Prevalencia y resistencia a antibióticos de Escherichia coli O157:H7 aislada de canales de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano

Prevalence and antibiotic resistance of Escherichia coli O157:H7 isolated from bovine carcasses at slaughterhouses of the Central Mexican Plateau

Nydia Edith Reyes-Rodríguez^a, Martín Talavera-Rojas^a, Jorge Antonio Varela-Guerrero^a, Jeannette Barba-León^b, Adriana del Carmen Gutiérrez-Castillo^a, Uxúa Alonso-Fresán^a

^a Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México,. Carretera Panamericana Toluca-Atlacomulco km 15.5, Toluca, México. CP. 50200, Teléfono/Fax: 722 2965555. mtr0035@yahoo.com.mx. Correspondencia al segundo autor.

Recibido el 6 de junio de 2011.
Aceptado el 22 de noviembre de 2011.

Resumen

La carne es el principal vehículo de toxiinfecciones alimentarias como consecuencia de una higiene deficiente en el sacrificio de los animales o durante el manejo de las canales. En este estudio se analizaron tres rastros municipales del Altiplano Central Mexicano, de los cuales se obtuvieron 228 muestras pareadas de canal (n=114) y contenido de colon (n=114) de bovinos que fueron sacrificados en estos rastros; se obtuvieron 2 (0.8 %) cepas de E. coli O157:NM a partir de contenido de colon y 6 (2.6 %) cepas de E. coli O157:H7 (5 de canales y 1 de contenido de colon). El porcentaje de aislamiento de cada rastro fue variable, encontrando diferencias significativas (P<0.05). En las cepas de E. coli O157:NM y O157:H7 se observa que la resistencia más alta fue para cefalotina con un 75 %, carbencilina con 62.5 %, amikacina con 50 % y gentamicina con 50 %, el 16.7 % de las cepas de E. coli O157:H7 presentaron los genes eae, stx1 y stx2 y el 66.7 % los gen eae y stx2. En conclusión los resultados obtenidos muestra la presencia E. coli O157:H7 con factores de virulencia y resistencia a antibióticos, en canales de bovinos de rastros del altiplano central Mexicano, considerándose una fuente de contaminación importante y un riesgo para la salud pública.

Palabras clave: Escherichia coli, O157:H7, Toxinas Shiga, Multiresistencia.

Abstract

Key words: Escherichia coli O157:H7, Shiga toxins, Multiresistance.

Las infecciones ocasionadas por E. coli O157:H7 suelen ser a través del consumo de agua o alimentos contaminados con excremento de animales portadores. Varios brotes de enfermedades se han asociado con el consumo de carne de bovino, lo que sugiere que el ganado es una importante fuente de contaminación que provoca infecciones en humanos^(1,2). En la patogenia de este agente, existen genes que codifican para la adherencia y esfacelamiento (A/E) de las microvellosidades del epitelio intestinal, los cuales se localizan en la isla de patogenicidad LEE (locus for enterocyte effacement); el principal gen que produce esta acción es el eae, que produce una proteína de 94 a 97 kDa llamada intimina. Se ha demostrado experimentalmente que la intimina estimula la inflamación e hiperplasia del intestino, lo que favorece la colonización^(3,4), otros autores reportan una adherencia localizada en íleon terminal, colon y ciego⁽⁵⁾. Las manifestaciones clínicas por E. coli O157:H7 están asociadas a las toxinas Stx1, Stx2 o ambas⁽³⁾. La toxina shiga (Stx) pertenece a una familia de proteínas estructurales y funcionalmente relacionadas con la toxina shiga sintetizada por SRigella dysenteriad^3,6\ Algunas variantes de Stx2 son más virulentas en humanos, sin embargo la capacidad toxica de E. coliO157:H7 es necesaria para el desarrollo de colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica, ya que éste es el principal mecanismo de patogenicidad⁽⁷⁾. El objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de E. coli O157.H7 en canales y contenido de colon de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano, detectar la resistencia a antibióticos, las toxinas Stx1, Stx2 y el gen eae mediante la técnica de PCR múltiple.

