Xanthomonas campestris pv. campestris causante de manchas foliares del filodendro (Philodendron scadens subsp. oxycardium) en Cuautla, Morelos, México*

Xanthomonas campestris pv. campestris responsible of leaf spots in Philodendron (Philodendron scadens subsp. oxycardium) in Cuautla, Morelos, Mexico

Sandra Lourdes Moya-Hernández¹, María de Lourdes Rodríguez-Mejía^2§ y Mario Espinosa Mendoza³

¹ Dirección General de Sanidad Vegetal-Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria Laboratorio de Bacteriología, Tel: 5090300 Ext: 51333, Guillermo Pérez Valenzuela Núm. 127, Col. del Carmen, Coyoacán, D. F. (lourdes_2111@hotmail.com).

³ Laboratorio de Biología Molecular Centro Nacional de Referencia Fitosanitario SENASICA-SAGARPA. (mario.espinosa@senasica.gob.mx). §Autor para correspondencia: rodrime_lu@hotmail.com

* Recibido: octubre de 2014
Aceptado: enero de 2015

Resumen

En los últimos cinco años, en viveros del estado de Morelos, se observaron plantas de filodendro (Philodendron scadens subsp. oxycardium), con manchas necróticas de aspecto húmedo y rodeadas de un halo clorótico, la presencia de esta enfermedad reduce el valor comercial de la planta y afecta su calidad. Esta enfermedad se encontró con una incidencia de 7 a 11%. Se realizaron aislamientos del tejido enfermo en medio BK y CPG, obteniendo colonias bacterianas de color amarillo, Gram negativas, aeróbicas y de consistencia mucoide en el medio YDC. La reproducción de síntomas se logró con la inoculación por aspersión de una suspensión acuosa con 10⁵ UFC mL^-1. La identificación se llevó a cabo con pruebas fisiológicas, bioquímicas, por PCR, y por la secuenciación del fragmento del 16S rDNA, de esta manera el agente causal de la necrosis foliar del filodendro fue identificado como Xanthomonas campestris pv. campestris.

Palabras clave: bacteria, PCR, secuenciación.

In the last five years in nurseries from the state of Morelos, philodendron plants (Philodendron scadens subsp. oxycardium) were observed with necrotic spots wet look and surrounded by a chlorotic halo; the presence of this disease reduces the commercial value of the plant and affects its quality. This disease was found with an incidence of 7-11%. Isolates from diseased tissue in BK and CPG medium were made, obtaining yellow bacterial colonies, gram negative, and aerobic and mucoid consistency in YDC medium. Reproduction of symptoms was achieved with inoculation by spraying an aqueous suspension of 10⁵ CFU mL^-1. The identification was carried out with physiological, biochemical tests, PCR, and sequencing the fragment 16S rDNA, in this way the causative agent of leaf necrosis on philodendron was identified as Xanthomonas campestris pv. campestris.

Keywords: bacteria, PCR, sequencing.

Introducción

El filodendro (Philodendron scadens subsp. oxycardium Koch & Sello) es una planta ornamental de follaje originaria de las islas del sudeste asiático y la Polinesia. En México se han registrado siete especies endémicas concentradas en las zonas tropicales de los estados de Veracruz, Chiapas y Oaxaca (Acebey, 2007). Pertenece a la familia Araceae, con hojas alternas anchas y acorazonadas, de color verde brillante, jaspeadas de manchas blancas o amarillas y es comúnmente vista como planta de interior debido a su facilidad de crecimiento y alta tolerancia a pocas condiciones de luz. Actualmente se produce en el estado de Morelos ya que es utilizada como planta de ornato en casas y jardines; así como, de corte en complementos de arreglos florales.

En los últimos cinco años se ha observado en viveros de la zona de Cuautla, Morelos plantas de filodendro, con manchas foliares, necróticas de aspecto húmedo y rodeadas por un halo amarillo, las cuales reducen notablemente su calidad, por lo cual, se decidió realizar la presente investigación con el objetivo de determinar la etiología de la enfermedad.

Obtención de muestras. En viveros del estado de Morelos se recolectaron 20 muestras de hojas de plantas de filodendro, que presentaban manchas necróticas, húmedas y con un halo clorótico. Las muestras fueron mantenidas a temperatura ambiente para su análisis.

