Identificación de bacterias cultivables patógenas al humano en semicompostas de residuos agrícolas*

Identification of cultivable bacteria, pathogenic human in semicomposts of agricultural waste

Verónica Herrera-Ortiz¹, Ofelia Adriana Hernández-Rodríguez^1§, Ana Cecilia González-Franco¹, Abelardo Núñez-Barrios¹, Loreto Robles-Hernández¹ y Ramona Pérez-Leal¹

¹ Universidad Autónoma de Chihuahua-Facultad de Ciencias Agrotecnológicas. Escorza No. 900, Col. Centro. C. P. 31000, Chihuahua, Chihuahua, México. A. P. 24. Tel: 614 439 18 44. (aernande@uach.mx; anunez@uach.mx; conzalez@uach.mx; lrobles@uach.mx; ing.ecologia@hotmail.com). §Autora para correspondencia: aernande@uach.mx.

* Recibido: diciembre de 2014
Aceptado: marzo de 2015

Resumen

Los abonos oigánicos, importantes fuentes de materia orgánica para los suelos, contienen cuantiosos microorganismos, algunos potencialmente patógenos al humano. En 2009, en la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua, se evaluó la presencia de coliformes totales y fecales, y Salmonella sp., en cuatro semicompostas de 24 semanas de descomposición, obtenidos a partir de mezclas de aserrín (A) y esquilmos de maíz (E) como fuente de carbono, y bovinaza (B) y gallinaza (G) como fuente de nitrógeno. Además, se identificaron los géneros bacterianos patógenos al humano con el sistema API 20E. Se estableció un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2. La comparación de medias se realizó con la prueba de Tukey (α= 0.05). Los resultados que presentaron interacciones significativas fueron: para coliformes totales, estiércol-tiempo (p< 0.0038) con diferencia en la semana 12, y reducción en la 24. En coliformes fecales, estiércol-residuo vegetal (p≤ 0.0477) donde el aserrín partió de 8.18 y 9.19 log NMPg^-1 para gallinaza y bovinaza respectivamente, con tendencia a la baja en ambos. T3-GE mostró una mayor influencia en la reducción de coliformes fecales. Se identificaron 17 géneros bacterianos patógenos al humano durante el proceso. Los productos de los tratamientos presentaron menor diversidad y frecuencia de patógenos que las mezclas iníciales. En los productos post-tratamientos se identificaron 12 géneros, siendo los más frecuentes Pseudomonas aeruginosa y Grimontia hollisae, en tres y cuatro de los tratamientos respectivamente. Solamente los tratamientos T1-GA y T4-BE presentaron menor incidencia de microorganismos patógenos riesgosos al humano.

Palabras clave: Salmonella sp., abonos orgánicos, coliformes fecales, coliformes totales.

Abstract

Organic fertilizers, important sources of organic matter to the soil, containing substantial microorganisms, some potentially pathogenic to humans. In 2009, at the Faculty of Agrotechnological Sciences of the Autonomous University of Chihuahua, the presence of total and faecal coliforms was evaluated, and Salmonella sp., in four 24-week semicomposts decomposition, obtained from mixtures of sawdust (A) and corn-mixture (E) as a carbon source, and bovinaza (B) and manure (G) as nitrogen source. In addition, human pathogenic bacterial genera with the API 20E system were identified. Stablishing a completely randomized design of factorial 2 x 2. Comparison ofmeans was done with the Tukey test (a=0.05). The results showed significant interactions: total coliform, manure-time (p< 0.0038) with difference at week 12, and 24. reduction in faecal coliform, manure-waste plant (p< 0.0477) where the sawdust left 8.18 and 9.19 log NMPg^-1 for poultry and bovinaza, respectively, with a downward trend in both. T3-GE showed better influence on the reduction of faecal coliforms. 17 human pathogenic bacterial genera identified during the process. The products of the treatments had lower diversity and frequency ofpathogens initial mixtures. In the post-treatment products, 12 genera were identified, the most common Pseudomonas aeruginosa and Grimontia hollisae, in three and four of the treatments, respectively. Only T1-GA and T4-BE had lower incidence of risky human pathogens.

Introducción

Los desechos derivados de las actividades agrícolas y pecuarias, pueden derivar en problemas de contaminación ambiental y afectar a la salud humana cuando no son manejados apropiadamente. El estado de Chihuahua, México se caracteriza por su importante actividad agrícola, ganadera y forestal. Las estadísticas de población pecuaria destacan la importancia de esta actividad para diferentes especies (INEGI, 2007), lo cual genera cantidades significativas de estiércol. En el sector forestal maderable, las pérdidas reportadas por desperdicio de madera en el proceso de aserrío son altas, en el cual el aserrín es uno de los subproductos más importantes (Zaragoza, 2004).

