Razas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en predios tomateros en San Luis Potosí*
Races of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato farmlands in San Luis Potosí
Rosendo Hernández Martínez1, Alfonso López Benítez2§, Fernando Borrego Escalante2, José Espinoza Velázquez2, David Sánchez Aspeytia3, Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza4 y Luis Alejandro López Ochoa5
1 INIFAP-Campo Experimental Rio Bravo. Carretera Matamoros-Reynosa, km 61. A. P. 172. C. P. 88900. Rio Bravo, Tamaulipas. México. Tel: 018999340745. (ing_rosendohm@hotmail.com).
]]> 2 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Depto. de Fitomejoramiento, Calzada Antonio Narro No. 1923. C. P. 25315. Saltillo, Coahuila, México. Tel: 018444110298. (fborrego@uaaan.mx), (jespvel@uaaan.mx). §Autor para correspondencia: alfopezbe_2000@hotmail.com.3 INIFAP- Unidad Saltillo, Carretera Saltillo-Zacatecas km. 342+119. No. 9515. C. P. 25315. Col. Hacienda de Buenavista, Saltillo, Coahuila, México. Tel: 018444391901. (dsanchezaspeytia@yahoo.com.mx).
4 CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, Departamento Agropecuario Boulevard Juan de Dios Bátiz Paredes. No. 250. A. P. 280. C. P. 81100. Guasave, Sinaloa, México. Tel: 016878729626. (ignacioemaldonado@yahoo.com.mx; imaldona@ipn.mx).
5 Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Forestales. A. P. 41. C. P. 67700. Linares, Nuevo. León. México. Tel: 018212124895. (lopezochoa.luis@gmail.com).
* Recibido: enero de 2014
Aceptado: junio de 2014
Resumen
La marchitez por Fusarium causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) es una de las enfermedades más importantes del cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.). Su variabilidad patogénica ha originado las razas 1, 2 y 3, ya descritas en varios países. En México se ha reportado en Sinaloa, Baja California Sur y Morelos. El tomate es un cultivo hortícola muy importante en Villa de Arista, San Luis Potosí, por lo que el objetivo de este trabajo fue caracterizar mediante pruebas de patogenicidad la variabilidad en la virulencia de aislamientos de Fol en predios tomateros de esta región. Se obtuvieron 27 aislamientos de Fusarium oxysporum de plantas de tomate con síntomas característicos de la marchitez por Fusarium de nueve variedades en siete predios tomateros, las cuales se procesaron en laboratorio para aislar el hongo, purificarlo, preparar inoculo y realizar pruebas de patogenicidad. Las variedades diferenciales utilizadas fueron Bonny Best, susceptible a las razas 1, 2 y 3; Manapal, resistente a la raza 1; Walter, resistente a las razas 1 y 2; e I3R3, resistente a las razas 1, 2 y 3. Las razas identificadas fueron, raza 2 en las variedades Rafaello y Tipsey en los predios Agro Viva y Rancho el Clérigo, y la raza 3 en las variedades El Cid, Aníbal y 77-05 en los predios San Gilberto, Santa María Elena y Lourdes. La identificación de estas razas mediante la técnica molecular de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) coincidió con los resultados de las pruebas patogénicas.
]]> Palabras claves: Solanum lycopersicum L, marchitez vascular del Fusarium, Fol razas 2 y 3.
Abstract
Wilting caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) is one of the most important diseases of tomato (Solanum lycopersicum L.). Its pathogenic variability originated races 1, 2 and 3, as described in several countries. In Mexico has been reported in Sinaloa, Baja California Sur and Morelos. Tomato is a quite an important horticultural crop in Villa de Arista, San Luis Potosí, and for this reason, the aim of this study was to characterize pathogenicity tests by the variability in virulence of isolates of Fol in tomato farmlands of this region. 27 isolates of Fusarium oxysporum were gathered from tomato plants with characteristic symptoms of wilting of tomato plants in nine varieties of seven lots, which were processed in the laboratory to isolate the fungus, purify were obtained prepare inoculum and pathogenicity tests. Differential varieties used were Bonny Best susceptible to races 1, 2 and 3; Manapal resistant to race 1; Walter, resistant to races 1 and 2; I3R3 and resistant to races 1, 2 and 3. The races identified were race 2 in the Rafaello and Tipsey on the fields Agro Vida and Rancho el Clérigo, and race 3 in the varieties El Cid, Hannibal, and 77-05 in the farmlands San Gilberto, Santa María Elena and Lourdes. The identification of these breeds was made using the molecular technique of Chain Reaction (PCR) coincided with the results of tests pathogenic.