Se realizó un muestreo por conveniencia en tres rastros municipales del altiplano central Mexicano; (A, B y C); de estos, se tomó el número de animales sacrificados semanalmente, teniendo un total de 575 bovinos. El tamaño de muestra se obtuvo considerando una prevalencia del 2.7 %⁽⁸⁾ y un nivel de confianza del 95 % mediante la fórmula de tamaño de muestra de poblaciones finitas⁽⁹⁾. Una vez que se determinó el tamaño total de la muestra (38) se ponderaron en los tres rastros de forma proporcional al número de animales sacrificados, obteniendo el siguiente tamaño de muestra, en el rastro A= 8, rastro B=5 y rastro C= 25; se realizaron tres repeticiones en cada rastro teniendo un total de 114 muestras pareadas, 114 de canal y 114 de contenido de colon.

Las muestras de contenido de colon se tomaron después de la evisceración del animal; se tomó aproximadamente 1 g de excremento directamente del colon y se depositó en un tubo de ensaye con 9 ml de agua peptonada al 1 %^(7,10). La muestra de la canal se tomó después del lavado y antes de ser sometidas a refrigeración, se utilizó el método no destructivo con un hisopo en peptona al 0.1%+NaCI al 0.85 % descrito por la Unión Europea⁽¹¹⁾. Posteriormente cada hisopo se depositó en un tubo tipo Falcón con 25 ml de agua peptonada al 1 %.

Las muestras se transportaron en refrigeración al Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México. Las muestras de contenido de colon y canales se incubaron 24 ± 2 h a 37 °C. Posteriormente se tomó una porción con el asa bacteriológica y se sembraron por estría en Agar MacConkey y Agar MacConkey Sorbitol (SMAC Becton Dickinson) y en Agar Gelosa Sangre e incubadas durante 24 ± 2 h a 37 °C^(10,12).

Las colonias sospechosas se diferenciaron por pruebas bioquímicas (TSI, LIA, SIM y MIO) por 24 h a 37 °C; una vez identificadas, fueron inoculadas en Agar base sangre durante 24 ± 2 h a 37 °C^(10,12) para la identificación serológica con antisueros monovalentes anti somático (Difco ^TM E. coli. O Antiserum O157) y anti flagelar (Difco ^TM E. coli H Antiserum H7).

La resistencia a los agentes antimicrobianos se determinó mediante la técnica de Kirby-Bauer estandarizada por el National Committee for Clinical Laboratory Standars^(13,14) utilizando como control E. coli ATCC 25922. Se evaluaron los siguientes antibióticos: amikacina (30 μg), ampicilina (10 μg), cefalotina (30 μg), cefotaxima (30 μg), ceftriazona (30 μg), cloranfenicol (30 μg), gentamicina (10 μg), netilmicina (30 μg), nitrofurantoina (300 μg), pefloxacina (5 μg) y trimetropim-sulfametoxasol (25 μg) (Sensidiscos, Gram Negativos BIO-RAD). Las lecturas se compararon con las tablas de interpretación de acuerdo al NCCLS^(13,14). La extracción de ADN se realizó mediante el kit comercial DNA Purification Wizard Genomic (Promega). La cepa de referencia utilizada fue E. coli EDL993 como testigo positivo; la base de secuencias y el tamaño previsto de la amplificación para los oligonucleótidos específicos a utilizar fueron los reportados por Blanco et al⁽¹⁵⁾ bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 95 °C por 5 min, seguido de 30 ciclos de 95 °C por 5 min de desnaturalización, 58 °C por 1 min de alineación y 72 °C durante 1 min de síntesis de ADN. Con el producto final se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se corrió 1:30 h a 85 voltios. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se colocó en un transluminador de luz ultravioleta (UV) para su observación. Los resultados se evaluaron con la prueba de Ji cuadrada con un intervalo de confianza del 95%⁽¹⁰⁾.

