Expresión de la proteína E del virus del Oeste del Nilo en callos embriogénicos de maíz, transformados mediante biobalística

West Nile virus E protein expressed in transformed corn embryogenic callus type II, by biobalistic

Luis Gómez–Núñez^ab, María Teresa de Jesús Olivera Flores^c, Lilia Soto Ruiz^a, Miguel Angel Gómez–Lim^d, Elizabeth Loza–Rubio^a

^a Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias INIFAP–CENID Microbiología Animal, Carretera México Toluca Km. 15,5. Colonia Palo Alto. 05110. México D, F. loza.elizabeth@inifap.gob.mx. Correspondencia al último autor.

^c Facultad de Química–UNAM. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales.

^d CINVESTAV Irapuato. Instituto Politécnico Nacional.

Recibido el 10 de mayo de 2010
Aceptado el 4 de octubre de 2010

RESUMEN

La clonación y expresión heteróloga de antígenos de agentes patógenos que afectan humanos y animales, ha demostrado ser una buena alternativa para la obtención de vacunas subunitarias. En este estudio se analiza la expresión estable del gen E que codifica la glicoproteína de envoltura del virus del Oeste del Nilo (VON) en callos embriogénicos de maíz, que fueron transformados mediante biobalística empleando el promotor constitutivo CAMV35S. La expresión del transgen fue determinada mediante RT–PCR en los callos embriogénicos de maíz transformados con la secuencia codificante de la glicoproteína E del VON. Para verificar la expresión de la proteína se realizó un Western blot con extractos de la proteína soluble total (PST) de los callos transformados. De esta manera se identificó una proteína de 68 kDa. Empleando este sistema de expresión se pudo obtener un 0.86 % de PST. En este estudio por primera vez se analiza la expresión de la glicoproteína E del virus del Oeste del Nilo en callos embriogénicos de maíz. Siendo la glicoproteína E del VON la responsable de la inducción de la inmunidad en contra de este virus, esta investigación representa un avance importante en el diseño de un inmunógeno experimental, que permitiría iniciar estudios en animales de laboratorio, con la finalidad de obtener una vacuna prototipo para la prevención y el control de la infección por el VON.

Palabras clave: Callos embriogénicos de maíz, Proteína E, Virus del Oeste del Nilo.

ABSTRACT

Cloning and heterologue expression of antigens to pathogenic agents which affect humans and animals is an effective way of producing subunitary vaccines. An analysis was done of stable expression of the E gene coding for the West Nile Virus (WNV) envelope (E) glycoprotein in corn type II embryogenic callus transformed with biobalistics using the constitutive CAMV35S promoter. This protein is responsible for WNV immunity induction. Transgene expression in transformed calluses with the WNV E glycoprotein was identified by RT–PCR. Western Blot was used to verify protein expression with total soluble protein (TSP) extracts from the transformed calluses. A 68 kDa protein was identified and 0.86 % TSP attained. This WNV E glycoprotein production system allows production of this protein in almost half the time of conventional techniques, a significant advance in experimental immunological design. This is the first time that this kind of evaluation was done. We suggest evaluating the transformed embryogenic calluses in animals by oral route in order to test its efficacy as a candidate of vaccine.

Key words: Corn embryogenic callus, E Protein, West Nile virus.

INTRODUCCIÓN

El virus del Oeste del Nilo (VON), es miembro del género Flavivirus, la partícula que envuelve al virión mide entre 45 y 50 nm de diámetro, presenta un núcleo icosahedrico, posee en su interior una sola cadena de ARN de sentido positivo de aproximadamente 11,000 nucleótidos⁽¹⁾. El ARN es un solo marco de lectura que codifica para diez proteínas, entre ellas la glicoproteína de envoltura (E) juega un papel importante en la fusión a la membrana y se reconoce como el principal antígeno y promotor de anticuerpos neutralizantes del virus⁽²⁾. Es por ello que ha sido elegida el principal blanco para elaborar inmunógenos de nueva generación. Estos biológicos han utilizado diferentes vectores, como: lentivirus, baculovirus, e incluso el virus del sarampión. Por otro lado, una sola inmunización con una vacuna de ADN desnudo que codifica para las proteínas prM y la E ha demostrado tener la capacidad de estimular una respuesta inmune y proteger eficazmente a ratones y a caballos⁽³⁾.

