Efecto de antimicrobianos naturales sobre la estabilidad físico-química, microbiológica y sensorial de hamburguesas de res mantenidas en refrigeración

Effects of natural antimicrobials on microbiological stability, pH, aspect and sensory properties of ground beef patties stored under refrigeration

Lorenzo Gómez Cárdenasª, Edith Ponce-Alquicira^b, Renata Ernlund Freitas Macedo^c, Maria Salud Rubio Lozanoª

^a Laboratorio de Ciencia de la Carne, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Centro de Enseñanza Práctica, Investigación en Producción y Salud Animal. Av Cruz Blanca No. 486. Colonia San Miguel Topilejo, Delegación Tlalpan. 04500. Mexico, DF. Tel.: +5255-8480810; fax: +52-55-8480514; msalud@unam.mx. Correspondencia al último autor.

^b Departamento de Biotecnología, UAM-Iztapalapa. México.

Recibido el 20 de enero de 2012.
Aceptado el 15 de mayo de 2012.

Resumen

Se evaluó el efecto de la utilización de diferentes antimicrobianos naturales (nisina - 3%; lactato de sodio - 3%; lactato de potasio - 3%; acetato-lactato - 1%) sobre la estabilidad de hamburguesas de carne de res. En la primera etapa del estudio, las hamburguesas fueron inoculadas con E. coli y mantenidas en refrigeración por ocho días. En la segunda etapa, las hamburguesas, sin la inoculación de E. coli, fueron refrigeradas por 10 días. Las muestras se evaluaron para color, pH, conteo microbiológico y atributos sensoriales (hamburguesas de la segunda etapa). La adición de nisina promovió la mayor inhibición microbiana y la mejor estabilidad del pH de las hamburguesas. La adición de lactatos y acetato-lactato mostró significativo efecto de inhibición del crecimiento microbiano, sin presentar efecto sobre el color de la carne. No obstante de su efecto antimicrobiano, la adición de nisina afectó negativamente la aceptación sensorial de las hamburguesas.

Palabras clave: Vida de anaquel, Nisina, Lactato, Antimicrobiano natural.

Abstract

Key words: Shelf-life, Nisin, Lactate, Natural antimicrobial.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el sector industrial de los productos cárnicos procesados ha tenido una gran expansión y aceptación en el mercado consumidor⁽¹⁾. Además del aspecto nutritivo, sensorial y de la conveniencia de preparación del producto, la seguridad alimentaria y el periodo de vida de anaquel también son atributos importantes en los productos cárnicos. Para la conservación de estos productos, el uso de conservadores naturales es una fuerte tendencia mundial. Los conservadores naturales de mayor potencial en la industria cárnica son las bacteriocinas, los lactatos y los extractos de semilla de toronja⁽²⁾.

Las sustancias producidas por Lactococcus lactis, llamadas bacteriocinas, han recibido gran atención entre los conservadores naturales. Las bacteriocinas actúan alterando la estructura y funcionalidad de la membrana citoplasmática a través de la formación de poros, provocando la salida de compuestos esenciales para la célula⁽³⁾. La actividad antimicrobiana de las bacteriocinas representa un gran potencial para la industria alimenticia, ya que se pueden utilizar como conservadores biológicos, y tienen la ventaja de ser péptidos que son inactivados por proteasas del tracto digestivo y no forman compuestos secundarios peligrosos⁽⁴⁾.

La nisina es producida por Lactococcus lactis subsp. Lactis y es la única bacteriocina disponible comercialmente reconocida como sustancia segura (Generally Regarded As Safe - GRAS), habiendo sido aprobada para uso en alimentos en los EE.UU.⁽⁵⁾ y en la Unión Europea⁽⁶⁾.

La nisina tiene una amplia historia de uso seguro en alimentos y se ha documentado su efectividad en contra de agentes patógenos Gram positivos y microorganismos deteriorativos; sin embargo su uso en productos cárnicos no está regulado⁽⁷⁾.

