Agrupamiento de genotipos de la colección nacional de trigo en base a genes de interés agronómico*

Clustering of genotypes of the national collection of wheat based on genes of agronomic interest

María del Pilar Suaste Franco¹, Víctor M. Zamora Villa¹, M. Humberto Reyes Valdes¹, Héctor E. Villaseñor Mir^2§, Amalio Santacruz Varela³ y Ernesto Solís Moya⁴

¹ Departamento de Fitomejoramiento- Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). Calzada Antonio Narro No. 1923, Colonia Buenavista, Saltillo, Coahuila, México. C. P. 25325 (suastef.mp@hotmail.com; zamora2602@yahoo.com.mx; mathgenome@gmail.com).

³ Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo. Carretera México-Texcoco, km 36.5. Montecillos, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230. (asvarela@colpos.mx).

⁴ Campo Experimenta Bajío - INIFAP. Carretera Celaya-San Miguel de Allende km 6.5, Roque, Celaya, Guanajuato, México. C. P. 38110. (esolismoya@hotmail.com).

* Recibido: septiembre de 2014
Aceptado: febrero de 2015

Resumen

En la búsqueda de diversidad para incluir en los programas de mejoramiento es de gran importancia el estudio de la colección nacional de trigo como fuente donadora de genes y con base en el comportamiento genotípico y fenotípico de sus accesiones detectar las asociaciones de importancia entre ambos caracteres, así como agrupar individuos con fondos genético similares para características de interés agronómico como tolerancia a royas, gluteninas, altura, vernalización. Para evaluar los caracteres fenotípicos, el ensayo se estableció en Nanacamilpa, Tlaxcala y Roque, Guanajuato, durante dos ciclos en cada localidad, otoño- invierno 2010-2011 y 2011-2012 en Roque, y primavera- verano 2011 y 2012 en Nanacamilpa. Para las variables genotípicas se usaron 16 marcadores moleculares asociados a diferentes características de interés en trigo, para royas: Lr68, Lr34, Lr46 y Sr2; gluteninas: Glu-A1b, Glu-B1al y Glu-D1; altura de planta: Rht-B1 y Rht-D1; fotoperiodo: Ppd-D1a; vernalización: Vrn-A1, Vrn-B1 y Vrv-D1a; dureza del endospermo: PinA-D1a y PinB-D1a; y contenido de amilosa: GBSS. Las medias de los caracteres fenotípicos se conjuntaron con los resultados de los marcadores y se analizaron mediante un análisis de conglomerados, usando la metodología de Ward (1963). Se formaron 12 grupos de los cuales, las variedades del grupo 5 fueron las más precoces con un ciclo medio a floración y madurez de 74.8 y 118.6 dds respectivamente. Las variedades más tardías están comprendidas en el grupo 6 (sin alelos Ppd-D1) con una diferencia de hasta 14.3 días en el ciclo a madurez. En general los grupos 3, 4 y 12 poseen variedades con características deseables (precocidad, resistencia a enfermedades y genes asociados a la calidad industrial).

Palabras clave: agrupamientos, fenotipo, genotipo, marcadores moleculares.

Abstract

In pursuit of diversity to include breeding programs is of great importance to study the national collection of wheat gene donor source and based on the genotypic and phenotypic behaviour of their accessions detect significant associations between the two characters, and to group individuals with similar genetic backgrounds for traits of agronomic interest as tolerance to rust, glutenin, height, vernalization. In order to assess the phenotypic characteristics, testing autumn-winter 2010-2011 and 2011-2012 in Roque was set in Nanacamilpa, Tlaxcala and Roque, Guanajuato for two cycles in each locality, and spring-summer 2011 and 2012 in Nanacamilpa. For genotypic variables 16 molecular markers associated with different characteristics of interest in wheat, for rust were used: Lr68, Lr34, Lr46 and Sr2; gluteninas: Glu-A1b, Glu-B1al and Glu-D1; plant height: Rht-B1 and Rht-D1; photoperiod: Ppd-D1a; vernalization: Vrn-A1, Vrn-B1 and Vrv-D1a; endosperm hardness: PinA-D1a and PinB-D1a; and amylose: GBSS. The mean phenotypic characters came together with the results of the markers and analysed by cluster analysis using Ward's methodology (1963). 12 groups which were formed varieties of group 5 were the earliest with an average cycle to flowering and maturity of 74.8 and 118.6 dds respectively. The later varieties are included in Group 6 (no alleles Ppd-D1) with a difference of up to 14.3 days in the cycle to maturity. Generally, groups 3, 4 and 12 have varieties with desirable characteristics (earliness, and disease resistance genes associated with industrial quality).