Actualmente en México, existen dos vacunas de virus inactivado para la prevención del VON en equinos, la primera se encuentra disponible en los EUA (Fort Dodge®), que confiere una protección del 94 % de los animales inmunizados ante un desafío por vía parenteral⁽⁴⁾ y la producida por la Productora Nacional de Biológicos Veterinarios (PRONAVIVE), que obtuvo buenos resultados de protección⁽⁵⁾. La inmunización con estas vacunas resulta costosa debido a que requieren inicialmente de la aplicación de dos dosis continuas para que la protección sea completa, además el contener al virus completo dificulta la vigilancia epidemiológica, puesto que no se puede diferenciar entre animales vacunados de los infectados en el campo.

La biotecnología basada en plantas ha permitido la obtención de diversos productos como: vacunas, proteínas terapéuticas, enzimas y anticuerpos^(6,7). Los callos embriogénicos de maíz han sido comúnmente utilizados para la expresión de proteínas heterólogas, por ser un sistema útil para la transformación mediante biobalística y para la obtención de plantas transgénicas. El callo Tipo II procedente del escutelo, es de crecimiento rápido con la presencia de numerosos embriones somáticos, que mantienen su capacidad embriogénica y regenerativa por periodos largos^(8,9). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue expresar e identificar a la proteína E del virus del Oeste del Nilo en callos embriogénicos de maíz tipo II (Zea mays L), para implementar un nuevo sistema de expresión.

Establecimiento de los callos embriogénicos de maíz

El establecimiento y transformación de los callos embriogénicos de maíz tipo II fue realizado en el Laboratorio de Cultivo de tejidos Vegetales del Departamento de Bioquímica–UNAM. Los callos línea costeño, se obtuvieron a partir de embriones cigóticos inmaduros a los 15 días después de la polinización. La inducción de los callos embriogéncos y la transformación genética fue realizada de acuerdo a lo reportado por JimenezVillalobos⁽¹⁰⁾.

Construcción del vector de expresión para la proteína E del VON y análisis de restricción

La secuencia codificadora del gen E del virus del Oeste del Nilo de 1,503 pb, con número de acceso AY660002 se obtuvo del GenBank, la cual corresponde a la cepa aislada de un cuervo (Corvus corax) en el estado de Tabasco, México (TM–17103)⁽¹¹⁾. Dicha secuencia fue clonada dentro del plásmido pCambia 3301. La construcción nombrada INIFAP–VON 3301 fue utilizada para transformar células competentes DH5α mediante choque térmico. Posteriormente el ADN se purificó utilizando un kit comercial Maxiprep Qiafilter™ (Qiagen, nº. cat. 12262, California, USA), de acuerdo a las especificaciones del proveedor. El purificado fue cuantificado en un nanofotómetro™ (INPLEN, nº. cat. LKB529, Múnich, Alemania).

Para analizar la construcción se realizó un mapeo de restricción del plásmido INIFAP–VON 3301, se cortó con las enzimas de restricción Nco I (Invitrogen, nº. cat. 15421–019, California, USA) y Kpn I (Invitrogen, nº. cat. 15232–010, California, USA) para liberar el gen E del VON de 1,503 bp. La reacción se incubó durante 1 h a 37 °C y los productos de la reacción fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.

Transformación genética de maíz por biobalística

Se transformaron 100 callos embriogénicos de maíz tipo II línea costeño con el plásmido INIFAP–VON 3301 mediante biobalística. Como testigo positivo se transformaron 20 callos con el plásmido pCambia 3301 y 20 callos con balas de tungsteno M5 (0.4 µm) como testigo negativo. Los callos embriogénicos bombardeados fueron transferidos en medio N₆P⁽¹²⁾, con 3 mg L^–1 de glufosinato de amonio, para permitir la proliferación de las células transformadas, basados en la expresión del gen bar. El control negativo se mantuvo en las mismas condiciones.