Además de las bacteriocinas, otros compuestos orgánicos como las sales derivadas del ácido láctico (lactatos) y del ácido acético (acetatos) también han sido usados como conservadores naturales en alimentos. Los lactatos están naturalmente presentes en la carne, y su uso es permitido como conservador natural por el USDA-Food Safety and Inspection Service (USDA-FSIS) en la cantidad límite de 3 g/100 g de carne⁽⁸⁾. La adición de 1.5 a 3.0 g de lactato/ 100 g de carne ha sido extensamente utilizada por la industria cárnica para mejorar los atributos de la carne. Comercialmente, hay disponibles productos de lactato con tres diferentes cationes (calcio, potasio y sodio). Recientemente estos compuestos se han utilizado en productos cárnicos obteniendo un balance entre costo y funcionalidad^(9,10,11,12). Los lactatos muestran propiedades antimicrobianas en contra de microorganismos no patógenos⁽¹³⁾ y patógenos⁽¹⁴⁾.

Los lactatos y los acetatos han sido utilizados para mejorar la calidad de los productos cárnicos curados o cocidos; sin embargo, existen pocos reportes de su uso en carne cruda^(15,16).

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar y comparar el efecto de la adición de nisina, lactatos y acetato-lactato sobre el crecimiento de patógenos como Escherichia coli y de microorganismos contaminantes naturales en la carne, así como sobre parámetros de calidad y vida de anaquel de la carne molida de res mantenida en refrigeración.

MATERIALES Y MÉTODOS

Esta investigación se dividió en dos etapas; la primera se concentró en determinar el efecto de diferentes antimicrobianos sobre el crecimiento de E. coli, color y pH en hamburguesas elaboradas con carne de res previamente inoculadas. En la segunda etapa se evaluó el efecto de los mismos antimicrobianos sobre la microbiota natural, el color, el pH y las propiedades sensoriales de hamburguesas de carne de res.

Elaboración de las hamburguesas

Para la elaboración del producto cárnico se utilizaron músculos de la espaldilla (infraespinoso, supraespinoso, subescapular y redondo mayor) de canal bovina, adquirida en un obrador local después de 24 h desde la matanza realizada en el rastro municipal de Netzahualcóyotl. La carne refrigerada a 4 °C se limpió, se eliminó la mayoría del tejido conectivo externo, así como el excedente de grasa, para posteriormente cortarla en trozos más pequeños y así facilitar su molienda. Con el músculo ya limpio y en pequeños pedazos, se procedió a la molienda en un molino (Torrey M32-3 Monterrey, NL, México) con un cedazo de 3 mm. Posteriormente, las hamburguesas, de 100 g cada una, fueron moldeadas, y asignadas a cinco tratamientos.

Diseño de los experimentos

Los antimicrobianos con acción dependiente del ácido láctico fueron suministrados por PURAC México, S de RL de CV (México, DF) y el antimicrobiano a base de nisina, ácidos orgánicos (láctico, sórbico y cítrico) y propilparabeno por la empresa Ingreditech México, representante de Chemital, S.A. España. Cada tratamiento constó de 30 hamburguesas en total: 1) testigo, sin la adición de antimicrobianos (T); 2) adición con 0.3% (p/p) de producto comercial con nisina (INBAC® 10-NA) en polvo (N), el producto comercial contenía 0.05% de nisina y se añadió directamente a la carne durante el mezclado de la hamburguesa, que presentó pH de 5.0 a 5.5 después de adición del antimicrobiano; 3) adición de 3% (v/p) de lactato de sodio al 60% en presentación líquida (PURASAL® S) (LNa); 4) adición de 3% (v/p) de lactato de potasio al 78% en presentación líquida (PURASAL ® HiPure P Plus) (LK); 5) adición de 1% (v/p) de acetato-lactato en presentación en polvo previamente disuelto en agua a 4 °C (PURASAL® Powder XTend) (AL).