Keywords: Solanum lycopersicum L., vascular Fusarium wilt, Fol races 2 and 3.
Introducción
El tomate es una de las hortalizas de mayor consumo a nivel mundial, además de ser una de las de mayor valor económico, su demanda aumenta continuamente y con ella su cultivo, producción y comercio. Es considerado como una de las hortalizas de mayor importancia en muchos países del mundo, por el gran número de productos que se obtienen. La FAO en sus registros ubica a China como el principal productor de tomate con 48 millones de toneladas. México ocupa el onceavo lugar con 2.4 millones de toneladas anuales (FAO, 2011). Los principales estados productores de tomate en México son; Sinaloa, Baja California, Michoacán, Jalisco, Yucatán y San Luis Potosí. El rendimiento promedio nacional es de 41.67 t ha-1 (SIAP-SAGARPA, 2011).
El tomate, como todos los cultivos, es afectado por diferentes factores que limitan su producción y por ende su rentabilidad. Entre los factores más importantes que afectan el desarrollo normal de este cultivo se encuentra las enfermedades de tipo infeccioso provocada por hongos, las cuales se presentan en la mayoría de las zonas tomateras de México.
Una de las enfermedades de mayor importancia para este cultivo es la marchitez vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) (Sacc.) Snyder y Hansen (Agrios, 2004), la cual puede causar pérdidas superiores a 50% (Apodaca-Sánchez et al., 2004). Esta enfermedad ha sido identificada como una de las más devastadoras en todas las regiones del mundo donde se cultiva el tomate (Marlatt et al., 1996) y es particularmente severa en áreas con clima cálido.
]]> El hongo tiene una gran capacidad genética para generar variantes en apariencia y coloración de las colonias, así como en la producción de microconidios, y clamidosporas (Nelson et al., 1983; Zunilde y Sanabria, 2001). Esta capacidad de variación también se manifiesta en su virulencia por la aparición de razas fisiológicas. La existencia de razas fisiológicas en Fol fue demostrada mediante pruebas de patogenicidad, donde las razas son distinguidas por su virulencia sobre variedades de tomate que llevan genes específicos para resistencia (McGrath et al., 1987; Stall, 1961). Hasta ahora se han descrito tres razas (Davis et al., 1988; Chellemi et al., 1992; Valenzuela-Ureta et al., 1996; Ascencio-Álvarez et al., 2008).La existencia de la raza 1 fue descrita por primera vez en 1886 (Booth, 1971) y la resistencia a esta raza fue encontrada en el locus 1 de Solanum pimpinellifolium PI-79532 (Bohn y Tucker 1940), la raza 2 fue identificada inicialmente en 1945 en Ohio (Alexander y Tucker, 1945) y la resistencia a esta nueva raza eliminarse encontró en el nuevo locus (1-2) del híbrido natural S. esculentum x S. pimpinellifolium PI-126915 (Alexander y Hoover, 1955). La raza 3, capaz de atacar los cultivares con los loci para resistencia 1 y (1-2) fue identificada en Queensland, Australia en 1978 (Grattidge y O' Brien, 1982). Ésta raza se ha observado en Estados Unidos de América (Davis et al., 1988; Chellemi et al., 1992; Marlatt et al., 1996; Bost, 2001) en México (Valenzuela-Ureta et al., 1996; Ascencio-Álvarez et al., 2008) y en Brasil (Reis et al., 2004).
La fuente de resistencia a esta nueva raza se encontró en la especie silvestre Solanum pennellii P1414773 designando al locus que le confiere control a esta raza de Fol (1-3) (Mc Grath et al., 1987). Con la finalidad de reducir las pérdidas económicas debido a las enfermedades, los agricultores aplican grandes cantidades de productos químicos por ciclo de producción y en ocasiones sin tener un control adecuado sobre el número y momento de las aplicaciones, lo que da lugar a mayores costos de producción y contaminación ambiental.
El método más sencillo, barato, efectivo y seguro para su control en la producción agrícola es el uso de cultivares resistentes (Fernández-Valiela, 2001). Sin embargo, es de particular importancia para el fitomejorador, el conocimiento y entendimiento de la capacidad de variación genética de un patógeno, pues esto constituye el origen y posterior diseminación de nuevas razas fisiológicas con la habilidad para atacar variedades que previamente eran resistentes. El monitoreo de las poblaciones de patógenos en los lotes de producción ha sido muy valioso para el desarrollo y uso de variedades resistentes (Andrivon, y Vallavieille-Pope, 1993) y ha permitido una visión clara de la evolución de las poblaciones de los patógenos como respuesta a la selección debida a los genes para resistencia utilizados.