Prueba histoquímica de expresión transitoria para el gen uidA (β–glucoronidasa)

A las 48 h posteriores al bombardeo se realizó una prueba histoquímica de expresión para el gen reportero uidA en los callos embriogénicos de maíz, utilizando el protocolo reportado por Jefferson⁽¹³⁾. Los explantes fueron incubados con el sustrato X–Glu® (PhytoTechnology, nº. cat. X877, Irapuato, GTO México) a 37 °C durante 48 h.

Para identificar la secuencia codificadora del gen E del virus del Oeste del Nilo en los callos de maíz transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301, se realizó una extracción de ARN. Como testigo negativo se usaron callos transformados con el vector pCambia 3301. El ARN fue tratado previamente con 1 ml de DNasa I (Invitrogen, nº. cat, 1868–015, California, USA) de acuerdo a las específicaciones del proveedor. A las muestras obtenidas se les realizó una RT–PCR con un kit de Qiagen One–Step™ (Qiagen, nº. cat. 210212, California, USA). La secuencia de los oligonucleotidos utilizada para la RT–PCR fue la siguiente: WNVe+ Sentido 5'gac aag gag tgg tgg aca 3'; WNVe–antisentido 5' att cca aca cca cag tgc 3´. El programa para la RT–PCR se describe a continuación: síntesis de ADN complementario 45 °C 60 min, PCR desnaturalización inicial 94 °C 2 min, desnaturalización 94 °C 30 seg, alineación 50 °C 2 min, extensión 72 °C 1 min (40 ciclos), extensión final 72 °C 10 min. Como control positivo se utilizó una vacuna de virus inactivado para el VON (Fort Dodge® License nº 112, Iowa, USA). Los productos de la RT–PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 0.8% teñido con bromuro de etidio.

Identificación de la proteína E mediante Western Blot

Previo a la identificación de la proteína E del VON, se estandarizó la técnica de Western blot para titular el anticuerpo primario monoclonal anti–West Nile Virus 8150 (Chemicon, nº. cat. 92590, California USA), utilizando diluciones del anticuerpo 1:1,000, 1:2,500, 1:5,000 y 1:10,000, y como anticuerpo secundario IgG anti–ratón conjugado con peroxidasa (Amersham Bioscience, nº cat. NIF825, New Jersey, USA) a una dilución 1:3,000. Los extractos crudos de la proteína soluble total (PST) de los callos embriogénicos transformados fueron obtenidos utilizando la metodología ya descrita⁽¹⁴⁾. Cuarenta (40) microgramos de proteína soluble total, determinados por Bradford⁽¹⁵⁾, fueron resueltas por electroforesis en un SDS–PAGE al 10% desnaturalizante, realizando por duplicado el ensayo. Al término del corrimiento, uno de los geles fue teñido con Coomasie R–250™ al 0.25%. El gel adicional fue electro–transferido a una membrana de PDVF (Millipore, nº cat. IPVH00010, Massachusetts USA) durante 1 h 30 min. Posteriormente la membrana fue teñida con una solución de rojo de Ponceau al 0.5% (Sigma, nº cat. 7687; Durango, México) para garantizar la transferencia de las proteínas. La membrana fue bloqueada en una solución fosfatos salina (PBS) con 5% de leche descremada, 0.1% Tween–20 durante 1 h a 4 °C. Posteriormente se incubó el anticuerpo primario anti–West Nile Virus 8150 (dilución 1:1,000), durante toda la noche a 4 °C. Después de tres lavados con PBS–Tween20 (0.1%) durante 5 min cada uno, la membrana fue incubada con el anticuerpo secundario IgG anti–ratón conjugado con peroxidasa (dilución 1:3,000), durante 1 h a 4 °C. La reacción de peroxidasa se desarrolló por luminiscencia con el Kit de Millipore HRP Immobilon Western™ (Millipore, nº. cat. WBKLS0500, Massachusetts USA).