De un total de 228 muestras analizadas se aislaron 2 (0.8 %) cepas de E. coli que correspondieron al serotipo O157:NM el cual se obtuvo a partir de contenido de colon y 6 (2.6 %) a E. coli O157:H7 (5 de canales y 1 de contenido de colon). El porcentaje de aislamiento de cada rastro fue variable, en el rastro B no se obtuvieron aislamientos, en el rastro A 0.43 % y en el C 2.2 % (P<0.05). Las cepas de E. coli O157:NM y O157:H7 fueron resistentes a cefalotina con 75 %, carbencilina 62.5 %, amikacina 50 % y gentamicina 50%. Mediante la técnica de PCR se observó que de las cepas de E. coli O157:H7, el 16.7 % presentó gen eae, 16.7 % los genes eae, stx1 y stx2 y el 66.7 % el gen eae y stx2; además que una cepa presentó una banda para stx2 A1 (Figura 1), (Cuadro 1).

En este trabajo se demuestra la importancia y riesgo significativo para la salud pública que los bovinos portadores de E. coli O157:H7 representan, ya que cuando el manejo en rastros es inadecuado, puede resultar contaminada la canal. En este estudio se obtuvo una prevalencia de 2.6 %, similar a lo reportado por Varela et al⁽⁸⁾, quienes encontraron 2.7 % en el estado de Jalisco; México. En comparación con otros estudios podemos encontrar prevalencias variables en canales como en Estambul con un 2.4 %⁽¹⁶⁾, Egipto con 6 %⁽¹⁷⁾, 0.2 % en Francia⁽¹⁸⁾. En un estudio realizado⁽¹⁹⁾ en plantas empacadoras en Estados Unidos, encontraron una prevalencia de 4.9 %, aunque también han reportado prevalencias que van de 0.1 a 54 %, por lo que podemos considerar que hay diferentes factores que intervienen para su aislamiento. En excremento se han encontrado 2.6 % en Canadá⁽²⁰⁾, 1 % Brasil⁽²¹⁾, 0.19 % en Noruega⁽²²⁾, y posibles factores responsables de la variabilidad entre los porcentajes de aislamiento incluyen el lugar geográfico, manejo en rastro, protocolo de muestreo y aislamiento, además de la época del año.

La posibilidad de que E. coli O157:H7 se encuentre presente en alimentos y utensilios lavados con agua contaminada también debe ser considerado⁽²³⁾. Los resultados obtenidos por Abdul-Raouf et al⁽¹⁷⁾, indican que los alimentos de origen animal con frecuencia están contaminados con E. coli O157:H7 y señala la necesidad de mejorar el proceso de la carne; indicando que la contaminación de la canal es por el mal manejo que se le da al contenido intestinal de bovinos portadores, por lo tanto una estrategia para reducir el riesgo de infecciones por E. coli O157:H7 en los humanos es reducir la prevalencia en el ganado, además de mejorar el manejo en los rastros. En cuanto a las toxinas Shiga Stx1 y Stx2, éstas son las desencadenantes principales de la trombosis microvascular del síndrome urémico hemolítico⁽²⁴⁾. Se menciona⁽²¹⁾, que de los aislamientos de E. coli O157:H7 sólo el 40 % fueron positivos para ambas toxinas. Yilmaz et al⁽²⁵⁾, reportaron 27 aislamientos, y de estos uno fue positivo al gen de adherencia y las toxinas, lo que se considera de gran importancia clínica. Irino et al⁽²⁰⁾, obtuvieron dos aislamientos positivos al gen eae y la toxina Stx2, mientras que otros autores⁽²²⁾, encontraron una cepa con el gen eae y las dos toxinas, además de dos cepas con el gen eae y la toxina Stx2, por lo que se puede observar que las cepas presentan mayor frecuencia del gen eae y Stx2, resultados similares a los de este estudio.