Los objetivos de este trabajo fueron determinar, mediante pruebas de patogenicidad la variabilidad en la virulencia de aislamientos de Fol en predios productores de tomate en el estado de San Luis Potosí y la identificación de las razas por genotipificación en variedades con resistencia diferencial a las razas de Fol y confirmando estas observaciones empleando una metodología de PCR diferencial.
Materiales y métodos
Muestreo, aislamiento y purificación del patógeno. El 27 de octubre de 2011, se colectaron veintisiete muestras de tallos de plantas enfermas con síntomas característicos de marchitez vascular por Fusarium en cinco predios tomateros comerciales del municipio de Villa de Arista, San Luis Potosí. Los variedades muestreadas fueron: China, Rafaello, Antare, 77-05, Moctezuma, Aníbal, Imperial, El Cid y Tipsey. Los predios muestreados fueron: Agro Viva, Rancho el Clérigo, San Gilberto, Santa María Elena y Lourdes. Las muestras colectadas se colocaron en bolsas de polietileno, se identificaron con datos de fecha, lugar de muestreo, variedad muestreada, tipo de muestra y se transportaron en hielera al laboratorio de Patosistemas Agrícolas del Departamento de Fitomejoramiento de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), para aislar el hongo en medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA), identificarlo morfológicamente y purificarlo. De las muestras colectadas se tomaron fragmentos longitudinales de 5 mm de tallos con síntomas de la enfermedad, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 2% por un min y se lavaron después con agua destilada estéril, se secaron y transfirieron asépticamente a placas de Petri con medio de cultivo PDA e incubados a 25 °C por 7 días. Los aislamientos obtenidos se sub-cultivaron posteriormente en PDA, para producir cultivos puros mediante puntas de micelio que fueron utilizados después para su identificación y pruebas de patogenicidad. La identificación de los aislamientos se hizo considerando la sintomatología en plantas enfermas, la observación y comparación de sus características morfológicas de micelio y conidios en medio de cultivo a nivel microscópicos (Booth, 1977; Summerell et al., 2003).
Pruebas de patogenicidad en diferenciales. Los genotipos que se utilizaron como materiales diferenciales fueron; Bonny Best, sin genes de resistencia y susceptible a las tres razas; Manapal, resistente solo a la raza 1 por la presencia del locus 1 pero susceptible a las razas 2 y 3; Walter, resistente a las razas 1 y 2 debido a la presencia de los loci 1 y 1-2, pero susceptible a la raza 3; e I3R3, resistente a las razas 1, 2 y 3 debido a la presencia del gen 1-3 (Reis et al., 2004; Scott et al., 2004) y se proporcionaron por el Dr. John Paul Jones, del Instituto de Ciencias para la Agricultura y la Alimentación de la Universidad de Florida. La siembra de las variedades diferenciales se realizó en diciembre de 2011 en invernadero en charolas de poliestireno de 200 cavidades conteniendo peat moss (Premier, Pro-mix. Pgx. Professional) y se inocularon con el hongo Fol 25 días después de siembra, siguiendo el método de inmersión de puntas de raíz (Williams, 1981).
El experimento consistió en el establecimiento de cinco plantas de cada una de las cuatro variedades diferenciales con tres repeticiones para cada uno de los 27 aislamientos, bajo un diseño de bloques al azar. Las plántulas de cada juego de diferenciales se sacaron con cuidado de las celdas de las cajas y con un suave chorro de agua se eliminó el exceso de sustrato, teniendo cuidado de mantener íntegras las raíces, después, se cortaron con tijeras aproximadamente dos centímetros de la punta de las raíces y se sumergieron durante dos minutos en una suspensión de 1 x 106 conidios por mL, utilizando un juego de diferenciales para cada aislamiento del hongo. Después de la inoculación, las plántulas fueron trasplantadas a vasos de plástico de 0.5 L de capacidad conteniendo una mezcla de peat moss (Premier saphagnum peat moss turbe, catálogo # 70976040, lote SKU 673116) y suelo de bosque de la región estéril, manteniéndose en el invernadero a una temperatura aproximada de 25 ± 2 °C bajo condiciones de luz natural e irrigándose cuando fuera necesario. La evaluación de la respuesta a la inoculación se realizó 25 días después de la inoculación con base a la presencia o ausencia de síntomas de la enfermedad, considerados estos como amarillamiento foliar, marchitez, coloración amarillenta o café de los haces vasculares y coloración café en la raíz. La severidad de la enfermedad se evaluó utilizando la escala de severidad del 1 al 5 de Marlatt et al. (1996).