Cuantificación de la proteína recombinante

Se llevó a cabo mediante densitometría, midiendo el área de la proteína de interés expresada en los callos embriogénicos de maíz transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301. Como control se utilizó una curva de concentraciones previamente conocidas de albúmina sérica bovina. Para determinar la cantidad de proteína expresada en 40 mg de PST se realizó un análisis de regresión, posteriormente se calculó el porcentaje de expresión de la proteína a partir de la PST obtenida de 200 mg de tejido.

RESULTADOS

Análisis de restricción de la construcción INIFAPVON 3301

El plásmido INIFAP–VON 3301 se cuantificó en un nanofotómetro obteniendo una concentración de 5.327 mg/ml y una relación A260/A280 de 1.934, verificando la integridad del ADN. Previo a la transformación por biobalístca, se realizó un analisis de restricción para liberar la secuencia codificadora del gen E del VON, con las enzimas Kpn I (Invitrogen) y Nco I (Invitrogen). En la Figura 1, se muestra en la parte superior del gel de agarosa un producto de tamaño molecular superior a las 11,000 pb que corresponde al plásmido pCambia 3301. Por otra parte se visualiza un producto de aproximadamente 1,503 pb que corresponde a la secuencia codificadora del gen E del virus del Oeste del Nilo aislada en México. En la parte inferior se observa una banda de aproximadamente 400 bp que corresponde a un sitio de corte interno del gen E para la enzima Kpn I. Este resultado confirma la inserción de la secuencia codificadora del gen E del virus del Oeste del Nilo, en el plásmido INIFAPVON 3301. Posteriormente la concentración tuvo que ser adecuada a 1 mg/ml para la transformación de los callos embriogénicos de maíz.

Prueba histoquímica de expresión transitoria para el gen uidA (β–glucoronidasa)

Los resultados de la prueba histoquímica de expresión transitoria para el gen reportero uidA en los callos embriogénicos de maíz transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301 y pCambia 3301, exhibieron zonas de coloración azul índigo a consecuencia de la hidrólisis del sustrato X–Gluc® con la proteína a–glucoronidasa. En la Figura 2 se muestran los resultados de la prueba en los callos embriogénicos de maíz transformados (B y C) y no transformados (A). Las tonalidades azul índigo muestran la expresión de la proteína b–glucoronidasa recombinante en callos de maíz transformados con los plásmidos INIFAP–VON 3301 (Figura 2B) y pCambia 3301 (testigo positivo) a las 48 h postbombardeo (Figura 2C).

Identificación del gen E del virus del Oeste del Nilo mediante RT–PCR.

Posteriormente, se determinó la expresión del gen E del virus del Oeste del Nilo en los callos embriogénicos de maíz transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301, utilizando como control negativo callos embriogénicos transformados con el plásmido pCambia 3301, los cuales fueron mantenidos en medio N₆P, con el agente de selección glufosinato de amonio durante 3–4 meses post–bombardeo. A partir del ARN del tejido vegetal se realizó una RT–PCR utilizando los iniciadores específicos descritos en la metodología. En la Figura 3 se muestra la expresión del gen E del VON en los callos transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301 que amplificaron un producto de 700 pb (carriles 3–7), en comparación al testigo pCambia 3301 (carril 2) (Figura 3).

Para identificar la proteína E del virus del Oeste del Nilo en los callos embriogénicos de maíz, previamente se estandarizó la técnica de Western blot, utilizando como antígeno la proteína E contenida en una vacuna comercial de virus inactivado (Fort Dodge®). En la Figura 4, se muestran los resultados de la titulación del anticuerpo. A partir de la dilución 1:5,000 a la dilución 1:1,000 se logró identificar la proteína E (Fort–Dodge®), con un peso molecular aproximado a los 64 kDa, por lo que se decidió utilizar la concentración 1:1,000, para ensayos posteriores debido a que se obtenía mayor señal y se requería menor periodo de exposición de la placa fotográfica.