Los antimicrobianos fueron añadidos a la carne molida y mezclados por un tiempo de 3 min en una Kitchen Aid Classic (modelo MK456PWH Michigan, USA) manteniéndose la temperatura a 4 °C. Posterior a la preparación, las hamburguesas se colocaron en bandejas de unicel (BIP Plastics, Estado de México, México) y cubiertas con película estirable de polietileno de baja densidad (LDPE) (Kleen pack, Kimberly-Clark de México), permeable al oxígeno (permeabilidad al oxígeno 1.742 cm³ im/ m²d kPa a 23 °C y 95% HR) y almacenadas en refrigeración a 4 °C en una cámara de refrigeración hasta la realización de los análisis.

En esta etapa, se inocularon las hamburguesas con 300 μl de un cultivo de Escherichia coli (JM P101), activado en caldo soya tripticaseina (TSB) (Difco Laboratories, Michigan, USA), donado por la Queen's University of Belfast (Northern Ireland, UK), a una concentración de 3.6 x 10⁸ UFC/ml, previamente a la adición de los antimicrobianos a la carne molida (100 g).

Posteriormente se añadieron los antimicrobianos acorde con los procedimientos y tratamientos ya descritos. Las hamburguesas se colocaron en bandejas de unicel, cubiertas con película estirable y almacenadas a 4 °C por ocho días, realizando muestreos durante los días 2, 4, 6 y 8. Las muestras se analizaron para conteo de E. coli, color y pH.

El conteo de E. coli se realizó en placas con medio selectivo agar EMB (eosina azul de metileno, Difco Laboratories, Michigan, USA) con incubación a 35 °C por 24 h. El color se evaluó con un colorímetro Hunter Lab modelo 11491, Color Flex (Reston, Virginia) con iluminante D65 y 10° de ángulo de observación y se obtuvieron los valores de CIE L*, a* y b* con muestras analizadas por triplicado.

Para la medición del pH, 10 g de muestra se homogeneizaron en 90 ml de agua destilada; posteriormente, la mezcla se filtró para eliminar el tejido conectivo y finalmente se midió el pH del filtrado en un potenciómetro Beckman modelo pH 50, previamente calibrado con soluciones amortiguadoras pH 7 y pH 4 (Palo Alto California, USA.).

Etapa 2

Las hamburguesas se adicionaron con los antimicrobianos y almacenadas según los mismos tratamientos descritos. Cada dos días se determinó la presencia de coliformes totales, mesófilos aerobios, pH y color (L*, a*, b*). Las hamburguesas también se evaluaron sensorialmente después de 1 día de almacenamiento en refrigeración.

La evaluación de mesófilos aerobios se realizó por diluciones decimales de la muestra en agua peptonada al 0.1% y después se incubaron en agar cuenta estándar (Bacto Plate Count Agar, Difco, Laboratories, Michigan, USA) a 35 ± 2 °C por 48 ± 2 h⁽²²⁾. La evaluación de coliformes totales se realizó en agar-rojo-violeta-bilislactosa (RVBA, Difco Laboratories, Michigan, USA) con incubación a 35 °C durante 24 ± 2 h⁽²³⁾. Los resultados se expresaron en log₁₀ UFC/g. El pH y el color se analizaron según lo descrito en la Etapa 1.

Para la evaluación sensorial, las hamburguesas se cocinaron⁽²⁴⁾ hasta alcanzar una temperatura interna de 70 °C y se cortaron en fracciones de 2 x 2 cm. La evaluación sensorial de aceptación de las hamburguesas se llevó a cabo con un panel de cincuenta panelistas no entrenados, compuesto por 30 hombres y 20 mujeres, con un rango de edad de los 17 a los 40 años y que evaluaron las propiedades de sabor, textura y aspecto general. La prueba sensorial se basó en la utilización de la escala hedónica estructurada de siete puntos, en la cual 1 significaba disgusta extremadamente y 7 gusta extremadamente. Con esta escala, el panelista respondió y eligió el producto basándose en los atributos sensoriales de acuerdo a su nivel de agrado⁽²⁵⁾.

