Aislamiento de actinomicetos asociados a rizosfera de árboles de manzano antagónicos a Fusarium equiseti*
Isolation of actinomycetes associated to apple trees rhizosphere antagonistic to Fusarium equiseti
Daniel Alonso Pérez-Corral1, Nancy Yasmín García-González2, Gabriel Gallegos-Morales2, María Fernanda Ruiz-Cisneros1, David I. Berlanga-Reyes1 y Claudio Ríos-Velasco1§
1 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Unidad Cuauhtémoc, Av. Río Conchos S/N Parque Industrial, C. P. 31570, Cuauhtémoc, Chihuahua. (alonso.perez@estudiantes.ciad.mx; fernanda.ruiz@estudiantes.ciad.mx; dberlanga@ciad.mx).
]]> 2 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Departamento de Parasitología Agrícola, Calzada Antonio Narro 1923 Buenavista, C. P. 25315, Saltillo, Coahuila, México. (yas2903@gmail.com; gabgalmor@yahoo.com.mx). §Autor para correspondencia: claudio.rios@ciad.mx.
* Recibido: enero de 2015
Aceptado: abril de 2015
Resumen
Los árboles de manzano Malus domestica, Borkh. son susceptibles al ataque de una gran diversidad de fitopatógenos, entre los que se encuentran los hongos causantes de enfermedades radiculares, los cuales son controlados con fungicidas sintéticos. Sin embargo, debido a su aplicación indiscriminada, se ha reducido su efectividad y uso. Una alternativa para revertir esta problemática, es el control biológico, mediante la integración de microorganismos antagónicos, por lo que el objetivo del estudio fue aislar actinomicetos nativos de suelos en huertos de manzano del estado de Chihuahua, México, con actividad antagónica a Fusarium equiseti. El estudio fue realizado en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD), Unidad Cuauhtémoc, Chihuahua durante 2013-2014. Para lo cual, se recolectaron muestras de suelo cercano a la rizosfera de árboles de manzano en huertos de cuatro municipios productores del estado de Chihuahua. Para el aislamiento de los actinomicetos, se realizaron diluciones seriadas de las muestras de suelo en agua peptonada estéril y colocándolas por la técnica de difusión en placa, en diez medios de cultivo artificiales semi-selectivos. Las colonias de actinomicetos fueron aisladas y purificadas para posteriormente ser confrontadas in vitro contra el hongo fitopatógeno F. equiseti. Se obtuvieron 710 aislados, dentro de los cuales 222 presentaron actividad antagónica a este hongo fitopatógeno al día 5 post-confrontación y 69 conservaron el antagonismo al día 10 post-confrontación. La alta abundancia de aislados y la proporción que mostró antagonismo a F. equiseti, muestra el potencial y la oportunidad de evaluarlos in vitro e in vivo contra una gran diversidad de hongos y bacterias fitopatógenas del manzano, así como de otros cultivos de interés agrícola.
Palabras clave: Malus domestica, Streptomyces spp., antagonismo, hongos fitopatógenos, rizosfera.
Abstract
]]> Apple trees Malus domestica Borkh are susceptible to attacks from a wide variety of pathogens, among which are the fungi that cause root diseases, which are controlled with synthetic fungicides. However, due to its indiscriminate application, its effectiveness and use has declined.An alternative to reverse this problem is biological control, through the integration of antagonistic microorganisms, so the aim of the study was to isolate native actinomycetes from apple orchards soils in the state of Chihuahua, Mexico, with antagonistic activity to Fusarium equiseti. The study was conducted at the Centro de Investigación enAlimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unit Cuauhtemoc, Chihuahua during 2013-2014. For this purpose, soil samples near the rhizosphere from apple trees in orchards from four producing municipalities in the state of Chihuahua were collected. For isolation of actinomycetes, serial dilutions of the soil samples in sterile peptone water were made and then poured on a plate by the diffusion method, on ten semi-selective mediums, were made. Actinomycetes colonies were isolated and purified, and then be confronted in vitro against phytopathogenic fungus F. equiseti. 710 isolates were obtained, from which 222 had antagonistic activity to the phytopathogenic fungus at day 5 after confrontation and 69 retained antagonisms to day 10 post-confrontation. The high abundance of isolates and the proportion that showed antagonism to F. equiseti, shows the potential and the opportunity to evaluate them in vitro and in vivo against a wide variety of plant pathogenic fungi and bacteria from apple and other crops of agricultural interest.Keywords: Malus domestica, Streptomyces spp., antagonism, phytopathogenic fungi, rhizosphere.