Identificación de la proteína E expresada en callos de maíz, mediante Western blot

Los callos embriogénicos que expresaron el gen E del VON en la prueba de RT–PCR, fueron analizados mediante Western blot, para identificar la expresión de la proteína E recombinante de maíz. Para ello se utilizaron muestras representativas de cada uno de los lotes de callos transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301. Como testigo negativo se utilizaron callos embriogénicos transformados con el vector pCambia 3301. En la Figura 5 se muestra el patrón proteínico de los callos embriogénicos de maíz en la membrana de PDVF teñida con rojo de Ponceau. Las muestras transformadas con el plásmido INIFAP–VON 3301 expresaron una proteína de peso aproximado a los 68 kDa que no se observa para el testigo negativo (Figura 6). Este resultado confirma la obtención de callos embriogénicos de maíz transformados por biobalística que expresan la proteína E del VON después de tres a cuatro meses de su transformación genética.

La cuantificación por densitometría se realizó midiendo el área de la proteína E recombinante de maíz en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante (Figura 7). Como testigos para la prueba se utilizó una curva de albúmina sérica bovina con concentraciones previamente conocidas (Figura 8). Posteriormente se llevó a cabo un análisis de regresión, para conocer la cantidad de proteína E recombinante en los 40 µg de la PST cargados en el gel. Por último se calculó el porcentaje de expresión del total de la PST obtenida a partir de los 200 mg de tejido. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de la proteína E recombinante en callos embriogénicos de maíz tipo II fue del 0.86 % de la PST.

DISCUSION

En este estudio se reporta por primera vez la transformación genética de callos embriogénicos de maíz tipo II (Zea mays L), empleando el gen que codifica para la proteína E del virus del Oeste del Nilo. Los callos embriogénicos transformados con la construcción INIFAP–VON 3301 expresaron eficientemente una proteína de peso aproximado a los 68 kDa, la cual fue detectada por el anticuerpo monoclonal anti–West Nile virus 8150. La proteína E expresada en los callos embriogénicos presentó un ligero incremento en su peso molecular en comparación con la proteína E de la vacuna de virus inactivado (Fort Dodge®), debido seguramente a que al ser expresada en los callos embriogénicos de maíz algunos de los azúcares que se unen para llevar a cabo la glicosilación, son diferentes a los que están presentes en las células animales. Estos carbohidratos pueden alterar la movilidad de las proteínas en los geles⁽¹⁶⁾. La discrepancia en el peso molecular se ha observado cuando diferentes genes que codifican para proteínas de cubierta que son glicosiladas se han expresado en plantas. Sin embargo, también se ha notado que este cambio en la talla de la proteína expresada no repercute en su poder inmunogénico, cuando se les ha evaluado in vivo ^(17,18,19).

La traducción de la proteína E recombinante expresada en los callos de maíz tipo II, conserva las características bioquímicas de la proteína E viral, por lo que es reconocida por el anticuerpo monoclonal anti–West Nile virus 8150. Dicho anticuerpo ha sido utilizado en la detección de anticuerpos en pollos mediante la técnica Mac–ELISA, así como en estudios antigénicos y en pruebas inmuno histoquímicas, mostrando una alta sensibilidad y especificidad para el virus del Oeste del Nilo y el virus Kunjin^(20–23).

La transformación genética de los callos embriogénicos de maíz tipo II mediante biobalística, demostró ser un método eficiente para la expresión de la secuencia codificadora del gen E. Mediante la prueba de RT–PCR se identificó la expresión de un fragmento de 700 pb en los callos de maíz transformados con el plásmido INIFAP–VON 3301, confirmando la expresión del gene a partir del genoma vegetal.

