El silenciamiento de la proteína priónica celular (PrP^C) mediante RNA de interferencia (siRNA) reduce la infección por HSV-1 y HSV-2 en células SK-SY5Y

Silencing of the cellular prion protein (PrP^C), by interference RNA (siRNA), reduces HSV-1 and HSV-2 infection in SK-SY5Y cells

Elizabeth Ortega-Soto^a, Zaira Esperanza Arellano-Anaya^a, Ana Carolina Castañeda-Colín^a, Blanca Lilia Barrón-Romero^a

^a Laboratorio de Virología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala S/N, Casco de Santo Tomas, México D.F. 11340, Delegación, Miguel Hidalgo México. Teléfono: (52-55) 57296300 ext. 62377. bbarron@ipn.mx, blbr49@yahoo.com. Correspondencia al último autor.

Recibido el 22 de noviembre de 2011.
Aceptado el 16 de enero de 2012.

RESUMEN

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son enfermedades neurodegenerativas fatales que afectan a humanos y ciertas especies animales. La hipótesis más aceptada indica que el agente infeccioso, denotado como prion y compuesto principalmente por la Proteína Priónica Scrapie (PrP^Sc), corresponde a una conformación anormal de una proteína codificada por el huésped denominada Proteína Priónica Celular (PrP^C), cuya función es aún desconocida; sin embargo, la expresión ubicua de PrP^C así como su elevado grado de conservación entre especies, sugieren un papel importante para esta proteína. En este trabajo se detectó a la PrP^C en diferentes tipos celulares incluyendo un cultivo primario de células de peces (Tilapia, Oreochromis spp.). Además, basándonos en la secuencia de la PrP^C humana, se diseñó un RNA de interferencia (siRNA) con el fin de silenciar el gen PRNP en células neuronales SK-SY5Y. El siRNA diseñado inhibió la expresión de PrP^C a lo largo de las 96 h post-transfección y las células silenciadas fueron menos susceptibles a la infección por HSV-1 y HSV-2, en comparación con células no transfectadas con el siRNA.

Palabras clave: Proteína Priónica, PrP^C, siRNA, HSV-1, HSV-2.

ABSTRACT

The transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are neurodegenerative and fatal diseases, affecting humans and some other animal species. The most accepted hypothesis suggests that the infectious agent, named "prion", is composed mainly by the prion protein scrapie (PrP^Sc) and it corresponds to an abnormal conformation of a host encoded protein, the cellular prion protein (PrP^C), which function is still unknown. However, the ubiquitous expression of PrP^C and its highly conserved presence among different species suggests it has a very important role in cell functions. In this work, the PrP^C in different cell types, including a primary fish cell culture (Oreochromis spp.), was detected. In addition, based on the human PrP^C sequence, we designed a short interfering RNA (siRNA) to silence the PRNP gen in neuronal SK-SY5Y cells. The designed siRNA inhibited the PrP^C expression along 96 hours post-transfection and the silenced cells were less susceptible to HSV-1 and HSV-2 infections, in comparison to non siRNA-transfected cells.

INTRODUCCIÓN

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), también conocidas como enfermedades priónicas, son un grupo de padecimientos que afectan tanto a animales como al ser humano, y se caracterizan por presentar un período de incubación de años y un amplio espectro de manifestaciones neurológicas, debido a la pérdida de neuronas del sistema nervioso central (SNC) por áreas, acompañada de una activación de astrocitos, sin infiltrado inflamatorio y generalmente con depósitos de placas amiloides (material proteínico con un alto contenido de tiras b-plegadas)^(1,2).Estas enfermedades incluyen al Kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), el síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) y el Insomnio Familiar Fatal (IFF) en seres humanos, así como el Scrapie en ovejas y cabras, la encefalopatía esponjiforme bovina (EEB), y encefalopatías en visones, felinos, venados y alces^(3-5). Todas ellas se relacionan con la presencia de una forma anormal de la Proteína Priónica Celular (PrP^C), denominada como Proteína Priónica Scrapie (PrP^Sc), la cual se considera el agente causal de las EETs.