Estos materiales constituyen un importante reservorio de bacterias patógenas al humano como Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 y otras (Larney et al., 2003). Schamberger and Diez-González (2004) encontraron cepas de Escherichia coli en 20% de las heces de ganado vacuno examinadas. Larney et al. (2003) encontró que E. coli O157:H7 sobrevivió por más de un año en una pila de estiércol ovino expuesta a condiciones ambientales.

Por otro lado, el compostaje es un bioproceso aeróbico que posibilita la utilización de residuos orgánicos para la elaboración de abonos agrícolas en donde el material obtenido se considera enriquecido tanto química como biológicamente. En este proceso, la temperatura es uno de los factores más importantes que gobiernan la velocidad de las reacciones bioquímicas (Defiriere et al., 2005) y una adecuada maduración de la composta. Larney et al. (2003) reportaron que los patógenos, parásitos y malezas no logran sobrevivir después del proceso de compostaje debido a la fase termofílica esperada en el proceso, con temperaturas de 60-70 °C, Sin embargo, la elevación de la temperatura se asocia a grandes volumen en las pilas de compostaje, las cuales permiten el incremento de las poblaciones de organismos termofílicos (Dalzell, 1991).

La descomposición de residuos orgánicos en volúmenes menores a 1 m³ mediante el semicompostaje, es una práctica común entre pequeños productores orgánicos, en cuyos procesos no se presentan las temperaturas esperadas para la fase termofílica. Sin embargo, se ha encontrado que representa una tecnología viable para el reciclaje de residuos agrícolas y pecuarios, ya que al final del proceso, las semicompostas presentan características físicoquímicas típicas de los productos del compostaje (Castillo et al., 2010; Hernández-Rodríguez et al., 2013).

El objetivo de este trabajo fue determinar la sobrevivencia de coliformes totales y fecales y Salmonella sp., así como identificar los géneros bacterianos patógenos al humano presentes en mezclas de residuos vegetales y pecuarios sometidos a un proceso de semicompostaje, con el fin de impulsar esta práctica para la elaboración de abonos orgánicos.

Materiales y métodos

Para la elaboración de las mezclas sometidas a semicompostaje se utilizaron como fuente de nitrógeno (N-total), dos tipos de estiércoles: de ganado bovino lechero Holstein (B) estabulado de 2 a 5 años de edad, alimentado con maíz rolado, salvado de trigo, harinolina, pasta de soya, alfalfa y silo de maíz, y estiércol de gallina (G), alimentadas con maíz, arroz y purina de crecimiento. Los estiércoles se obtuvieron directamente de las deyecciones depositadas por los animales en las unidades productivas de la UACH. Como fuente de carbono (C-orgánico) se utilizó esquilmo de maíz (E), cuyos residuos de cosecha se obtuvieron de la localidad productiva de Cuauhtémoc, Chihuahua, y aserrín de pino y encino (A) proporcionado por una comercializadora maderera local.

Apartir de los residuos orgánicos seleccionados se prepararon cuatro mezclas que constituyeron los tratamientos bajo estudio: T1-GA: gallinaza + aserrín; T2-BA: estiércol bovino + aserrín; T3-GE: gallinaza + esquilmo de maíz; T4-BE: estiércol bovino + esquilmo de maíz. Para ello, se analizaron los residuos orgánicos determinando el contenido de humedad, N-total y C-orgánico (Cuadro 1).

El análisis permitió calcular la cantidad necesaria de cada material para mantener la relación C/N inicial igual a 25/1, recomendada para la elaboración de las mezclas sometidas a compostaje (Castillo et al., 2010). Para ello se utilizó el programa "Moisture and C/N Ratio Calculation", desarrollado por Richard (1995). Las mezclas iniciales se depositaron en contenedores de plástico grueso de 115 L de capacidad con dimensiones 40*70*40 cm (Nogales et al., 2005); se destinaron cinco contenedores con cada mezcla los cuales se protegieron del ambiente y de la pérdida de humedad con un túnel de plástico, construido a partir de varillas metálicas y plástico semitransparente, con una altura de 60 cm. Las mezclas se removieron cada semana para reducir la formación de zonas anaerobias.

Se utilizó un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2 con medidas repetidas a través del tiempo (TS). El factor A consistió en dos tipos de estiércol (ES) como fuente de N: a₁=gallinaza; a₂= estiércol bovino; mientras que el factor B, estuvo representado por dos clases de residuos vegetales (RV) ricos en C: b₁= aserrín; b₂= esquilmos de maíz. Los cuatro tratamientos con cinco repeticiones generaron un total de 20 unidades experimentales.