Los resultados de la prueba histoquímica para el gen uidA en los callos embriogénicos de maíz tipo II transformados con los plásmidos INIFAP–VON 3301 y pCambia 3301 exhibieron zonas de coloración azul índigo a consecuencia de la hidrólisis del sustrato X–Glu con la proteína b–glucoronidasa (Figura 2B y 2C) a las 48 h pos–bombardeo. La detección de la proteína b–glucoronidasa mediante la prueba histoquímica, confirmó del manera transitoria la transformación genética de los callos embriogénicos de maíz tipo II.

Otro de los aspectos importantes en el establecimiento de un protocolo de transformación genética de plantas es la elección del promotor específico para conseguir altos niveles de expresión del antígeno⁽²⁵⁾. La expresión de la proteína E del virus del Oeste del Nilo fue dirigida por el promotor CaMV35S del virus del mosaico de la coliflor, el cual demostró ser eficaz para llevar a cabo la transcripción y traducción de la proteína recombinante en los callos embriogénicos de maíz tipo II⁽²⁶⁾. El promotor CAMV35S ha sido comúnmente utilizado para la expresión de antígenos de interés humano y veterinario^(25,27).

La selección con glufosinato de amonio 3.0 mg L^–1 (Basta^®), fue uno de los factores relevantes para la proliferación y obtención de callos transgénicos de maíz que expresaron la glicoproteína E del VON en un periodo de selección de tres a cuatro meses. Los callos transformados con los plásmidos INIFAPVON 3301 y pCambia 3301 que contenían al gen bar fueron resistentes al agente de selección glufosinato de amonio, debido a que este gen codifica para la enzima glutamina sintetasa (GS), que juega un papel central en la asimilación de amonio, en la regulación del metabolismo de nitrógeno en la planta, al igual que previene la autotoxicidad en el organismo⁽²⁸⁾.

Según la literatura, las plantas transgénicas son potencialmente uno de los sistemas más económicos para la producción a gran–escala de proteínas recombinantes para uso industrial y farmacéutico. Algunas de las ventajas que se mencionan son menores costos, fácil escalamiento y que carecen de riesgos de contaminación con patógenos humanos, entre otros⁽²⁹⁾; sin embargo, la realidad es que después de casi 20 años en que se desarrolló esta tecnología, sólo dos biológicos cumplen con las normas requeridas, uno de ellos no está a la venta, y el otro es un anticuerpo que debe purificarse antes de ser utilizado como vacuna; y ambos deben producirse en costosas instalaciones⁽³⁰⁾, además de otras desventajas mencionadas en la literatura⁽²⁷⁾.

Otra de las principales controversias es el posible impacto ecológico para las especies nativas, una alternativa es el crecimiento de las plantas en condiciones controladas mediante el uso de invernaderos, como lo ha efectuado nuestro equipo, sin embargo esto resulta costoso. Otra de las posibles soluciones es el uso de líneas celulares o cultivos indiferenciados, lo que pudiera resolver algunos de los inconvenientes actuales para la producción de organismos genéticamente modificados.

La tecnología aquí presentada resultó eficiente para la producción de esta proteína, lo que pudiera convertirlo en una alternativa para el desarrollo de una vacuna comestible, dado que la bioencapsulación natural de las proteínas en callos embriogénicos, podría incrementar su vida media en el intestino y promover la presentación del antígeno en la superficie de la mucosa. Si bien la infección del VON se da por vía sistémica y las vacunas orales principalmente induce la producción de anticuerpos a nivel mucosa, se ha observado que para otras enfermedades, este tipo de inmunógenos puede producir anticuerpos neutralizantes e inducir una respuesta inmune capaz de conferir protección ante el desafió contra cepas letales^(14,18).

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo financiero al proyecto CONACYT–SAGARPA 2004–24, titulado "Desarrollo de una vacuna comestible en sorgo para la prevención del virus del Oeste del Nilo", y la beca para realizar estudios de Maestría del primer autor Nº de registro 207410.; así mismo la asistencia técnica del Biól. Luis Jorge Saucedo y de la Dra. Edith Rojas Anaya.

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