Los resultados obtenidos sobre la resistencia de E. coli O157:H7 han sido variados; en este estudio se encontró la resistencia a cinco antibióticos, amikacina, ampicilina, carbencilina, cefalotina y gentamicina. Alali et al⁽²⁶⁾, encontraron que la E. coli O157:H7 fue resistente a la neomicina y oxitetraciclina. También han reportado resistencia a la tetraciclina en aislamientos de bovinos^(26,27). Ratnam et al⁽²⁷⁾, mencionaron que de las 174 cepas estudiadas de E. coli O157:H7, una fue resistente a la ampicilina, carbencilina y tetraciclina, y otras cuatro cepas fueron resistentes sólo a tetraciclina. Byrne et al⁽¹⁸⁾, encontraron 6 aislamientos resistente sólo a sulfametoxazol, tetraciclina y estreptomicina. Galland et al⁽²⁸⁾, reportaron 4 cepas resistentes a trimetropim-sulfametoxazol, 10 a ampicilina, 23 a tetraciclina, 27 a amoxicilina-Ac. Clavulónico, 57 a penicilina, eritromicina y clindamicina, de un total de 57 aislamientos. La aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos en las canales pone en riesgo la salud humana; la carne de vacuno contaminada con bacterias resistentes a los antimicrobianos al no ser debidamente manipulados y cocinados, podrían transferir sus genes de resistencia además de sus toxinas, lo que podría conducir a una enfermedad difícil de tratar^(3,20).

Se demostró la presencia de E. coli O157:H7, sus genes de toxinas y adherencia, así como la resistencia múltiple a antibióticos en canales y contenido de colon de bovinos sacrificados en rastros del altiplano central Mexicano; lo cual se considera como un riesgo alto para la salud pública, y hace necesario evaluar cada una de las etapas del proceso de carnización, para identificar dónde ocurre la contaminación; además de realizar la vigilancia permanente del uso de los antibióticos en la ganadería.

LITERATURA CITADA

1. Bouvet J, Bavai C, Rossel R, Roux AL, Montet MP, Ray-Gueniot S, et al. Prevalence of verotoxin-producing EscRericRia coli and E. coli O157:H7 in pig carcasses from three French slaughterhouses. Int J Food Microbiol 2002;71:249-255.         [ Links ]

2. Delignette-Muller ML, Cornu M. Quantitative risk assessment for EscRericRia coli O157:H7 in frozen ground beef patties consumed by young children in French households. Int J Food Microbiol 2008;128:158-164.         [ Links ]

3. Rodríguez-Ángeles G. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de EscRericRia coli. Salud Publica Mex 2002;44:464-476.         [ Links ]

4. Higgins LM, Frankel G, Connerton I, Goncalves NS, Douglas G, MacDonald TT. Role of bacterial intimin in colonic hyperplasia and inflammation. Nature 1999;285:588-591.         [ Links ]

5. Cobbold RN, Hancock DD, Rice DH, Berg J, Stilborn RA, Hovde CJ, et al. Rectoanal junction colonization of feedlot cattle by EscRericRia coli O157:H7 and its association with supershedders and excretion dynamics. Appl Environ Microbiol 2007;73:1563-1568.         [ Links ]

6. Pistone CV, Nuñez P, Boccoli J, Silberstein C, Zotta E, Goldestein J, et al. Papel de la toxina Shiga en el Síndrome Urémico Hemolítico. Mex 2006;66:11-15.         [ Links ]

7. Organización Mundial de la Salud. Enterohaemorrhagic EscRericRia coli (EHEC). Argentina: OMS, 2005. [en línea] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs125/en/print.html. Consultado septiembre 15, 2009.         [ Links ]

8. Varela-Hernández JJ, Cabrera-Díaz E, Cardona-López MA, Ibarra-Velázquez LM, Rangel-Villalobos H, Castillo A, et al. Isolation and characterization of Shiga toxin-producing EscRericRia coli O157:H7 and non-O157 from beef carcasses at a slaugtherplant in Mexico. J Food Microbiol 2007;113:237-241.         [ Links ]

9. Wayne WD. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. 4a ed. México: Limus; 2004.         [ Links ]

10. Organización Mundial de la Salud. Manual de procedimientos: Diagnostico y caracterización de EscRericRia coli O157 productor de toxina shiga a partir de especímenes clínicos. 1a. ed. Argentina: OMS. 2007.         [ Links ]

11. Official Journal of the European Community L165/48. European Directive 2001/471/EC.         [ Links ]

12. NOM-110-SSA1-1994. Secretaria de Salud. Bienes y Servicios. Preparación y dilisuin de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Diario oficial de la Federación. México. DF. 15 de agosto de 1994.         [ Links ]

