miR-let7i y miR-106a se expresan de forma específica durante el proceso de maduración de ovocitos bovinos. El patrón de expresión de estos miRNAs involucra su origen materno al igual que lo describió Tang et al⁽⁴⁶⁾ para el ratón. Interesantemente Mondou et al⁽¹⁴¹⁾, encuentra que los miR-21 y miR-130 tienen poca expresión en ovocitos inmaduros y maduros, lo que cambia de forma significativa después de la fertilización, donde se observa que aumenta su expresión a partir del estadio de dos células, manteniéndose elevada hasta la etapa de 8 células para deprimirse en el estadio de blastocisto.

CONCLUSIONES

Después de la fertilización, el proceso de transcripción es inactivo, razón por la cual el único sustento proteico que tiene el cigoto es el que le aportan los transcritos y proteínas provenientes del ovocito. En otras palabras, en un inicio el éxito del desarrollo embrionario depende absolutamente de la calidad de ovocito. Esta calidad está relacionada con el efecto de la expresión de RNAm maternos, mismos que al traducirse permiten que se activen los mecanismos necesarios que dan paso a la activación del genoma embrionario. Sin la acción de las proteínas maternas, simplemente no se activa el genoma del embrión. Esto ha quedado muy evidenciado en el modelo de ratón, donde al bloquear la expresión de RNAm maternos se observa claramente que el desarrollo embrionario se detiene en los primeros estadios. Esto hace que sea necesario estudiar la forma en que estos RNAm maternos se expresan y traducen para ejercer su función.

Aunque este conocimiento ya está muy avanzado en el modelo murino, en el bovino apenas comienza, siendo pocos los RNAm maternos descritos a la fecha. Así que aun existe un enorme vacío en la generación de conocimiento que permita entender estos procedimientos en la embriogénesis bovina. En los protocolos de fertilización in vitro bovinos, la mayor parte de los ovocitos provienen del rastro, por lo que la calidad genética materna es muy variada, lo que implica que los protocolos para madurarlos in vitro no generen el éxito esperado al término del proceso. Esclarecer cuál es la calidad genética que debe tener un ovocito para considerarse competente, permitirá favorecer el desarrollo de un blastocisto. Sin embargo, con la tecnología actual aún es imposible analizar el genoma de un ovocito sin comprometer su viabilidad. No obstante, dado que los RNAm maternos están presentes al inicio de la etapa embrionaria, resulta interesante proponer estrategias, que permitan analizar la calidad del embrión en base a la expresión de estos transcritos, en los estadios tempranos previos a la activación del genoma. Esto permitirá elegir in vitro sólo aquellos embriones que expresen de forma adecuada los RNAm maternos, para que continúen su desarrollo embrionario hasta blastocisto, de forma tal que el éxito del proceso sea asegurado.

AGRADECIMIENTOS

Al PROMEP-SEP-México por el apoyo otorgado OF-09-415.

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