Keywords: clusters, genotype, molecular markers, phenotype.

Introducción

En 1943 se estableció la Oficina de Estudios Especiales (OEE), y científicos norteamericanos llegaron a México para ofrecer su apoyo técnico. En 1944 llega Norman E. Borlaug para hacerse cargo del programa, constituyéndose el grupo pionero de genetistas del trigo (Triticum aestivum L.) Mexicano, que liberaron variedades semi-enanas con potencial de rendimiento superior a 8 t ha^-1 y amplia adaptación a diferentes regiones no solo del país, sino del mundo, provocando el liderazgo en México de la Revolución Verde. Las primeras variedades de trigo lanzadas fueron 'Supremo 211', 'Frontera', 'Kenia Rojo' y 'Kenia Blanco'. En 1949, se liberaron las primeras variedades resistentes a roya del tallo ('Yaqui 48', 'Nasas 48' y 'Chapingo 48') (Borlaug, 1968). Las primeras variedades semi-enanas en México fueron 'Pitic 62' y 'Pénjamo 62' (Hanson et al., 1982). De esta forma se fue integrando la colección nacional de trigo que actualmente cuenta con un número aproximado de 236 accesiones, que comprende desde variedades criollas hasta variedades recientemente liberadas, y que en conjunto, son una gran fuente de variabilidad genética.

Los Programas de Mejoramiento Genético de Trigo en México, desde sus inicios a mediados de los 40's a la fecha, han trabajado durante dos ciclos agrícolas al año en ambientes ampliamente contrastantes. Durante los años setenta y ochenta, la introducción de germoplasma y la recombinación genética a través de retrocruzas entre trigos de hábito de primavera con los de hábito de invierno (I x P), así como las recombinaciones entre trigo y centeno (Secale cereale L.), permitieron mejorar simultáneamente para adaptación, estabilidad, rendimiento y resistencia a enfermedades, gracias a la translocación del segmento cromosómico 1BL/1RS, que acarreó genes favorables como Lr26, Sr31, Yr9 y PM8 (Villarreal, 1995).

Actualmente los enfoques del mejoramiento se han perfilado a precocidad, alto rendimiento, tolerancia al acame, resistencia a royas, carbón parcial y mejorar la calidad industrial, para ello es necesario hacer uso de mayor variabilidad genética (Villaseñor et al., 2004).

El desarrollo de la genética molecular en el cultivo de trigo ha sido relativamente lenta, en comparación con otros cultivos como el maíz (Zea mays L.), el arroz (Oriza sativa L.) o los tomates (Solanum lycopersicum L.), debido principalmente al nivel de ploidía del trigo, y al tamaño y la complejidad de su genoma (Gupta et al., 1999); sin embargo, existen un gran número de marcadores moleculares asociados a genes o regiones del ADN de interés en trigo, en este trabajo se incluyen solo algunos de los más importantes, que confieren en conjunto características de calidad, resistencia a enfermedades, precocidad y tolerancia al acame, todo ello con la finalidad de incrementar el rendimiento.

Otro tipo de marcadores son los Single Nucleotide Polymorphism (SNPs), que representan una nueva forma de marcador funcional, es decir que con frecuencia está asociado a alguna característica fenotípica, sobre todo cuando se derivan de marcadores de secuencias expresadas. La gran mayoría de los SNPs tienen dos alelos los cuales están representados por la sustitución de una base por otra. En las poblaciones, este tipo de alelos se clasifican en alelo principal o "silvestre" y alelo raro o mutante, clasificación basada en la frecuencia observada en las poblaciones (Checa, 2007).

En el presente estudio se determino la presencia de diferentes genes de interés agronómico, de los cuales, de interés para resistencia a royas fueron Lr34, Lr46, Lr68 y Sr2; de interés para la respuesta al fotoperiodo, la variante alelica Ppd-D1a, la cual otorga sensibilidad al fotoperiodo; de interés para la reducción de altura de planta, los genes de enanismo Rht-B1b (Rht1) y Rht-D1b (Rht2); de interés para el requerimiento de vernalizacion, las variantes alelicas VrnA1, Vrn-B1 y Vrn-D1a, las cuales confieren el habito de crecimiento de primavera; de interés para el contenido de almidón, el gen GBSS (Wx-B1), el cual no reduce el contenido de amilosa; de interés para el contenido de gluteninas de alto peso molecular, los loci Glu-A1b, Glu-B1al y Glu-D1, los codifican para las subunidades Ax*2, Bx7OE y 5+10 respectivamente; por último, de interés para determinar la dureza de grano, los genes PinA-D1a y PinB-D1a.