Análisis estadístico

Para el análisis de los datos obtenidos de la evaluación sensorial de las hamburguesas en la Etapa 2 se utilizó el modelo Kruskal-Wallis Test con nivel de significancia de 5%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Primera Etapa

En la primera etapa del estudio no se observó efecto de la interacción del tratamiento antimicrobiano y los días en almacenamiento sobre los parámetros evaluados, siendo así presentados los efectos independientes de los tratamientos sobre el crecimiento de E. coli, pH y color.

Se observó mayor control del crecimiento de E. coli (P<0.05) con el tratamiento de nisina y ácidos orgánicos después de ocho días en refrigeración, el cual presentó un conteo medio de 3.74 log₁₀ UFC/g. Considerando el conteo inicial de E. coli en las hamburguesas antes del almacenamiento (tiempo 0 días) de 7.03 log₁₀ UFC/g, el tratamiento con nisina proporcionó una reducción logarítmica media de 3.29 log₁₀ UFC (Cuadro 1).

En carne fresca, ha sido estudiada la aplicación de nisina en canales rociadas para sanitizar su superficie⁽²⁶⁾ y para descontaminar carne de cerdo artificialmente contaminada⁽²⁷⁾, combinada con el 2% de lactato de sodio para el control de S. aureus y Salmonella en salchichas de cerdo⁽²⁸⁾ y combinada con 2% de cloruro de sodio como agente anti listeria en carne molida⁽²⁹⁾.

El efecto conservante de la carne en los tratamientos estudiados también puede ser verificado en el pH de las hamburguesas durante el almacenamiento. El tratamiento con nisina mantuvo el pH de la carne debajo del valor 5.5 durante todo el periodo de refrigeración, mientras los demás tratamientos mostraron incremento del pH, alcanzando valores entre 6.6 y 6.7 al final del estudio (Figura 1). Sin embargo, todos los tratamientos demostraron contener más consistentemente el incremento del pH a lo largo del almacenamiento en comparación al tratamiento testigo (P<0.05) que finalizó con valor de 7.61. Considerando el pH como un indicador de deterioro de la carne de res, la inclusión de los antimicrobianos a la carne mantuvo el pH en valores menores a 6.0 hasta el 6° día de almacenamiento.

Con relación al efecto de los antimicrobianos sobre las características de color (valores L*, a* y b*) de las hamburguesas inoculadas con E. coli, se comprobó que los tratamientos mostraron una tendencia a bajar estos valores, con excepción de la luminosidad en el tratamiento con nisina, que presentó una mayor constancia y mayores valores de L* (P<0.05) en comparación a los demás tratamientos a lo largo del almacenamiento (Figura 2). Los tratamientos LNa, LK y AL mostraron mayor capacidad para mantener los valores de luminosidad (L*) en relación al tratamiento testigo.

Con respecto a los efectos sobre el color rojo, se observó que la intensidad disminuyó a lo largo del almacenamiento en todos los tratamientos⁽⁹⁾. El que contenía nisina fue el que mostró menor caída, presentando el mayor valor medio de este color (P<0,05) durante el almacenamiento.

La reducción del color rojo de la carne molida de res adicionada de lactato de potasio, metasilicato de sodio, ácido peracético y cloruro de sodio acidificado fue observada a lo largo de siete días de almacenaje en refrigeración⁽¹¹⁾. Sin embargo, se observó que los tratamientos con los productos conservantes presentaron mayores valores de color rojo (P<0.05) en comparación al tratamiento testigo del 1° al 7° día de vida de anaquel⁽¹¹⁾. En carne molida de res adicionada de lactato de sodio, lactato de potasio y acetato de sodio se observó descoloración visual e instrumental a lo largo de tres días de almacenaje⁽²⁰⁾.

Para la intensidad de b* no se encontraron diferencias (P>0.05) entre los tratamientos, siendo observada una disminución a lo largo del almacenamiento en todos los tratamientos.