La PrP^C se encuentra altamente conservada entre diferentes especies de mamíferos, aves y peces; sin embargo su función aún no se ha dilucidado. Ratones a los que se les ha eliminado la PrP^C pueden sufrir alteraciones en la función hipocampal, el aprendizaje espacial, el metabolismo de cobre, fagocitosis y la respuesta inflamatoria. La PrP^C se expresa en neuronas y otras células del SNC, pero también se ha detectado en células del sistema inmune, entre otras⁽⁶⁾. La presencia de PrP^C en diferentes tipos de células hace posible su transmisión, ya que se considera que la PrP^Sc es capaz de amplificarse trasfiriendo sus características bioquímicas a la PrP^C.

Con el fin de elucidar la función de la PrP^C, se han utilizado RNAs de interferencia (siRNA), para bloquear la expresión específica de dicha proteína, al interaccionar e inducir la degradación del correspondiente mRNA, mediante la activación de la enzima Slicer. En cabras se ha demostrado la reducción de la expresión de PrP^C(7) mediante siRNA. Ratones tratados con siRNA mostraron un incremento en la supervivencia después de ser inoculados con la cepa priónica RML debido a la disminución de la expresión de PrP^C(8). En cultivos celulares como N2a y GT-1 se ha logrado silenciar el gen PRNP previniendo así la formación de PrP^Sc(8). Usando un siRNA complementario a los codones 392 al 410 de la PrP^C murina se han curado células N2aS12sc+ infectadas persistentemente con priones⁽⁹⁾. Los siRNAs son eficaces contra todas las cepas de PrP^Sc(10), sin embargo, se carece de un mecanismo que inserte estas moléculas en la célula blanco. Recientemente se ha propuesto el uso de péptidos acarreadores, capaces de reconocer receptores de acetilcolina, y llevan adheridos siRNAs dirigidos contra las secuencias 1578, 1633 y 1672 (a partir del sitio de inicio de la trascripción de la PrP^C murina), con los que se ha logrado reducir la expresión de PrP^C, así como la formación de PrP^Sc en cultivos celulares infectados⁽¹¹⁾. Por otro lado, se ha observado que ratones que expresan niveles altos de PrP^C incrementan su susceptibilidad a la infección con el virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) y la carencia de la expresión de PrP^C favorece el establecimiento de la latencia de HSV⁽¹²⁾.

En este trabajo se propuso la búsqueda de PrP^C en diferentes sustratos celulares, así como el diseño de un siRNA basado en la secuencia de la PrP^C humana, el cual fue capaz de silenciar a la PrP^C en células de neuroblastoma humano (SK-SY5Y). Dichas células mostraron una susceptibilidad reducida contra infecciones producidas por HSV-1 y HSV-2, lo que sugiere que la alteración de la expresión PrP^C también podría modular algunas infecciones virales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Detección de la proteína priónica celular mediante inmunohistoquímica (IHC) y Western Blot

El Western blot se realizó con homogeneizados celulares a partir de cultivos celulares confluentes. Las células se resupendieron en agua y posteriormente se centrifugaron. Las proteínas de los homogeneizados celulares se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% (bajo condiciones desnaturalizantes) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon con leche descremada al 5%. La detección inmunológica se llevó a cabo incubando con el mAb 6H4 (Prionics®) o el mAb 3F4 (SIGNET®), el anticuerpo no unido se lavó con PBS. A continuación las tiras se sometieron a incubación con el anticuerpo secundario (conjugado con fosfatasa alcalina), eliminando el exceso con lavados con PBS. Finalmente la reacción antígeno anticuerpo se evidenció adicionando BCIP/NBT.