Es de gran importancia para los mejoradores de plantas, estudiar la variabilidad genética existente en poblaciones como la colección nacional de trigo para detectar fuentes donadoras de genes que permitan incrementar la expresión de los caracteres de interés agronómico.

Con base en lo expuesto, el objetivo de la presente investigación fue determinar la presencia de 16 genes de interés agronómico en 150 genotipos de la colección nacional de trigo, y medir los caracteres fenotípicos altura de planta, días floración, días a madures y porcentaje de infección de roya lineal amarilla, bajo la hipótesis de que se puede agrupar a los genotipos de trigo que posean genes y características similares.

Materiales y métodos

Material vegetativo

La colección nacional de trigo se estima en 236 genotipos aproximadamente, de los cuales 213 son trigos harineros (Triticum aestivum), 19 cristalinos (Triticum durum) y 4 Triticales (Triticosecale). Para este estudio se consideraron 150 genotipos, todos del tipo harinero.

El ensayo se estableció en Nanacamilpa, Tlaxcala y Roque, Guanajuato, cuya localización geográfica aproximada es 19° 29' 34'' latitud norte, 98° 33' 54'' longitud oeste y 2 831 msnm y 20° 32' latitud norte, 100° 48' longitud oeste y 1752 msnm respectivamente. Se establecieron dos ciclos en cada localidad, otoño-invierno (O-I) 2010-2011 y 2011-2012 en Roque, y primavera-verano (P-V) 2011 y 2012 en Nanacamilpa, ciclos en los cuales se evaluaron las variables agronómicas (fenotípicas).

Las extracciones de ADN se llevaron a cabo en el Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, campus Montecillo, en el Laboratorio de Extracciones del Departamento de Genética. La amplificación y lectura de fragmentos se realizó en el Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del CIMMYT, ubicado en El Batán, Texcoco, Estado de México.

Variables de estudio

Se evaluaron variables fenotípicas y genotípicas. Las variables fenotípicas fueron: 1) días a floración (DF), contados desde la siembra hasta la exposición de 50% de espigas por unidad experimental; 2) días a madurez (DM), contabilizados desde la siembra hasta que 50% de las plantas de la unidad experimental adquieren un color dorado, el grano ya no se amasa fácilmente con los dedos, coincidiendo con la madurez fisiológica; 3) altura de planta (AP), medida desde la base del suelo hasta el final de la espiga, cuando la planta ya alcanzó la madurez fisiológica; y 4) roya amarilla (Yr%), se mide en porcentajes de 0 a 100 y la reacción puede ser resistente (r), moderadamente resistente (mr), moderadamente susceptible (ms) y susceptible (s).

Para las variables genotípicas se usaron 16 marcadores moleculares, asociados a diferentes características de interés en trigo. Para royas se emplearon: Lr68, Lr34, Lr46 y Sr2; para gluteninas: Glu-A1b, Glu-B1al y Glu-D1; altura: Rht-B1 y Rht-D1; fotoperiodo: Ppd-D1a; vernalización: Vrn-A1, Vrn-B1 y Vrv-D1a; dureza del endospermo: PinA-D1a y PinB-D1a; y contenido de almilosa: GBSS.

La extracción de ADN se realizo en un robot de extracción de la marca "Thermo scientific", utilizando el kit de extracción "MagJET" de la misma marca y siguiendo el protocolo establecido por la empresa. La amplificación de fragmentos se realizó por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las técnicas empleadas para la amplificación fueron mediante secuencias simples repetidas (SSRs) y polimorfismo de un simple nucleótido (SNPs). La lectura e interpretación de fragmentos para los SSRs se realizó mediante geles de agarosa y electroforesis, mientras que para los SNPs se utilizó el equipo BMG de LABTECH por el método KASP y SNP line de "Kbioscience".

Los marcadores moleculares para SSRs fueron: GBSS, Glu-B1al (TA_BAC17 y TA_BAC24), Glu-A1b, Lr68, Vrn-A1 y Vrn-B1. Para SNP's fueron: Glu-D1, Lr34, Lr46, Sr2, Rht-B1, Rht-D1, PinA-D1a, PinB-D1a, Ppd-D1a y Vrn-D1a.