Introducción
La fruticultura, es una de las principales actividades económicas en el estado de Chihuahua, en particular del manzano (Malus domestica Borkh.). La región manzanera está constituida por los municipios de Bachíniva, Cuauhtémoc, Guerrero y Namiquipa; conocida como la zona productora más importante de Latinoamérica (SIAP-SAGARPA, 2013). La producción de este frutal es inestable debido en parte, a la presencia de plagas insectiles y enfermedades, el costo de su manejo depende del grado de tecnificación de los huertos, representando 22.2% de los costos totales de producción en huertos con alta tecnificación y 10.6% con mediana tecnificación, donde el costo del manejo de enfermedades causadas por hongos y bacterias en huertos de alta tecnificación asciende al 57% (Ramírez-Legarreta y Jacobo-Cuéllar, 2002).
Por lo que, las enfermedades son de mayor interés, debido a la gran diversidad de fitopatógenos presentes en la rizosfera, principalmente hongos tales como Fusarium spp. (Tewoldemedhin et al., 2011), Phymatotrichopsis omnivora (Samaniego-Gaxiola, 2007), Armillaria spp., Rhizoctonia spp., Alternaria spp. (Serdani et al., 2002), Rosellinia necatrix (ten Hoopen y Krauss, 2006), Nectria spp., y Oomicetos como Phytophthora cactorum (Hantula et al., 2000), Pythium spp. (Mostowfizadeh-Ghalamfarsa y Banihashemi, 2005), entre otros. Su control depende de la aplicación de fungicidas sintéticos como una herramienta usada comúnmente; sin embargo, su empleo se ha restringido debido a su poca eficiencia por un manejo inadecuado, a la inducción de resistencia en los hongos y Oomicetos blanco y no blanco, eliminación de microorganismos antagónicos nativos y afectación a la salud humana (Harris et al., 2001).
Por lo cual, la integración de microorganismos antagonistas presentes en la rizosfera de sistemas agrícolas, es una alternativa viable al uso de productos químicos para la protección de cultivos (Berg et al., 1996; Whipps, 2001). Los microorganismos antagonistas más utilizados son bacterias del género Bacillus spp. (Kumar et al., 2012), hongos (Trichoderma spp.) (Bell et al., 1982) y actinomicetos (Streptomyces spp.) (Ezziyyani et al., 2004). Estos últimos son un grupo de bacterias filamentosas Gram-positivas, con alto contenido de guanina-citosina en su genoma, se encuentran en diversos ecosistemas naturales y agroecosistemas, son heterótrofos y viven en materia orgánica en descomposición actuando como descomponedores (Goodfellow y Williams, 1983; Mayfield et al., 1972; Juo y Franzluebbers, 2003), además tienen la capacidad de producir una amplia variedad de antibióticos y enzimas extracelulares (Kavitha et al., 2010), los cuales pueden inhibir el crecimiento de algunos patógenos (Valois et al., 1996; El-Tarabily et al., 2000).
Además tienen la capacidad de colonizar la superficie radicular de las plantas, protegiéndola contra fitopatógenos del suelo (Crawford et al., 1993), por lo que han sido reconocidos como antagonistas potenciales de hongos fitopatógenos (El-Abyad et al., 1993). Dado lo anterior, el objetivo del estudio fue aislar actinomicetos nativos en huertos de manzano del estado de Chihuahua, con potencial antagónico a hongos fitopatógenos, permitiendo desarrollar información sobre la abundancia y distribución de actinomicetos antagónicos.