Silenciamiento de PrP^C

Se diseñó un siRNA, basado en la secuencia de la PrP^C humana (clave de acceso AY569456), con ayuda de los programas BLOCKit TM RNAiDesigner (Invitrogen®), siRNA Desing Tool (QIAGEN®), siRNA Target finder (AMBION®), SiRNAdesigner (Bioinformatics and Research Computing, Whitehead Institute). Se eligieron las secuencias que aparecieron con mayor frecuencia en todos los programas usados; de ellas se seleccionaron las que cumplieran con los criterios de Reynolds^{(13 )}. El siRNA se sintetizó en Invitrogen® obteniendo la cadena sentido y antisentido con dos nucleótidos extra en los extremos 3'. Para llevar a cabo el silenciamiento, las células SK-SY5Y fueron propagadas en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino y se transfectaron con el siRNA usando el RNAiStarter Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen ®). Brevemente, 8X10⁴ células se sembraron en cada pozo de una microplaca de cuatro pozos (1.9 cm² de superficie por pozo); una vez alcanzada una confluencia entre 50 y 80 %, las células se transfectaron con 1 mg de siRNA en 100 de regulador EC-R al que se agregaron 6 de RNAiFect. A las células se les adicionaron 300 de medio de cultivo y la mezcla siRNA-RNAiFect. Las células se incubaron y a diferentes tiempos de post-transfección se procedió a verificar el silenciamiento de PrP^C mediante la detección de la proteína por Western Blot, como se describió anteriormente. Como control negativo se utilizó un siRNA que no tiene complementariedad conocida contra genes de mamíferos (RNAiStarter Kit). Como testigo positivo de silenciamiento, se empleó el siRNA contra lamin A/C y el silenciamiento de la lamin A/C se corroboró mediante Western blot empleando un anticuerpo anti lamin A/C (Donado por el Dr. Carlos Arias, IBT UNAM) el cual se evidenció con un anticuerpo anti ratón conjugado a fluoresceína.

Infección con HSV-1 y 2 en las células silenciadas

8X10⁴ células silenciadas se crecieron en microplacas de cuatro pozos y se incubaron por 24 h, posteriormente se infectaron con HSV-1 o HSV-2 a una MOI de 1 y se incubaron a 37 °C hasta observar efecto citopático. El virus se cosechó por congelamiento y descongelamiento de las células separando el sobrenadante por centrifugación. El virus obtenido se tituló por el método de TCID₅₀ y se calculó mediante la fórmula de Spearman-Kárber. Como testigo se utilizaron células sin transfectar con el siRNA, las cuales fueron infectadas con HSV-1 y HSV-2.

RESULTADOS

Detección de PrP^C en cultivos celulares

Con el fin de estandarizar la detección de PrP^C en cultivos celulares, se analizó la presencia de PrP^C por Western blot en líneas celulares de tipo neuronal NIE-115 y SK-SY5Y, en células de tipo monocito-macrófago GCT, U-937, J-774 y P-338 y en la línea celular Vero. La proteína de PrP^C se encontró presente en todos los tipos de células utilizadas y en la Figura 1A se muestra, como ejemplo, la detección de PrP^C en células NIE-115 y Vero mediante IHC. En la Figura 1B se observa la detección de PrP^C mediante el uso de Western blot en extractos obtenidos a partir de células Vero y SK-SY5Y. La PrP^C también fue detectada en un cultivo primario de Tilapia (Figura 1C), lo que demuestra que la PrP^C se expresa en muy diversos tipos celulares, y sugiere que esta proteína se encuentra conservada entre diversas especies animales incluidas los peces.

Diseño del siRNA contra PrP^C

Ya que la PrP^C se encuentra ampliamente distribuida entre diversas especies y además entre los diferentes tipos celulares probados, se diseñó un siRNA dirigido contra la PrP^C humana con el fin de silenciar su gen. Cinco secuencias encontradas mediante el uso de diferentes programas para generar siRNAs fueron seleccionadas y analizadas bajo los criterios de Reynolds⁽¹³⁾. El siRNA correspondiente a los nucleótidos del 297 al 319 del mRNA de la PrP^C humana mostró siete de los ocho criterios propuestos para un siRNA. La secuencia correspondiente a dicho siRNA es S5': ACAAG CCGAGUAAGCCAAA dTdT, cuya secuencia antisentido es: 3' TdTd UGUUCGGCUCAU UCGGUUU. Con el fin de verificar que el siRNA diseñado era capaz de unirse al mRNA de PrP^C se analizó la estructura probable del mRNA de PrP^C con ayuda de los programas RNA structure⁽¹⁴⁾ y RNA fold⁽¹⁵⁾. Se generaron diversas estructuras, pero sólo se seleccionó una estructura subóptima, que es la que tiene mayor estabilidad, y en ella se marca el sitio blanco de unión del siRNA. En esa región se ven claramente zonas no apareadas ("loop") de manera que al inicio, en medio y al final se ese sitio se pueden unir el siRNA (Figura 2A y B). Para verificar que el siRNA diseñado era específico para PrP^C humana, se llevó a cabo un blast que arrojó como resultado homología de dicha secuencia para la PrP^C humana con valores de identidad del 100% (Valor E 0.040). El siRNA comparte un 68 % de su secuencia con el gen de la ribonucleoproteína nucleolar pequeña U3 (Valor E de 150) lo que hace poco probable su unión a mRNAs correspondientes a otras proteínas. También se realizó la búsqueda en la base de datos de virus, obteniendo como secuencia similar al virus del mosaico del calabacín (identidad 73 %, valor E 13) y el virus de la fiebre aftosa (identidad 73 %, valor E 13), sin que ninguno de los dos datos sea significativo para señalar una posible interacción entre el siRNA diseñado y dichos virus, eliminando así la posibilidad de interacción entre el siRNA y los virus herpes.