Aislamiento. Se verificó la presencia de bacterias a través de la observación del flujo bacteriano. Las hojas enfermas fueron dividas en porciones de aproximadamente 1 cm², se desinfectaron con una solución acuosa de hipoclorito de sodios al 1%/ 1 min. y posteriormente se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y bajo condiciones asépticas, el tejido desinfectado se transfirió a un tubo con agua destilada estéril y se agito por unos 10 min para que el agua se enturbio y con ellas se sembraron por estría cruzada varias cajas con medio de cultivo CPG (10 g de peptona, 1g de ácidos casaminos, 10 g de glucosa, 18 g agar y 1 L de agua)y BK (20 g de proteosa peptona N° 3, 1.5 g de K2HPO4 3H2O, 1.5 g de MgSO4 7H2O, 15 mL de glicerol, 15 g de agar y 1 L de agua ), estas se incubaron a 28 °C durante 48 h. Las colonias individuales se purificaron en medios YDC y BK (Guevara, 2004).

Pruebas de patogenicidad. Se utilizó una suspensión bacteriana preparada con colonias de 24 h de crecimiento en medio BK, ajustada a una concentración de 10⁸ UFC mL^-1. La inoculación se realizó por infiltración en hojas de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi), y en plantas sanas de filodendro se inoculó también por aspersión, pero en este caso la concentración se redujo a 10⁵ UFC ML^-1. Las plantas testigo se inocularon con agua destilada estéril. Las plantas de filodendro se mantuvieron en cámara húmeda hasta la reproducción de síntomas. También se inocularon rodajas de papa con cultivo bacteriano las que se mantuvieron a una temperatura de 28 °C y en condiciones de alta humedad relativa (Rodríguez, 2006).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La extracción del DNA de la cepas bacterianas se realizó con el kit Plant DNAzol® Reagent (Invitrogen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La integridad del DNA se verificó en un espectrofotómetro modelo Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA), tomando como referencia el valor de absorbancia 260/280 de 1.7 - 2.

La mezcla de reacción se preparó para un volumen de 25μL con 20 picomoles de cada iniciador, 1 μL de dNTP a una concentración de 200 nM, 5μL de 1X buffer para PCR, 3μL de MgCl2 a una concentración final de 1.5 nM, 2.5 μL de Taq Polimerasa (Roche, USA), 5μL de DNA y 29.5 μL de agua grado PCR, para obtener un volumen final de 50μL. Los oligonucleótidos utilizados fueron universales para la detección de bacterias: 8F 5'-GGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG-3' modificado por acortamiento del extremo 5'; por Falske et al. (1997) y 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (universal Turner et al 1999) que amplifican un fragmento de 1 500 pares de bases (pb) de la región del gen rDNA 16S. La amplificación del fragmento se realizó con las siguientes condiciones de termociclaje: un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante 4 min, seguido de 35 ciclos a 95 C por 2 min, 56 C por 1 min y 72 C durante 1. 50 min, con una extensión final de 72 C por 5 min. Para observar los fragmentos amplificados se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%, se cargaron de 15 a 20 μL de los productos de PCR en cada pozo y se corrió a 100 volts durante una hora, transcurrido el tiempo el gel se tiño con 1mg de bromuro de etidio en 1 000 mL de agua destilada durante 20 min, posteriormente el gel se enjuago en agua destilada (CIMMYT, 2006) y finalmente los fragmentos de ADN se visualizaron en un transiluminador modelo Gel Doc XR (BioRad, USA).

Secuenciación y alineamiento. El producto de PCR fue secuenciado en un equipo Genetic Analyzer 3130 (APPLIED BIOSYSTEM, USA). Las secuencias de ambas regiones se ensamblaron y editaron usando el programa BioEdit v7.0.5 (Hall, 1999) con el cual se creó una secuencia consenso, y se comparó con secuencias depositadas en el National Center Biological Information (NCBI, 2010) y en Ribosomal Database Project, a través de la opción BLAST 2.2.19. La historia de la evolución fue inferida utilizando el Maximun Likelihood (ML) con el programa MEGA5.

El árbol filogenético se realizó con el programa MEGA5 comparando 26 secuencias de diferentes especies de Xanthomonas y el fuera de grupo está representado por una secuencia de Stenotrophomonas maltophilia.

Durante los muestreos se observaron plantas de filodendro con hojas que presentaban manchas necróticas, húmedas y rodeadas por un halo clorótico (Figura 1 A) y después de cierto tiempo el tejido necrosado se desprendía (Figura 1 B).

Aislamiento e identificación

De las manchas foliares se aislaron con frecuencia colonias amarillas, circulares de borde liso y mucoides (Figura 2) las cuales fueron purificadas en medio YDC y BK.

La bacteria resultó ser Gram negativa, aeróbica, de crecimiento mucoide en medio YDC, catalasa positiva, oxidasa negativa, incapaz de reducir los nitratos a nitritos, además de no crecer en medio de cultivo CPG con cloruro de trifenil tetrazolio al 0.1%. Estas características son reportadas por Duveiller et al. (1997) como típicas del genero Xanthomonas.