13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. 8th ed. Approved standard M100-S13. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, 2004.         [ Links ]

14. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Thirteenth Informational Suplement. 8th ed. Approved standard M100-S13. National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004.         [ Links ]

15. Blanco M, Blanco JE, Mora A, Rey J, Alonso JM, Hermoso M, et al. Serotypes, virulence genes and intimin types of Shiga toxin (Verotoxin)-producing EscRericRia coli isolated from healthy sheep in Spain. J Clin Microbiol 2003;41:1351-1356.         [ Links ]

16. Gun H, Yilmaz A, Turkerb S, Tanlasia A, Yilmaz H. Contamination of bovine carcasses and abattoir environment by EscRericRia coli O157:H7 in Istanbul. Int J Food Microbiol 2003;84:339-344.         [ Links ]

17. Abdul-Raouf UM, Ammar MS, Beuchat LR. Insolation of EscRericRia coli O157:H7 from some Egyptian foods. Int J Food Microbiol 1996;29:423-426.         [ Links ]

18. Guyon R, Dorey F, Malas JP, Grimont JF, Rouviere B, Collobert JF. Superficial contamination of bovine carcasses by EscRericRia coli O157:H7 in a slaughterhouse in Normandy (France). Meat Sci 2001;58:329-331.         [ Links ]

19. Byrne CM, Erol I, Call JE Kaspar CW, Buege DR, Hiemke CJ, et al. Characterization of EscRericRia coli O157:H7 from Downer and Healthy Dairy Cattle in the Upper Midwest Region of the United States. Appl Environ Microbiol 2003;69:4683-4688.         [ Links ]

20. Donkersgoed JV, Graham T, Gannon V. The prevalence of verotoxins, EscRericRia coli O157, and Salmonella in the feces and rumen of cattle at processing. Can Vet J 1999;40:332-338.         [ Links ]

21. Irino K, Kato MAMF, Vaz TMI, Ramos II, Souza MAC, Cruz AS, et al. Serotypes and virulence markers of shigo toxin-producing EscRericRia coli (STEC) insolated from dairy cattle in Sao Paulo State, Brazil. Vet Microbiol 2005;105:29-36.         [ Links ]

22. Johnsen G, Wasteson Y, Heir E, Ivar BO, Herikstad H. EscRericRia coli O157:H7 in faeces from cattle, sheep and pigs in the southwest part of Norway during 1998 and 1999. Int J Food Microbiol 2001;65:193-200.         [ Links ]

23. Armstrong GL, Hollingsworth J, Morris JG. Emerging foodborne pathogens: EscRericRia coli O157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the developed world. Epidemiol Rev 1996;18:29-49.         [ Links ]

24. Dean-Nystrom E, Bosworth TB, Moon WH, O'brien DA. EscRericRia coli O157: H7 requires intimin for enteropathogenicity in calves. Infect Immun 1998;66:4560-4563.         [ Links ]

25. Yilmaz A, Gun H, Ugur M, Turan N, Yilmaz H. Detection and frequency of VT1, VT2 and eaeA genes in EscRericRia coli O157:H7 strains isolated from cattle, cattle carcasses and abattoir environment in Istambul. Int J Food Microbiol 2006; 106:213-217.         [ Links ]

26. Alali WQ, Sargeant JM, Nagaraja TG, DeBey BM. Effect of antibiotics in milk replacer on fecal shedding of EscRericRia coli O157:H7 in calves. J Anim Sci 2004;82:2148-2152.         [ Links ]

27. Ratman S, March BS, Ahmed R, Bezanson SG, Kasatiya S. Characterization of EscRericRia coli Serotype O157:H7. J Clin Microbiol 1988;26:2006-2012.         [ Links ]

28. Galland JC, Hyatt DR, Crupper SS, Acheson DW. Prevalence, antibiotic susceptibility, and diversity of E coli O157:H7 isolates from a longitudinal study of beef cattle feedlots. Appl Environ Microbiol 2001;67:1619-1627.         [ Links ]