Silenciamiento de PrP^C mediante el siRNA

Una vez sintetizado el siRNA se procedió a transfectar las células SK-SY5Y. El siRNA silenció el gen de la PrP^C en las células transfectadas mientras que las células sin siRNA expresaron la PrP^C de manera normal. El testigo positivo de silenciamiento, siRNA contra lamin A/C fue capaz de silenciar a su proteína blanco, por lo que el anticuerpo anti lamin A/C no se pudo unir a las células transfectadas (datos no mostrados). La expresión de PrP^C al ser analizada a diferentes tiempos post-transfección por Western blot usando el mAb 3F4 mostró la inhibición de la expresión de la PrP^C desde las 24 hasta las 96 h post-transfección (Figura 3).

DISCUSIÓN

La PrP^C se encuentra altamente conservada entre mamíferos, y es expresada en diferentes tipos celulares, sin embargo su función no se ha dilucidado. En el presente trabajo se diseñó un siRNA contra la PrP^C humana que puede ser útil para el estudio de la función de dicha proteína, así como una posible terapia contra estas enfermedades en diferentes especies animales.

En primer lugar analizamos la presencia de PrP^C en cultivos celulares con el fin de estandarizar su detección en diversas células. La PrP^C se detectó en cultivos celulares de tipo monocito-macrófago mediante IHC y Western Blot. En trabajos previos, la PrP^Sc se ha encontrado asociada con linfocitos B pero no con monocitos; sin embargo la PrP^C se ha detectado en plaquetas, células NK, linfocitos T CD8⁺ y CD4⁺, linfocitos B y granulocitos en sangre⁽¹⁶⁾. En virtud de que todas las células analizadas (NIE-115, SK-SY5Y, GCT, U-977, P-338 y Vero) presentaron la proteína PrP^C, se propuso la búsqueda de la PrP^C en cultivos primarios de células de epidermis de Tilapia (Oreochromis spp.), considerando que su presencia puede ser un indicativo de la posibilidad de la adquisición de la enfermedad, encontrando la expresión de PrP^C en dichas células, lo que correlaciona con reportes previos donde se detectó la presencia de un mRNA para PrP^C en el pez fugu japonés (Takifugu rubripes)⁽¹¹). Además, en apoyo a nuestro hallazgo, se ha sugerido que la proteína de peces posee una estructura 3D similar a la PrP^C de mamíferos, se encuentra glicosilada y posee glicofosfadil inositol (GPI) como molécula de anclaje⁽¹⁸⁾. La PrP^C de Tilapia fue reconocida mediante el mAb 6H4. Previamente se reportó que los anticuerpos 6H4 y 12F10 no reconocieron a la PrP^C del pez conocido como la dorada (Sparus aurata), así como la PrP^C de mamíferos no es reconocida por anticuerpos policlonales dirigidos contra la PrP^C de peces⁽¹⁹⁾. Sin embargo, se sabe que el anticuerpo 6H4 reconoce el péptido DYEDRYYRE⁽²⁰⁾, el cual está presente en humanos, bovinos, ovejas, conejos, mink y primates. Dicha secuencia se encuentra en la proteína priónica humana entre los aminoácidos 144-152. Aunque en ratón, hámster y rata la tirosina de la posición 145 está reemplazada por un triptófano, este cambio no impide que la proteína PrP reaccione con el mAb 6H4 (Prionics®). Por lo que podemos suponer que este epítopo, que está altamente conservado en diferentes especies de mamíferos⁽²¹⁾, pudiera encontrarse también en la PrP^C de Tilapia, cuya secuencia aún no se ha publicado. La presencia de PrP^C en peces tiene suma importancia, ya que posibilita la transmisión de PrP^Sc entre ellos, especialmente si consideramos la existencia de canibalismo entre peces. Experimentalmente, en espáridos infectados con BSE y scrapie no se observaron signos de enfermedad, sin embargo se observó la acumulación de PrP^Sc(19), sugiriendo la posibilidad de una diseminación del agente infeccioso, lo cual pudiera representar incluso un riesgo para la salud humana, aunque a la fecha esto no se ha demostrado.