Este análisis básicamente separa en grupos que son diferentes entre sí a los objetos o individuos y dentro de cada grupo los objetos o individuos que lo conforma son muy parecidos entre sí. Mediante la aglomeración los individuos inician solos en grupos de uno, posteriormente los individuos más cercanos son gradualmente agrupados hasta que finalmente todos los individuos quedan dentro de un único grupo, lo cual es representado mediante un dendrograma. Otro procedimiento consiste en definir k grupos o conglomerados aleatorios y entonces se mueven los objetos entre estos grupos para reducir la variación dentro de ellos y maximizar la diferencia entre ellos, buscando que esta sea lo más grande posible, tal como lo hace la metodología propuesta por Ward (1963). Las distancias entre los individuos son calculadas mediante una generalización de la distancia euclidiana (d_ij):

d_ij= √ {(x_i1 – x_j1) + (x_i2 – x_j2)}

La cual para p atributos quedará como:

d_ij= √ Σ (x_ik – x_jk)2

Comparación de medias multivariadas

Se aplicó la prueba de t univariada y T2 multivariada para contrastar los grupos generados:

T2 = n1n2(x1-x2)'C-1(x1-x2)/(n1+n2)

Donde: n1, n2= número de observaciones asociadas con los vectores de medias x1 y x2; C= matriz con las estimaciones conjuntas de varianza covarianza de los n1 y n2 datos.

F= (n1+n2-p-1)T2/{(n1+n2-2)p}

Comparada con valores tabulados con p y (n1+n2-p-1) grados de libertad, donde "p" representa el número de variables utilizadas en la comparación de los dos grupos de medias (Manly, 1986).

Resultados y discusión

Se retuvieron 12 grupos ya que con ellos se clasificó bien a los 150 genotipos. Los grupos cinco y tres fueron los más grandes, ambos conformados por 24 variedades, mientras que el grupo seis fue el de menor tamaño, formado solamente con tres variedades. En la Figura 1 se observan los 12 agrupamientos, el número de grupo está indicado a la izquierda del mismo.

En el Cuadro 1 se indican los genotipos que conforman cada uno de los 12 grupos de la Figura 1 y 2.

Dado que los valores de las variables genotípicas están representados por ceros y unos, el valor medio más alto será 1 (cuando esté presente la secuencia de ADN buscada en todas las variedades del grupo), por lo cual podemos hablar en porcentajes si este lo multiplicamos por 100. En el Cuadro 2 aparecen los valores medios de cada grupo y se observa que las variedades del grupo 5 fueron las más precoces con un ciclo medio a floración y madurez de 74.8 y 118.6 dds respectivamente; asimismo, el gen que controla la respuesta al fotoperiodo Ppd-D1a (Yang et al., 2009), se encuentra presente en 90% de las variedades de este grupo. Las variedades más tardías están comprendidas en el grupo 6 (sin alelos Ppd-D1a) con una diferencia de hasta 14.3 días en el ciclo a madurez. Esto es de gran importancia ya que para algunos productores, sobre todo los que hacen uso de agua de presas, esas dos semanas hacen la diferencia entre sembrar dos cultivos por ciclo agrícola o no.

Los grupos 1, 3, 4, 7, 8, 9, 10 y 12 también tienen presente el alelo Ppd-D1a en una alta frecuencia, y sus ciclos son considerados precoces, excepto el del grupo 1, que contradictoriamente tiene un ciclo a floración y madurez ligeramente tardía, pero el gen Ppd-D1a se encuentra presente en 100% de las variedades de ese grupo. Una posible respuesta a ese fenómeno podría ser que, ese grupo tiene un alto porcentaje de variedades con el gen Vrn-D1a (70%), el cual a pesar de estar asociado con variedades de hábito de primavera, también se asocia con el hábito de crecimiento facultativo (tanto de primavera como de invierno), ya que está presente en variedades que van desde hábitos de crecimiento de primavera (sin requerimiento de vernalización) hasta variedades con requerimientos de vernalización intermedia (Zhang et al., 2012).

Otros grupos que también tienen una frecuencia alta de alelos Vrn-D1a son el 3, 5, 7, 8 y 12 (100, 70, 100, 70 y 90% respectivamente). Los grupos 2, 4, 6, 9, 10 y 12 tienen una alta frecuencia del alelo Vrn-A1, el cual es el loci principal de vernalización en trigo, asociado al habito de crecimiento de primavera, es decir, variedades que no requieren vernalización (McIntosh et al., 2007). El 90% de las variedades del grupo 12 presentan ambos tipos de alelos (Vrn-D1a y Vrn-A1).