Segunda Etapa

En la segunda etapa, el efecto de la interacción del tratamiento antimicrobiano y los días en almacenamiento fue constatado solamente para el pH. Aunque se observó un incremento en el número de coliformes y aerobios mesófilos para todos los tratamientos durante el almacenamiento (Figura 3), las hamburguesas adicionadas de antimicrobianos presentaron menor incremento en comparación al testigo a lo largo del tiempo de estudio. En las hamburguesas tratadas con antimicrobianos el incremento de coliformes y de mesófilos del 2° al 10° día de almacenamiento fue en promedio de 1.83 y 1.38 log₁₀ UFC/g, respectivamente, vs 3.89 y 3.45 log₁₀ UFC/g en el testigo.

Para los mesófilos, el conteo final en las hamburguesas adicionadas de antimicrobianos se encontró abajo del límite recomendado en carnes crudas, máximo 7 log₁₀ UFC/g⁽³⁰⁾. En el tratamiento testigo, el conteo final de mesófilos alcanzó un valor de 8 log₁₀ UFC/g.

En concordancia con los resultados de la primera etapa del experimento en cuanto a la inhibición de E. coli, la adición de LK se mostró como el segundo mejor tratamiento en controlar el crecimiento de coliformes y mostró eficiencia similar al LNa en la inhibición de mesófilos del 2° al 10° día de almacenamiento.

La adición de 2.5% de lactato de sodio en salchichas de cerdo disminuyó el crecimiento de aerobios mesófilos hasta por 18 días de almacenamiento⁽¹²⁾.

El tratamiento AL fue el que mostró el menor efecto de inhibición sobre los coliformes en relación a los demás tratamientos (P<0.05), aunque haya presentado mayor inhibición de estos contaminantes en comparación al testigo (P<0.05). Los lactatos proporcionan mayor control para la inhibición de aerobios mesófilos en comparación a los acetatos en carne de cerdo refrigerada⁽¹⁵⁾.

En el estudio en el cual se utilizó lactato de sodio, acetato de sodio y sorbato de potasio como agentes inhibidores de bacterias lácticas en producto cárnico curado cocido, se observó que el lactato de sodio usado aisladamente o en combinación con los otros antimicrobianos logró extender en diez días, de manera efectiva, la vida de anaquel del producto cárnico curado cocido⁽³¹⁾. En general, varias sales del ácido láctico, acético u otros ácidos orgánicos han demostrado actividad antibacteriana en medios bacteriológicos o productos alimenticios bajo condiciones de laboratorio^(32,33,34).

Por otro lado, se comprobó la reducción del pH a lo largo del almacenamiento para los tratamientos adicionados de antimicrobianos; sin embargo, este parámetro en el tratamiento testigo aumentó (P<0.05). Así como en el presente trabajo, también observaron crecimiento de E. coli y de aerobios mesófilos en carne molida de res almacenada durante siete días en refrigeración, aunque el pH de la carne se haya tornado más ácido a lo largo del almacenamiento⁽²¹⁾.

El tratamiento con nisina proporcionó los menores valores de pH a las hamburguesas (P<0.05). Los demás antimicrobianos también se mostraron eficaces en el mantenimiento del pH por debajo de 5.4 hasta el final del almacenamiento (Figura 4).

En cuanto a los parámetros de color y luminosidad, en esta segunda etapa se comprobó un ligero aumento de los valores de L* a lo largo del almacenamiento para los tratamientos con antimicrobianos (Figura 5). Sin embargo, así como ocurrió en la primera etapa, el tratamiento testigo mostró una disminución de la luminosidad a lo largo del almacenamiento. El tratamiento adicionado de nisina fue el que mostró mejor estabilidad en los valores de luminosidad durante el almacenaje, mientras los demás tratamientos presentaran ligero incremento de los valores medios de luminosidad al final de 10 días de almacenamiento en relación al 2° día.

La adición de AL aumentó los valores de a* (rojo) durante el almacenamiento (P<0.05). Sin embargo, en esta etapa, la adición de nisina no se mostró efectiva en la estabilidad del color rojo de las hamburguesas como en la primera etapa, habiendo una ligera caída de los valores de a* durante el almacenamiento. Para los lactatos (de sodio y de potasio) también se verificó menor caída de los valores de a* durante el almacenaje en relación al tratamiento con nisina.