Basándonos en el hecho de la alta conservación de la PrP^C se diseñó un siRNA que tiene como blanco la región comprendida entre los nucleótidos 297 al 319 del mRNA de la PrP^C humana. Este siRNA fue capaz de silenciar la expresión de PrP^C en un cultivo celular de neuroblastoma humano (SK-SY5Y), ya que después de la transfección con el siRNA, las células no mostraron presencia de la PrP^C desde las 24 h post-transfección y a lo largo de las 96 h que fue el tiempo que se analizó (Figura 3), lo que demostró que el siRNA diseñado era efectivo para inhibir la expresión de PrP^C durante un periodo de tiempo amplio. Se observó que a las 96 h post-tranfección hay una reducción de la expresión en las células no transfectadas con siRNA, en comparación con los obtenidos a las 24, 48 y 72 h, esto probablemente se debe al envejecimiento de las células en el cultivo. La detección de la PrP^C se llevó a cabo con el mAb 3F4, que reconoce a los residuos del 109 al 112 de la proteína priónica de humanos, hámster y felinos, y reconoce tanto a la PrP^C como a PrP^Sc(22). Con el fin de demostrar que la proteína detectada correspondía a la forma celular se llevó a cabo la desnaturalización por calor de los extractos celulares, y no se observó reacción (datos no mostrados). Dado que el silenciamiento redujo la expresión de la PrP^C de humano, este siRNA diseñado podría tener fines terapéuticos, ya que al disminuir la proteína priónica PrP^C, se reduce la formación de la forma anormal patogénica PrP^Sc y por lo tanto, la gravedad de la infección. El hecho de que la PrP^C se exprese en células sanguíneas del tipo monocito macrófago, podría representar un importante blanco para bloquear la replicación y la transmisión de la PrP^Sc. Se han reportado evidencias de la posible transmisión de PrP^Sc por sangre^(23-25), por lo tanto el silenciamiento de PrP^C en el flujo sanguíneo podría reducir el nivel de infección o su rapidez de diseminación hacia el SNC.

Nuestros resultados demuestran el silenciamiento de PrP^C mediante el uso de un siRNA dirigido contra la región 297 al 319 del mRNA. En otros trabajos los siRNAs han sido dirigidos contra otras regiones, por ejemplo, los codones 108 al 114 y del 171 al 177 de la PrP^C humana⁽²⁶⁾ y el codón 392 al 410 de la PrP^C de ratón, y también son capaces de reducir la expresión de PrP^C(9), lo que nos indica que el silenciamiento de la PrP^C se puede lograr mediante siRNAs dirigidos contra diferentes blancos en el mRNA y que la misma estrategia podría usarse para el control de enfermedades priónicas en animales exóticos, y reducir la posibilidad de transmisión entre individuos.

Se observó que el silenciamiento de PrP^C disminuye la infección por HSV-1 y HSV-2 en un 49 y 67 % respectivamente, lo que concuerda con observaciones previas realizadas en ratones carentes de PrP^C(12). Dichos datos apoyan la idea de que la PrP^C está involucrada en señales celulares que pueden modificar el comportamiento de células de tipo neuronal, y dichas modificaciones podrían modular la entrada y la replicación de algunos virus neurotrópicos como es el caso de herpes. Se ha considerado que la PrP^C puede estar asociada a la apoptosis, específicamente a interacciones con STI1 y algunos ligandos como Bcl-2, Hsp60, Bip, Nrf-2, apolipoproteina A1, así como con moléculas de adhesión celular, heparina, laminina y el receptor de laminina⁽²⁷⁾, por lo que puede considerarse que una expresión aberrante de PrP^C podría modificar las cascadas de señalización incluyendo Fyn, P13, cinasa/act, cAMP-dep, protein cinasas y MAP cinasas, las cuales contribuyen al crecimiento y supervivencia de neuronas en cultivo⁽²⁸⁾. Ratones carentes de PrP^C también muestran una actividad aumentada de ERK-II, STAT-I y caspasa-3^(29,30), lo que pudiera estar relacionado con la disminución en la producción de la progenie viral en células carentes de PrP^C al promoverse una apoptosis en etapas tempranas del ciclo de replicación viral, dando como resultado un acortamiento en el tiempo requerido para la producción óptima de partículas virales. Ratones PrP-/- también exhiben un aumento en la infección latente por HSV-1 sugiriendo la modulación de PrP^C en este proceso⁽¹²⁾.