Materiales y métodos
]]> Ubicación del sitio experimental. Se recolectaron muestras de suelo (800 - 900 g) cercano a la rizosfera (10 - 15 cm de profundidad) de cinco árboles de manzano, ubicados en los cuatro puntos cardinales y el centro del área total de los huertos (Bagyaraj y Rangaswami, 2007), durante el periodo junio-julio de 2013 en cinco huertos de los municipios de Bachíniva, Cuauhtémoc, Guerrero y Namiquipa, del estado de Chihuahua, posteriormente se hicieron muestras compuestas de 250 g por huerto, obteniendo un total de 20 (Cuadro 1).Aislamiento de actinomicetos. De las muestras obtenidas se realizaron diluciones seriadas (1:10), en tubos de ensaye con 9 mL de agua peptonada estéril (0.1% de peptona y 0.85% de NaCl en agua destilada), agregando 1 g de suelo (previamente tamizado), hasta obtener las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7, de las cuales se tomaron 50 μL y se sembraron por duplicado mediante la técnica de difusión en cajas de Petri de 90 mm de diámetro, que contenían uno de los siguientes medios de cultivo artificiales semi-selectivos para el aislamiento de actinomicetos: Agar de Bennett (AB), Agar Nutritivo Glicerol (ANG), Ashby's Glucosa Agar (ASH), Czapek Peptona Agar (CPA), Czapek Dox Agar con 3% Glucosa (CZAS), Glicerol Glicina Agar (GGA), Gauze's Medio No. 1 (GAU), GYM Streptomyces Agar (GYM), Oatmeal Agar (OAT) y Agar Jugo de Vegetales V8 (V8) (Atlas, 2010). Posteriormente se incubaron a 28 °C durante 15-22 d, observando periódicamente las colonias típicas de los actinomicetos, las cuales fueron asiladas y purificadas en Papa-Dextrosa-Agar (PDA), e incubadas a 28 °C por 10-12 d en una cámara de crecimiento (Precision Scientific).
Identificación morfológica de aislados. La identificación se realizó de acuerdo a Shirling y Gottlieb (1966), incubando los actinomicetos seleccionados en PDA, ISP2, ISP3 e ISP4 a 28 °C durante 7 d para promover el crecimiento de estructuras de esporulación y ser identificados mediante sus características macroscópicas tales como: color de la colonia, producción de pigmentos y características de micelio, y mediante sus características microscópicas como la presencia de esporas y arreglo de estructuras de esporulación, para lo cual se realizaron tinciones de Gram y fueron examinados en un microscopio compuesto (Carl Zeiss), con un aumento de 1 000 X.
Confrontaciones in vitro. Los actinomicetos aislados se confrontaron in vitro contra el fitopatógeno F. equiseti, del cepario de CIAD, A. C. previamente identificado. Cabe señalar que se eligió a esta especie debido a su rápido crecimiento en el medio Czapek-Dox-Agar (CDA). Cada antagonista se sembró de acuerdo a la metodología descrita por Castillo-Fabela et al. (2001) con modificaciones, mediante obtención de explantes de la colonia con sacabocados de 5 mm de diámetro y colocación en los cuatro puntos cardinales de la caja de Petri conteniendo CDA (Sigma Aldrich, México), incubándose por 10 d a 28 °C. En el último día de incubación se colocó un papel filtro de 6 mm de diámetro impregnado con conidias y micelio del fitopatógeno en el centro de la caja de Petri e incubándose nuevamente a las mismas condiciones.
Como testigo, se sembró el hongo fitopatógeno, colocando un papel filtro impregnado con conidias y micelio en el centro de la caja de Petri con CDA. El crecimiento radial de la colonia de F. equiseti confrontado ante cada actinomiceto y del testigo fue medido diariamente. El mismo día en que el testigo llenó la caja de Petri, se registró y determinó la capacidad antagónica en las confrontadas con los actinomicetos, para lo cual se utilizó una escala subjetiva arbitraria propuesta para tal fin (Figura 1).
Resultados y discusión
Aislamiento de actinomicetos. Mediante el uso de los 10 medios de cultivo, se obtuvieron 710 aislados de actinomicetos. Los medios con los cuales se aisló el mayor número de actinomicetos fueron: V8, GUA y GYM, con 19.4, 18.9 y 14.2% respectivamente, del total obtenido. El medio del cual se aisló la menor cantidad de actinomicetos fue OAT con 0.9% del total (Cuadro 2). El medio OAT (ISP3) es reconocido por parte del ISP (International Streptomyces Project) como uno de los más efectivos para la caracterización de actinomicetos (Shirling y Gottlieb, 1966), sin embargo, no resultó efectivo para el aislamiento en este estudio. Las diferencias encontradas en el número de actinomicetos aislados, con relación a los diferentes medios se debe generalmente al contenido de nutrientes en cada uno de ellos y a los requerimientos por parte de los microorganismos (Buyer, 1995; Tsoraeva y Zhurbenko, 2000; Vieira y Nahas, 2005). Sin embargo, los actinomicetos presentan versatilidad nutricional (Prosser y Palleroni, 1978; Srinivasan et al., 1991) y en la mayoría de los casos al usar medios formulados se encuentran diferencias cuantitativas en los aislados, inclusive de la misma muestra de suelo (Goodfellow y Williams, 1983).