Hay muchos estudios sobre el efecto de los lactatos sobre el color de la carne. El lactato de potasio y lactato de calcio mejoran la calidad de la carne al incrementar la estabilidad del color y disminuir la formación de metamioglobina^(35,36). El tratamiento de la carne de res con solución de lactato de sodio estabilizó el color rojo y disminuyó el brillo superficial de la carne, proporcionándole aspecto de carne fresca por más tiempo^(10,36,37). Sin embargo, algunos autores afirman que el efecto del lactato de sodio en el color de la carne cruda de res y de cerdo es limitado^(15,20). Los valores de b* (amarillo) se mantuvieron estables durante el almacenamiento en todos los tratamientos, no existiendo diferencia (P>0.05) entre los diferentes días de análisis en los tratamientos.

Las características sensoriales de los alimentos más importantes para el consumidor, que incluyen textura, sabor, aroma y color⁽³⁸⁾ pueden variar de acuerdo al tipo de carne, particularmente la palatabilidad. El consumidor ha identificado a la textura y la suavidad como los atributos sensoriales más importantes de la carne⁽³⁹⁾.

El Cuadro 2 muestra que, de manera general, las hamburguesas evaluadas mostraron aceptación para todos los atributos evaluados, pues obtuvieron notas correspondientes a la descripción "gusta regularmente" en la escala sensorial de aceptación utilizada.

En cuanto a la textura, el tratamiento testigo mostró los mayores valores y preferencia, semejante a la de los tratamientos LK y AL. Las hamburguesas adicionadas de LNa obtuvieron las calificaciones más bajas (P<0.05) entre los tratamientos; las hamburguesas con nisina mostraron valores intermedios.

En la evaluación sensorial de hamburguesas tratadas con lactato de potasio (3%), ácido peroxiacético (0.02%) y cloruro de sodio acidificado (0.1%), las calificaciones de textura de las hamburguesas sin los conservadores fueron más altas⁽¹¹⁾. El efecto de los antimicrobianos sobre el tamaño de las partículas de la carne molida de res debe ser considerado cuando la carne es expuesta al consumidor.

En lo que respecta al aspecto general de las hamburguesas, el tratamiento antimicrobiano con la menor calificación por parte del grupo de panelistas fue el que contenía nisina (P<0.05). Esta observación puede obedecer a la reducción del componente de color a* durante el almacén de las muestras.

De acuerdo a los atributos evaluados sensorialmente, las hamburguesas sin adición de antimicrobianos y adicionadas con LK y AL fueron las de mayor aceptación por los panelistas. La adición de lactato de potasio en la carne de cerdo y de res puede mejorar sus atributos sensoriales⁽¹⁰⁾

La adición de lactato y vinagre a hamburguesas de carne de cerdo incrementó la aceptación sensorial, la jugosidad y la vida de anaquel de los productos en comparación al testigo⁽¹²⁾.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Todos los antimicrobianos estudiados mostraron un efecto de inhibición de enterobacterias y mesófilos en comparación al testigo. El tratamiento con nisina fue el que proporcionó la mejor protección microbiológica al producto cárnico con acción efectiva sobre los microorganismos contaminantes y el pH, sin causar alteración significativa en el color de la carne. Sin embargo, la adición de nisina afectó negativamente la aceptación sensorial de las hamburguesas en comparación a los lactatos. Estos resultados mostraron que los antimicrobianos estudiados pueden conferir protección extra al procesado cárnico y extender su vida de anaquel, sirviendo de base para futuros estudios en la obtención de un producto cárnico con adecuada estabilidad microbiana y elevada aceptación sensorial.

Se agradece el apoyo financiero ofrecido por la DGPA da la UNAM a través de la línea 5 (Desarrollo De Nuevos Productos) del Macro proyecto intitulado Productividad Sostenible de los Hatos de Cría en Pastoreo.

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