La bacteria creció a 35 °C, produjo H₂S, toleró cloruro de sodio a 2%, licuó la gelatina, hidrolizó la esculina y el almidón; y produjo ácido a partir de arabinosa, glucosa, manosa, galactosa, celobiosa, fructosa y melobiosa. Estos resultados coinciden con lo citado por Rodríguez (2006) para la especie Xanthomonas campestris. Además la bacteria creció muy bien en el medio selectivo SX, el cual esta cosntituido por :10 g de almidón soluble de papa, 1 g de extracto de carne, 5 g de cloruro de amonio, 2 g de K2HPO4, 1mL de violeta de metilo (sol al 1% en etanol al 20%), 2 mL de verde de metilo (sol acuosa al 1%), 250 mg de cicloheximida, 15 g de agar y 1L de agua destilada) lo cual también es característico de esta especie (Guevara, 2006).

Pruebas de patogenicidad. Las pruebas de patogenicidad resultaron positivas, cumpliéndose los postulados de Koch; en las hojas de tabaco se presentó una reacción de hipersensibilidad a las 24 h de la inoculación tal y como lo menciona Duveiller et al. (1997), las plantas de filodendro inoculadas tanto con el método de infiltración como el de aspersión presentaron manchas necróticas, húmedas y rodeadas por un halo clorótico (Figura 3).

Las rodajas de papa presentaron una pudrición blanda generalizada y según Dianese (1985) algunas cepas de X. campestris pv. campestris presentan elevadas concentraciones de ácido poligalacturónico y pectinesterasa que inducen la liberación de electrolitos y provocan la maceración de los tejidos. En los reaislamientos de la zona afectada se obtuvieron colonias bacterianas con las mismas características que la inoculada inicialmente.

Reacción en cadena de la polimerasa. El fragmento amplificado con los iniciadores 8F y 1492R a partir de las cepas bacterianas fue de aproximadamente de 1 500 pb (Figura 4).

Secuenciación y alineamiento

El alineamiento de la secuencia consenso resultante del análisis con el programa Bioedit y marcada comoXanthomonas sp. 3 al ser alineada con la base de datos Ribosomal data base project arrojó una identidad de 100% con Xanthomonas campestris. Esta base de datos alinea exclusivamente el rDNA 16S de bacterias y tiene una alta confiabilidad. El árbol filogenético se realizó con el programa Mega 5 comparando 26 secuencias de diferentes especies de Xanthomonas y el fuera de grupo está representado por una secuencia de Stenotrophomonas maltophilia, en él se puede observar que la cepa aislada del filodendro se agrupa con Xanthomonas campestris (Figura 5).

Conclusiones

El análisis BLAST de la secuencia nucleotídica obtenida mostró una máxima identidad de 98% con la secuencia ATCC 33913 depositada en el Gen Bank y que corresponde a Xanthomonas campestris.

Los resultados de las pruebas bioquímicas confirman que el agente causal de las manchas foliares del filodendro pertenece a la especie en mención.

Literatura citada

Acebey, A. 2008. Diversidad y distribución de Araceae de la Reserva de la Biosfera de los Tuxtlas Veracruz, México. Rev. Mex. Biod. 79(2):3-4.         [ Links ]

Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT). 2006. Protocolos de Laboratorio. Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del CIMMYT. Tercera edición. 100 p.         [ Links ]

Dianese, J. 1985. Actividad pectolítica de patovares de Xanthomonascampestris que afectan a la mandioca. Rev. Microbiol. 16:195-202.         [ Links ]

Duveiller, E.; Fucikovsky, L. and Rudolph, K. 1997. The bacterial diseases of wheat: concepts and methods of disease management. Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT). El Batán, Estado de México. 65 p.         [ Links ]

Falske, A.; Rheims, H.; Wolterink, A.; Stackebrandt, E. and Akkermans, A. D. 1997. Ribosome analysis reveals prominent activity of an uncultured member of the class Actinobacteria in grassland soil. Microbiology. 143:2983-2989.         [ Links ]

Guevara, Y. 2004. Bacteriosis en cilantro (Coriandrum sativum L.) causada por Xanthomonas campestris (Pammel) Dowson en Venezuela. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Maracay, Venezuela. Rev. Mex. Fitopatol. 23- 001.         [ Links ]

Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.         [ Links ]

Rodríguez, M. M. 2006. Manual para la identificación de bacterias fitopatógenas. Universidad Autónoma Chapingo (UACH). Departamento de Parasitología Agrícola. Texcoco, Estado de México. 146 p.         [ Links ]

Saitou, N. and Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol. Evol. 4:406-425.         [ Links ]

Turner, S.; Pryer, K.; Miao, V. and Palmer, J. 1999. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. J. Eukaryotic Microbiol. 46:327-338.         [ Links ]