]]> Cabe mencionar, que en todos los municipios evaluados se encontró una gran cantidad de actinomicetos, no dependiendo del nivel de tecnificación de los huertos; sin embargo, es importante señalar que en algunos huertos muestreados, se realizan aplicaciones de materia orgánica, lo cual favorece el establecimiento de estos microrganismos (Kamal et al., 2010), o debido al tipo de suelo presente (Vruggink, 1976; Crawford et al., 1993). El municipio con el mayor número de aislados de actinomicetos fue Namiquipa con 214 (30.1%), seguido de Bachíniva con 201 (28.3%), Guerrero con 158 (22.3%) y Cuauhtémoc con 137 (19.3%). Al respecto Xue et al. (2013) reportan una gran cantidad de actinomicetos aislados de rizósfera de diferentes cultivos agrícolas, considerándola como una gran fuente y reservorio de estos microorganismos.Identificación morfológica de aislados. La mayoría de los aislados presentaron micelio aéreo en colonias adheridas al medio de crecimiento con bordes irregulares, de consistencia suave y compacta, con diferentes pigmentaciones como diferentes tonalidades de café, amarillo y violeta, principalmente. En cuanto a la morfología microscópica observada mediante tinción de Gram corresponde a bacterias filamentosas Gram positivas, presentando cadenas de esporas, en forma recta, flexible, bucles abiertos y espiral (Shirling y Gottlieb, 1966) (Figura 2). La mayoría de los aislados presentaron características morfológicas correspondientes al género Streptomyces. Al respecto Mayfield et al. (1972) mencionan que 90% de los actinomicetos aislados de una gran diversidad de hábitats pertenecen al género Streptomyces.
Confrontaciones in vitro. De los 710 actinomicetos aislados, 222 mostraron actividad antagónica in vitro contra Fusarium equiseti, aislados en su mayoría con los medios GAU y V8. La capacidad antagónica de los aislados se monitoreó hasta los 10 d post-confrontación y se encontró que solo 69 de las 222 conservaron su capacidad antagónica (Cuadro 2), esto se debió posiblemente a que los hongos poseen diversos mecanismos de defensa hacia los microorganismos antagonistas (Duffy et al., 2003), tales como activación metabólica en la producción de sustancias reductoras, enzimas implicadas en la compactación de activos, hidroxilación de compuestos hidrocarburos, detoxificación de volátiles, así como biosíntesis de melaninas, que actúan como esponjas para atrapar radicales libres (Kinderlerer, 1993; Levy et al., 1992; Osbourn et al., 1996; Schoonbeek et al., 2002).
En cuanto a la capacidad antagónica in vitro contra F. equiseti de los diferentes aislados de actinomicetos, 14 inhibieron por completo el crecimiento de F. equiseti al décimo día pos-confrontación (Cuadros 2 y 3), posiblemente por la acción fungistática o fungicida debido a la producción de sustancias biocidas o antibióticos que se difunden a través del medio de cultivo (Fonseca-Ardila et al., 2011). Al respecto, diversos autores manifiestan que los actinomicetos son una alternativa con gran potencial para ser usados como agentes de control biológico de Fusarium spp. (Gopalakrishnan et al., 2011), incluyendo a F. equiseti, y otros hongos fitopatógenos (Crawford et al., 1993; Al-Askar et al., 2011; Dávila Medina et al., 2013; Xue et al., 2013; Evangelista-Martinez, 2014).
Conclusiones
El estudio mostró una gran cantidad de actinomicetos nativos presentes en los diferentes suelos de huertos de manzano en el estado de Chihuahua, así como la capacidad antagónica de más del 31 % de los aislados encontrados al ser confrontados in vitro contra F. equiseti, por lo que, pueden ser usados como agentes de control biológico de Fusarium spp. y de una gran diversidad de hongos fitopatógenos de interés agrícola.
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