]]> Identificación de razas de Fol por PCR diferencial. Se realizó la amplificación de ADN por la técnica de PCR anidada que consiste en dos reacciones secuenciales de PCR, utilizando como templado para la segunda reacción el producto obtenido de la primera, el cual contiene el fragmento que se desea amplificar en la segunda reacción. Para las primeras reacciones, se amplificaron los fragmentos de los genes endo poligalacturonasa (pg1) y exo poligalaturonasa (pgx4), utilizando el conjunto de primers endoF + endoR y exoF + exoR descritos por (Di Pietro y Roncero, 1998 y Posada et al. 2000). El volumen de la reacción de PCR fue de 12.5 µl, la cual contenía 8.05 µl de agua ultrapura, 1.25 μL de buffer de reacción para PCR, 0.5 μL MgCl2 (50 µM), 0.5 μL de dNTP's (10 µM), 0.5 μL de cada primer (10 µM), 0.2 μL de Taq DNA polymerase (1 U) y 1 μL de ADN (100 pg) de la muestra correspondiente.La amplificación del ADN se realizó en un termociclador Multigene (Labnet International, Inc., EUA). Las condiciones del amplificador fueron: desnaturalización 4 min a 95 ºC; seguido de 30 ciclos de 1 min a 94 ºC, anillamiento 1 min a 62 ºC y elongación 2 min a 72 ºC; y un ciclo final de 5 min a 72 ºC. Para la segunda reacción de PCR anidado se utilizaron los primers unif + unir, sp23f + sp23r para la re-amplificación del gen pg1 y sp13f + sp13r, sprlr + sprlr para re-amplificar el gen pgx4, descritos por Hirano y Arie (2006), empleando la misma concentración de reactivos y programa de PCR de la primera reacción. Las condiciones de amplificación fueron las mismas que se emplearon en la primera reacción de PCR.
Resultados y discusión
De los veintisiete aislamientos colectados, solo cinco produjeron colonias en medio de cultivo PDA con micelio y conidios con características morfológicas propias de Fusarium oxysporum (Summerell et al., 2003) lo que además de la sintomatología observada en plantas adultas en el campo, permitió que fueran identificados como Fol. Éstos cinco aislados (Cuadro 1) fueron identificados con el nombre del predio del cual procedían, produjeron severos síntomas de la marchitez por Fusarium (amarillamiento foliar, marchitamiento parcial o total, coloración amarillenta o café de los haces vasculares, coloración café en la raíz) en las variedades Bonny Best y Manapal, indicando su completa susceptibilidad.
Considerando que Bonny Best es susceptible a las tres razas de Fol y Manapal es resistente a la raza 1, estos aislamientos deben ser diferentes a la raza 1. Walter mostró completa susceptibilidad a tres de los cinco aislamientos y resistencia a dos, indicando que estos dos aislamientos pueden identificarse como Fol raza 2, ya que la variedad Walter es resistente a las razas 1 y 2 y susceptible a la raza 3. Algunas plantas de la variedad I3R3 considerada como resistente a la raza 3, mostraron algunos signos de susceptibilidad, lo cual fue atribuido por Reis et al. (2004) a una posible variabilidad genética en la raza 3 o una posible impureza genética en el cultivar BHRS-2,3 utilizado como resistente a esta raza 3. Un segundo y tercer experimento con los mismos cultivares diferenciales mostraron de nuevo algunas plantas de la variedad diferencial I3R3 susceptibles a la raza 3.
Es importante continuar monitoreando la variabilidad genética para virulencia en Fol en lo que respecta a la raza 3. Hernández (2012) evaluó la respuesta a la raza 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici de ocho de los principales cultivares comerciales cultivados en Culiacán, Sinaloa, México resultando todos ellos susceptibles a esta raza. Esta situación aunada a la aparición de una nueva raza de este patógeno puede constituir una enfermedad económicamente muy importante para los productores de tomate. Este estudio indicó la presencia de solo las razas 2 y 3 en los predios analizados en San Luis Potosí. Ortega (2010) y Sánchez-Peña et al. (2010) reportaron también la presencia de las razas 2 y 3 de Fol en el estado de Morelos y Sinaloa respectivamente.