La temperatura ambiental del túnel se registró cada 48 h a las 10:00 ± 1 h, usando un termómetro de máximas y mínimas (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) simultáneamente se registró la temperatura en las mezclas de semicompostaje, con un termómetro de pistilo con rango de mínima -20° y máxima 100 °C a 20 cm de profundidad en la parte central de cada contenedor; el análisis del pH de las mezclas, se realizó en las semanas 0, 6, 12, 18 y 24 mediante el uso de un potenciómetro (Fisher Scientific Accumet AB15, US) en una dilución en agua 1:5 (p/v), para lo cual se tomaron muestras de 100 g, se secaron en estufa a 60 °C y se tamizaron con malla núm. 20.

Para el análisis microbiológico se cuantificaron Salmonella sp., y coliformes en las semanas 1, 12 y 24. El muestreo se realizó recogiendo 2 muestras de 50 g de cada sustrato, colocándose en bolsas de plástico con cierre hermético; estas se mantuvieron a 4 °C por una hora antes de ser analizadas siguiendo la metodología propuesta por la norma NOM-004-SEMARNAT-2002. El NMPgr^-1 de coliformes fecales se obtuvo a partir del código compuesto por los tubos múltiples con resultado positivo en el medio EC. Las UFCgr^-1 de Salmonella sp., se identificaron utilizando agar verde brillante, mediante la presencia de colonias rojas o rosas rodeadas del medio rojo. Adicionalmente en las semanas 1 y 24 se seleccionaron de cada tratamiento, 10 colonias presuntivas para su identificación utilizando el API 20E (Biomérieux®), el cual es un método eficaz para la identificación de enterobacterias y otros bacilos gram negativos mediante 21 diversas reacciones bioquímicas (Nucera et al., 2006).

El análisis de varianza se realizó con el procedimiento general lineal model (GLM) y mediante el paquete estadístico Statistical Analisis System (SAS), versión 9.1. Para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey al α= 0.05. Para el análisis estadístico de las variables microbiológicas se realizó una transformación de la concentración de patógenos a logaritmo₁₀. Los valores reflejan la media de tres repeticiones.

Resultados y discusión

En la semana 1, la temperatura de los cuatro tratamientos se situó entre 35 - 40 °C indicando con ello el inicio de la fase mesofílica (20 - 40 °C). En esta etapa los tratamientos T2-BA y T3-GE mostraron una temperatura superior a los tratamientos T1-GA y T4-BE. Durante las siguientes cuatro semanas, la temperatura de los sustratos bajó a 30 °C, por lo que en este estudio no se presentó la fase termofílica esperada en el proceso. De acuerdo con estudios previos (Dalzell, 1991) la elevación de la temperatura, se asocia a la superficie/volumen de las pilas de compostaje; en donde la cantidad de biomasa degradada se relaciona con la emisión y conservación de una mayor cantidad de calor, lo que genera temperaturas mayores, las cuales permiten el incremento de las poblaciones de organismos termofílicos; en este estudio, la cantidad de sustrato utilizado en los sistemas, inferiores a 1 m³, pueden explicar porque los sustratos no alcanzaron las temperaturas esperadas para la fase termofílica, por lo que los materiales deben considerarse semicompostados (Castillo et al., 2010; Hernández-Rodríguez et al., 2013). Sin embargo, resultados observados señalan que las condiciones óptimas de temperatura para eliminar patógenos parásitos y malezas, se encuentran desde el rango de 35 a 55 °C (Pierre et al., 2009).

pH. Los valores promedio de pH de los tratamientos estudiados mostró el comportamiento a través del tiempo que se muestra en la Figura 2. Se encontró significancia en los componentes de varianza ES y RV (p< 0.0001), TS (p≤ 0.0293), y en las interacciones ES*RV (p< 0.0001), TS*ES (p< 0.0001) y TS*RV (p< 0.0001). La variable pH mostró una tendencia alcalina durante el proceso. El aumento en pH observado en este estudio pudo atribuirse a la perdida de los ácidos orgánicos que se volatilizan por altas temperaturas, acción de los microorganismos, así como por la liberación de amoniaco (Uribe et al., 2001).

Esto coincidió con lo reportado por Isaza et al. (2009), donde los tratamientos con mismos desechos pero diferentes manejos tendieron a la alcalinidad. Gordillo et al. (2011) observaron valores de pH alcalinos, aun con pilas de mayores volúmenes (8*2.5*1.5 m), por lo que un volumen considerablemente menor supone un comportamiento similar en esta variable.