En lo que respecta a royas, las variedades del grupo 6 (solo tres variedades de las más antiguas) resultaron ser las más resistentes a la enfermedad, contando únicamente con la presencia del alelo Lr46, mientras que las del grupo 8 fueron las más susceptibles. Lo anterior no concuerda con Lillemo et al. (2011), quienes confirman los efectos aditivos de Lr68 con otros genes de resistencia a roya de la hoja, así como también confirman que Lr68 muestra un efecto mayor que Lr34 y Lr46. Otros de los grupos resistentes a la enfermedad fueron el 4 y 12, destacados por tener la presencia de los alelos Lr34, Lr46 y Lr68 en combinación; sobre todo el grupo 12, que mostró las mayores frecuencias de estos tres alelos (100% de Lr68, 90% de Lr34 y 90% de Lr46), su porcentaje de infección fue apenas de 13.2%, el cual es muy aceptable. Los resultados concuerdan con los de Herrera et al. (2012), quienes demostraron que el efecto combinado de Lr34, Lr46 y Lr68 en algunas variedades da resultados cerca de la inmunidad.

La gran mayoría de los genotipos de la colección nacional de trigo estudiados tienen presente el gen GBSS (loci Wx-B1 de tipo silvestre) previamente asociado a características de calidad para la industria panadera y de galletas, (no reduce el contenido de amilosa) (Miura et al., 1994), excepto las del grupo 6; los grupos 8, 9, 10, 11 y 12 tienen presente el gen en más de 60% de las variedades que los integran. Otro componente responsable de calidad de harina son las gluteninas (Martínez et al., 2012); los genotipos del grupo 1 ninguna cuenta con el complejo Glu-1 (Glu-A1b, Glu-B1al y Glu-D1), mientras que las del grupo 4 todas tienen el gen Glu-B1al (100%) que codifica para la subunidad B x 7 sobre expresado, asociado con una mejor fuerza de la masa de harina de trigo (Liu et al., 2008); 40% de las variedades tienen presente el gen Glu-A1b que codifica para la subunidad Ax2* , la cual tiene efectos positivos en la fabricación de pan (Nakamura, 2000); y 60% Glu-D1, que codifica la subunidad 5+10 que es la mejor combinación para gluteninas de alto peso molecular (Liu et al., 2008). Estas dos características (royas y calidad) pudieran considerarse como dos de los principales objetivos de los programas de mejoramiento genético de trigos mexicanos junto con la reducción de la altura de planta.

El alelo Glu-B1al se encontró únicamente en el grupo 4. Los grupos 6, 10 y 11 solo tienen la presencia de Glu-A1b. En el resto de los grupos (2, 3, 5, 7, 8, 9 y 12) está presente tanto Glu-A1b como Glu-D1. En lo que se refiere a la textura del endospermo o dureza, las variedades del grupo 1 se clasifican como «suave», ya que 100% de estas tiene presente los alelos de tipo salvaje PinA-D1a y PinB-D1a. Ambos actúan juntos en la determinación de la textura de grano, la presencia de ambos loci determina suavidad, mientras que la ausencia de cualquiera de los dos determina endospermo de tipo duro (Morris et al., 2001). También pueden considerarse «suave» las de los grupos 5, 9 y 11, ya que todas las variedades cuentan con PinB-D1a y 50, 40 y 70% respectivamente de PinA-D1a. El resto de los grupos (2, 3, 4, 6, 7, 8, 10 y 12) solo tienen presente ya sea PinA-D1a ó PinB-D1a, por lo cual se les puede clasificar como variedades «duras». Turnbull y Rahman (2002) indican que se prefieren las harinas de trigos duros para hornear pan con levadura, mientras que las harinas de trigos blandos se prefieren para la fabricación de galletas y pasteles.

La utilidad del análisis de conglomerados ha sido reportada por varios autores quienes indican que permite una caracterización parcial o previa de los genotipos comprendidos en los grupos y que arrojan información de su comportamiento y posible utilidad (Ye et al., 2001).

Conclusiones

De los 12 grupos formados, las variedades del grupo 6 son las que poseen menor número de características favorables para un programa de mejoramiento, de los 13 genes deseados, solo presenta 5. Si se desea la obtención de variedades precoces, se deben considerar las variedades de los grupos 5, 9 y 10 como fuentes de donación de alelos para esta característica. Las variedades de los grupos 1, 3, 4, 5 y 12 son las indicadas para heredar el conjunto de genes Lr68, Lr46, Lr34 y Sr2. Si se desea la obtención de variedades con características deseables para la industria (calidad), los grupos 3, 4, 7, 8 y 12 son los indicados.

En general los grupos 3, 4 y 12 poseen variedades con características deseables (precocidad, resistencia a enfermedades y genes asociados a la calidad industrial) para un programa de mejoramiento.

La presente investigación se realizó con el apoyo del proyecto Núm. 146788 denominado: 'Sistema de mejoramiento genético para generar variedades resistentes a royas, de alto rendimiento y alta calidad para una producción sustentable de trigo en México'. Del fondo S0007-2010-03 de la convocatoria SAGARPA-CONACYT.

Literatura citada

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