Otro posible mecanismo pudiera ser la afección a nivel de interacción virus-receptores celulare (aunque a la fecha no se ha involucrado la participación de ningún receptor celular de tipo PrP^C para los HSV), o lo más probable, por medio de una alteración de las vías de señalización, que permiten el reclutamiento de proteínas celulares que contribuyen en la transcripción de los genes virales⁽³¹⁾ y por lo tanto su ausencia o disminución afecta la expresión de los genes virales y por ende la producción de nuevos virus.

El hecho de que PrP^C se exprese de forma ubicua en células de diferentes tipos y que se puede lograr el silenciamiento específico de la proteína PrP^C_, hace factible la idea de una terapia con siRNA teniendo como blanco células que participan en la diseminación del agente causal en las primeras etapas de la infección. Por otro lado, el silenciamiento de algunos genes celulares que afecten a la replicación de algunos virus puede ser de utilidad en el tratamiento de enfermedades virales. Dado que los herpesvirus se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, ya que para cada especie animal, hay por lo menos un herpesvirus que lo infecta⁽³²⁾, sería interesante verificar si el siRNA diseñado contra PrP^C es también capaz de reducir la producción de progenie viral de otros herpesvirus que producen neuropatías, algunos de los cuales tienen gran interés veterinario como los herpes que producen la enfermedad de Aujeski en cerdos o los que afectan a otros mamíferos como elefantes, delfines, e inclusive animales de sangre fría como las tortugas y batracios.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. Carlos Barrón por su ayuda en el análisis estadístico sobre la infección herpética y al Dr. Carlos Arias por la donación del mAb anti lamin. EOS es becaria posdoctoral de CONACyT (Proyecto CB-2008/99164), ZEAA y ACC fueron becarias CONACyT y PIFI durante la elaboración de este trabajo. El proyecto fue financiado por CONACyT CB-2008/99164 y por la Secretaría de Investigación y Posgrado del IPN, SIP20060408 y 20110737.

LITERATURA CITADA

1. Mastrianni JA, Roos RP. The Prion Diseases. Semin Neurol 2000;(20):337-352.         [ Links ]

2. Prusiner S, Telling G, Cohen F, DeArmond SJ. Prion diseases of human and animals. Sem Virol 1996; (7):159-173.         [ Links ]

3. Eigen M. Priones y encefalopatía espongiforme bovina. Sci Am 2001;(298):74-83.         [ Links ]

4. Belay ED, Schonberger LB. The public impact of prion diseases. Annu Rev Pub Health 2005;(26):191-212.         [ Links ]

5. Martins VR, Mercadante AF, Cabral AL, Freitas AR, Castro MR. Insights into the physiological function of cellular prion protein. Braz J Med Biol Res 2001;(34):585-595.         [ Links ]

6. Flechsig E, Weissmann C. The role of PrP in health and disease. Curr Mol Med 2004;(4):337-353.         [ Links ]

7. Golding MC, Long CR, Carmell MA, Hannon GJ, Westhusin ME. Suppression of prion protein in livestock by RNA interference. Proc Natl Acad Sci 2006;(103):5285-5290.         [ Links ]

8. White MD, Farmer M, Mirabile I, Brandner S, Collinge J, et al. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice with prion disease. Proc Natl Acad Sci 2008;(105):10238-10243.         [ Links ]

9. Daude N, Marella M, Chabry J. Specific inhibition of pathological prion protein accumulation by small interfering RNAs. J Cell Sci 2003;(116):2775-2779.         [ Links ]

10. White MD, Mallucci GR. Therapy for prion diseases: Insights from the use of RNA interference. Prion 2009;(3)121-128.         [ Links ]

11. Pulford B, Reim N, Bell A, Veatch J, Forster G et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrP^C on neuronal cells and PrP^RES in infected cell cultures. PLoS ONE 2010;(5):e11085.         [ Links ]

12. Thackray AM, Bujdoso R PrPc. Expression Influences the Establishment of Herpes Simplex Virus Type 1 Latency. J Virol 2002;(76):2498-2509.         [ Links ]

13. Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotech 2004;(22):326-330.         [ Links ]

14. Zuker M, Mathews DH, Turner DH Turner Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In: Barciszewski J, Clark BFC, editors. RNA Biochemistry and biotechnology: NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, 1999.         [ Links ]

15. Hofacker IL.Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res 2003;(31):3429-3431.         [ Links ]

16. Choi EM, Geschwind MD, Deering C, Pomeroy K, Kuo A, et al. Prion proteins in subpopulations of white blood cells from patients with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Lab Invest 2009;(89):624-635.         [ Links ]

17. Rivera-Milla E, Stuermer CAO, Málaga-Trillo E. An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA. Trends Genet 2003;(19):72-75.         [ Links ]

18. Miesbauer M, Bamme T, Riemer C, Oidtmann B, Winklhofer KF, et al. Prion protein-related proteins from zebrafish are complex glycosylated and contain a glycosylphosphatidylinositol anchor. Biochem Biophys Res Commun 2006;(341):218-224.         [ Links ]

19. Salta E, Panagiotidis C, Teliousis K, Petrakis S, Eleftheriadis E, et al. Evaluation of the Possible Transmission of BSE and Scrapie to Gilthead Sea Bream (Sparus aurata). PLoS ONE 2009;(4):e6175.         [ Links ]

20. Korth C, Stierli B, Streit P, Moser M, Schaller O, et al. Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature1997;(390):74-77.         [ Links ]

21. van Rheede T, Smolenaars MMW, Madsen O, de Jong WW. Molecular Evolution of the mammalian prion protein. Mol Biol Evol 2003;(20):111-121.         [ Links ]

22. Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, et al. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie- associated fibril proteins. J Virol 1987;(61):3688-3693.         [ Links ]

23. McCutcheon S, Alejo Blanco AR, Houston EF, de Wolf C, Tan BC, et al. All clinically-relevant blood components transmit prion disease following a single blood transfusion: A sheep model of vCJD. PLoS ONE 2011;(6):e23169.         [ Links ]

24. Llewelyn CA, Hewitt PE, Knight RSG, Amar K, Cousens S, et al. Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion. The Lancet 2004;(363):17-421.         [ Links ]

25. Hunter N, Foster J, Chong A, McCutcheon S, Parnham D, et al. Transmission of prion diseases by blood transfusion. J Gen Virol 2002; (83):2897-2905.         [ Links ]

26. Wang Z-Y, Tian C, Jing Y-Y, Gong H-S, Guo Y, et al. Knockdown of prion protein (PrP) by RNA interference weakens the protective activity of wild-type PrP against copper ion and antagonizes the cytotoxicity of fCJD-associated PrP mutants in cultured cells. Int J Mol Med 2011;(28):413-421.         [ Links ]

27. Gauczynski S, Hundt C, Leucht C, Weiss S. Interaction of prion proteins with cell surface receptors, molecular chaperones, and other molecules. Adv Protein Chem 2001;(57):229-272.         [ Links ]

28. Chen S, Mangé A, Dong L, Lehmann S, Schachner M. Prion protein as trans-interacting partner for neurons is involved in neurite outgrowth and neuronal survival. Mol Cell Neurosci 2003;(22):227-233.         [ Links ]

29. Spudich A, Frigg R Kilic E, Kilic Ü, Oesch B, et al. Aggravation of ischemic brain injury by prion protein deficiency: Role of ERK-1/-2 and STAT-1. Neurobiology of Disease 2005;(20):442- 449.         [ Links ]

30. Weise J, Sandau R, Schwarting S, Crome O, Wrede A, et al. Deletion of cellular prion protein results in reduced Akt activation, enhanced postischemic Caspase-3 activation, and exacerbation of ischemic brain injury. Stroke 2006;(37):1296-1300.         [ Links ]

31. Roizman B. The Checkpoints of viral gene expression in productive and latent infection: the role of the HDAC/CoREST/ LSD1/REST repressor complex. J Virol 2011;(85):7474-7482.         [ Links ]

32. Pellet PE, Roizman B. The Family Herpesviridae: A brief introduction. In: Knipe DM, Howley P, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA et al., editors. Fields' virology. 5th ed. New York: Lippincott-Williams and Wilkins; 2007: 2479-2499.         [ Links ]