Microorganismos patógenos al humano. La presencia de coliformes totales y fecales en las mezclas estudiadas mostró el comportamiento que se presenta en las Figuras 3 a) y b) respectivamente. Los efectos estadísticos significativos observados para coliformes totales fueron: TS (p< 0.0001), ES (p< 0.0061), y la interacción de estos (ES*TS p< 0.0038) en la semana 12, donde B correspondió a 9.23 y G a 3.99 log NMPg^-1. Pero en la semana 24, ambas medias tuvieron el mismo comportamiento, sugiriendo que el efecto de los estiércoles, aun de diferentes orígenes, influye de igual manera sobre la presencia de coliformes totales al final de un semicompostaje.

Para coliformes fecales las interacciones significativas fueron RV*ES (p< 0.0477) y el efecto de TS (p< 0.005). La concentración de coliformes fecales para el efecto de residuo A en la semana 1, fue de 8.18 y 9.19 log NMPg^-1 en G y B respectivamente. Estas con una tendencia a la baja muy notoria, llegando en la semana 24, con 2.11 y 0.86 log NMPg^-1 en G y B respectivamente.

El comportamiento de las concentraciones de coliformes fecales por el efecto TS, fue con una marcada tendencia a la baja (Figura 3c). Inició con una media de 6.98 log NMPg^-1 hasta alcanzar 2.22 log NMPg^-1. Sin embargo, la reducción de coliformes fecales, no puede atribuirse solo al tiempo del efecto de semana, pues existen otras causas que pueden influenciar su reducción. Fuccz et al. (2007) reportaron que un pH alto como los encontrados en este estudio, pueden reducir la tolerancia de los coliformes a la radiación solar o incluso aumenta la generación de formas tóxicas de oxígeno. De esta forma, una modificación de las membranas por un mayor pH puede producir un flujo de iones hidroxilos los que a su vez incrementan el pH interior de los coliformes fecales, provocando una alteración de viabilidad y funcionamiento.

Salmonella sp. La presencia de Salmonella en un compost es muy cambiante, existiendo diversas limitaciones para seleccionar el procedimiento adecuado para aislarla y detectar a más de 1,700 serotipos reconocidos (Bustamante et al., 2008). Por esto, un resultado negativo con alguno de los métodos usados no implica su ausencia. Los efectos significativos fueron RV (p< 0.0411), así como las interacciones RV*TS (p< 0.0004), ES*RV (p< 0.0023) y ES*RV*TS (p< 0.0165).

La interacción de A*ES*TS (Figura 4a) inició con los valores de 5.77 y 7.79 log NMPg^-1 en G y B respectivamente, diferentes estadísticamente, indicando que la concentración de Salmonella sp. Se vio afectado por influencia de A, pero para las semanas 12 y 24 ya no existió diferencia. Aunque la concentración de Salmonella sp., aumentó en la semana 24 respecto a la semana 12, esto puede ser atribuible a una recolonización o recontaminación del medio. En el comportamiento para E*ES*TS (Figura 4b) solo hubo diferencia estadística en la semana 1. Salmonella sp., puede ser susceptible al ambiente microbiológico que impere en el compost (Avery et al., 2012).

Identificación de patógenos. De 80 aislados sospechosos determinados por sus características microscópicas y pruebas bioquímicas básicas, 13 fueron identificados por la galería API 20E como Salmonella sp. De las cepas restantes, se encontraron 16 diferentes géneros bacterianos. Solamente uno de los patógenos aislados se clasificó como perteneciente al grupo de las bacterias no fermentadoras, siendo únicamente positivos a la prueba de la citrocromo-oxidasa (CIT) (Cuadro 2).

Se observaron cuatro géneros prevalentes que agruparon el 52.2% de los aislados. El género que se observó con mayor frecuencia, abarcando 17.5%, fue Grimontia hollisae, siguiéndole con 15.0% Citrobacter braakii; en tercer y cuarto lugar con 10% se identificaron Salmonella choleraesuis y Pseudomonas aeruginosa.

Grimontia hollisae, es miembro de las Vibrionaceae, familia que posee una distribución principalmente en agua, capaz de causar enfermedades gastrointestinales en personas sanas pero solo cuando han consumido mariscos (Murray et al., 2007; Hinestrosa et al., 2007). Citrobacte rbraakii y S almonella choleraesuis spp. arizonae, son miembros de la familia Enterobacteriaceae. Esta familia es de amplia distribución en suelo, agua, plantas y flora intestinal de mamíferos, incluyendo al humano (Murray et al., 2007). Las infecciones al humano por el género Citrobacter son poco comunes y de índole oportunista (Ryan et al., 2010).