Es probable que estas razas del hongo hayan sido introducidas a las áreas tomateras de México mediante semilla contaminada, ya que actualmente las semillas de las variedades cultivadas en México son de importación. Existe también la posibilidad de que la raza 3 de este hongo se haya originado a través de un cambio genético en las poblaciones locales nativas de California de Fol como lo señala Cai et al. (2003). Sin embargo, las tres razas de este hongo se han descrito en México en áreas productoras de tomate distantes y separadas unas de otras (Valenzuela et al., 1996; Carrillo et al., 2003; Ascencio-Álvarez et al., 2008), las reportan en lotes comerciales de tomate en Culiacán, Sinaloa, en Baja California Sur (Holguín, 2005) y en Morelos (Ortega, 2010), por lo que es probable que el origen de estas razas en México haya sido mediante introducción de semilla contaminada.
Las razas identificadas fueron raza 2 en variedades de Rafaello y Tipsey en los predios Agro Viva y rancho el Clérigo, y la raza 3 en las variedades El Cid, Aníbal y 77-05 en los predios San Gilberto, Santa María Elena y Lourdes. Éstos resultados sugieren una incidencia de 40% de Fol raza 2 y 60% de la raza 3. En todos los casos se reaisló el hongo para comprobar la presencia del patógeno y la misma raza. Cai et al. (2003) hicieron las mismas pruebas y al determinar las razas, los cultivares susceptibles mostraron síntomas de amarillamiento severo y marchitez, mientras que los cultivares resistentes no presentaron ningún síntoma, coincidiendo con estos mismos resultados.
Estos mismos resultados se obtuvieron mediante la técnica de PCR de acuerdo a Hirano y Arie (2006) para la identificación de las diferentes razas de Fol, Cuadro 2. Los aislados 3 y 4 presentaron un patrón que corresponde al de la raza 2 reportado por Hirano y Arie (2006) en donde los pares de primers uni y sp23 amplificaron (Cuadro 2). La amplificación con el par de primers uni en los aislados 1, 2 y 5 indican que el aislado corresponde a Fol o Forl de acuerdo a Hirano y Arie (2006). La ausencia de amplificación en el PCR anidado con el par de primers sprl indica que no se trata de Forl de acuerdo al patrón reportado en Hirano y Arie (2006). El patrón reportado para aislados japoneses de Fol raza 3 por Hirano y Arie (2006) es la amplificación con los pares de primers uni, sp13 y sp23.
]]> Con aislados provenientes de los estados de Morelos (Domínguez, 2012), Sinaloa y Nayarit, se ha encontrado un patrón en el cual se obtiene una amplificación única con el par de primers uni con aislados de Fol de la raza 3 identificados de acuerdo a variedades diferenciales de tomate, incluyendo los tres aislados evaluados en este trabajo (1, 2 y 4). Este patrón aún no ha sido validado molecularmente, pero es posible postular que los aislados mexicanos difieren en las secuencias de los genes de la endo- (pg1) y exo-poligalacturonasas (pgx4). Esta validación molecular requiere hacerse en el futuro secuenciando estos genes a partir de un mayor número de aislados mexicanos, o bien, utilizar nuevos sets de primers como los reportados más recientemente por Lievens et al. (2009) diseñados para amplificar los genes para las proteínas secretadas en xilema (Six).En este trabajo se analizaron aislados de Fol a partir de diferente ubicación geográfica e incluyeron únicamente un aislado mexicano de Fol raza 1, por lo que si se emplean éstos primers también deberán ser validados con aislados de las diferentes razas de Fol provenientes de nuestro país. Otra posibilidad es que la raza de Fol que nos da el patrón con el par de primers uni aún no esté descrita en otros países. Para confirmar esta posibilidad, se requerirá realizar en el futuro, estudios filogenéticos empleando la secuenciación de diferentes regiones del genoma de Fol para la identificación inequívoca de los aislados de Fol provenientes de México.
Conclusiones
La marchitez vascular del tomate en los predios tomateros y variedades muestreadas en la región de Villa de Arista, San Luis Potosí, es causada por Fol razas 2 y 3. Por lo tanto es necesario utilizar cultivares adaptados a la región con resistencia a las razas 2 y 3. Tanto las pruebas de patogenicidad mediante variedades diferenciales como la técnica de biologia molecular de PCR anidado diferencial coincidieron en determinar sólo dos razas en las mismas variedades y en los mismos predios tomateros.
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