Los géneros de Salmonella detectados según la metodología empleada, no fueron del género peligroso. Salmonella entérica sub especie arizonae (Cuadro 2). Es un patógeno muy raro en humanos, pero puede llegar a infectar a niños muy pequeños y personas con un sistema inmunocomprometido (Kumar et al., 2003).

Pseudomonas aeruginosa tuvo una amplia presencia durante este estudio. A pesar de ser el microorganismo que causa más enfermedades a humanos de las Pseudomonadaceaes, no llega a ser motivo de alarma (Murray et al., 2007). Aunque el compost puede ser una fuente de P. aeruginosa, como reporta Kaszaba et al. (2011), solo sería un riesgo en individuos susceptibles por ser un microorganismo oportunista. Vásquez et al. (2010) reportó que este microorganismo nativo de la pulpa de café se utilizó entre otros, para la aceleración del compostaje de la misma pulpa, pues está involucrado en el proceso de degradación.

Mircoorganismos patógenos al humano en los productos postratamiento. En la semana 24 no se detectaron: A. hydrophila, E. sakazakii, P. shigelloides, P. penneri y C. meningosepticum presentes al inicio del proceso. La explicación pudiera ser múltiple. Posiblemente como refiere Fuccz et al. (2007) la propia microflora pudo competir por nutrientes con microorganismos entéricos, siendo así un factor de reducción, así como los altos valores de pH presentados en este estudio. Sin embargo, se detectaron otros microorganismos: E. hermannii, Salmonella spp., S. sonnei y P. damselae que son bacilos anaerobios facultativos (Schelegel y Zaborosch, 1997), Pasteurella que es anaerobio o aerobio facultativo (Madigan et al., 2003), P. rettgeri y C. indologenes.

Los productos post-tratamiento con menor presencia de microorganismos patógenos riesgosos al humano fueron los tratamientos T1-GA y T4-BE (Cuadro 2), debido a que los microorganismos detectados fueron raramente oportunistas (C. braakii, S. choleraesuis spp. arizonae, Escherichia hermannii y G. hollisea) (Kumar et al., 2003; Hinestrosa et al., 2007; Ryan et al., 2010), por lo que su potencial patógeno sobre los individuos que tengan contacto o manipulen este material, es relativamente bajo con las medidas de higiene básicas. Sin embargo, los tratamientos T2-BA y T3-GE fueron menos eficientes en la eliminación de patógenos ya que se detectó la presencia de Shigella sonnei, caracterizado por un alto potencial patógeno y causa importante de shigelosis (Sangal et al., 2012), aun cuando en los análisis de los tratamientos en la semana 1 no fueron detectados con la metodología empleada.

Conclusiones

La temperatura máxima registrada en los reactores fue de 40 °C, por lo que ningún reactor alcanzó temperaturas termófilas comunes en la práctica del compostaje. Por esta razón, los sustratos producidos en este trabajo deben ser considerados como semicompostados. El pH del proceso tendió invariablemente a la alcalinidad. El valor más alto correspondió a la mezcla de estiércol vacuno y esquilmo de maíz.

Los residuos orgánicos empleados influyeron en el comportamiento del proceso de transformación a un producto inocuo. El esquilmo de maíz con la gallinaza mostró una mayor influencia en la reducción de coliformes fecales.

Los microorganismos patógenos de mayor incidencia encontrados tanto en sustratos iniciales como en los productos post-tratamiento fueron: Grimontia hollisea, Citrobacter braakii, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella choleraesuis sp. arizonae.

En general, los productos del semicompostaje presentaron menor diversidad y abundancia de poblaciones microbiológicas patógenas al humano que las mezclas iniciales, lo cual pone de manifiesto la importancia del proceso para obtener mejores resultados y optimizar el uso de residuos orgánicos. Sin embargo, se destaca la importancia del aumento de la temperatura propia de la fase termófila del compostaje para un mayor control de patógenos. Se sugiere dar seguimiento a este tipo de trabajos de investigación, ya que las variables estudiadas pueden variar dependiendo de la estación del año, del tipo de residuos orgánicos, de las mezclas empleadas y del tiempo que se sometan a compostaje, así como incluir estudios sobre la acción de diversas metabolitos característicos de cada residuo orgánico en el control de patógenos.

Agradecimientos

A Fondos Mixtos CONACYT-Gobierno del estado de Chihuahua por el apoyo para la realización de este estudio. Al Ing. Héctor Maltos Romo, por su importante colaboración.

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