Respuesta de Physalis peruviana L. A la inoculación con bacterias solubilizadoras de fosfato*

Physalis peruviana L. response to inoculation with phosphorus solubilizing bacteria

Diana Beatriz Sánchez López^1§, Felipe Andrés Romero Perdomo¹ y Ruth Rebeca Bonilla Buitrago¹

¹ Laboratorio de Microbiología de Suelos-Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA). Km 14 vía Mosquera-Cundinamarca-Colombia. Tel: (057)4227300. Ext: 1401, (fromerop@corpoica.org.co; rbonilla@corpoica.org.co). ^§Autor para correspondencia: dbsanchez@corpoica.org.co.

* Recibido: enero de 2014
Aceptado: abril de 2014

Resumen

La implementación de bacterias solubilizadoras de fosfato (BSF) como inoculantes biológicos se ha convertido en una alternativa promisoria para proveer la necesidad nutricional fosfórica en suelos tropicales, disminuyendo el uso de fertilizantes químicos. Nuestro objetivo fue evaluar 12 cepas solubilizadoras de fosfato (P0₄), aisladas de la rizósfera de Physalis peruviana L., sobre la promoción de crecimiento de éste cultivo. Pseudomonas sp. UVAG42, Bacillus sp. UVAG45, UVLO26 y UVLO22 fueron las cepas que generaron mayor promoción de crecimiento bajo condiciones de invernadero empleando 50% de fosfato tricálcico (FT) respecto a un testigo absoluto y 100% de FT. A estas cuatro cepas se les evaluó la capacidad de solubilización de P0₄, con diferentes fuentes de carbono asociadas a exudados radiculares, y la producción de índoles. Los resultados demostraron que las cuatro cepas presentan la capacidad para solubilizar PO₄, donde los mejores resultados (p <0.05)se obtuvieron en presencia de ácido málico, y producir índoles. El análisis de correlación entre todas las variables medidas mostró que no existe una asociación entre éstas (p >0,05), evidenciando que posiblemente la promoción de crecimiento presentada se debió a una integración de diversas capacidades definidas para una bacteria promotora de crecimiento vegetal (BPCV). Nuestros hallazgos muestran que el proceso de solubilización de fósforo basado en el uso de fuentes de baja solubilización como FT, acompañado por BSF puede ser una alternativa viable para el cultivo de Physalis peruviana L. , reduciendo los costos económicos, ecológicos y sociales de éste cultivo de gran importancia económica para el país, como producto de exportación.

Palabras claves: BPCV, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Physalis peruviana L., biofertilizante.

Abstract

The implementation of solubilizing bacteria (BSF) as biological inoculants has become a promising alternative to provide phosphate nutritional need in tropical soils, reducing the use of chemical fertilizers. The objective was to evaluate 12 phosphate solubilizing strains (P0₄), isolated from the rhizosphere of Physalis peruviana L. on promoting growth of this crop. Pseudomonas sp. UVAG42, Bacillus sp. UVAG45, UVLO26 and UVLO22 were the strains producing more growth promotion under greenhouse conditions using 50% tricalcium phosphate (FT) with respect to an absolute control and 100% FT. These four strains were evaluated solubilization capacity of P0₄, with different carbon sources associated with root exudates, and production of kinds. The results showed that all four strains have the ability to solubilize PO₄, where best results (p< 0.05) were obtained in the presence of malic acid, and producing indoles. Correlation analysis between all variables showed an association between them (p> 0.05) does not exist, demonstrating that possibly promoting growth was brought to a defined integration of various capacities for plant growth promoting bacteria (PGPR). Our findings show that phosphorus solubilization process based on the use of sources of low solubilization as FT, accompanied by BSF may be a viable farming alternative Physalis peruviana L., reducing the economic, ecological and social costs of this crop of great economic importance to the country as an export product.

Las bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) son usualmente definidas como microorganismos que pueden crecer en o alrededor de tejidos de plantas, estimulando el crecimiento de éstas mediante varios mecanismos (Compant et al., 2005). Dentro de los diferentes mecanismos se encuentran la fijación biológica de nitrógeno, solubilización y mineralización de fosfato, y síntesis de hormonas vegetales como índoles y giberelinas (Graham et al., 2000). Ante la estimulación demostrada por BPCV en el desarrollo de diferentes cultivos, como Zea mays L., Lactuca sativa y Solanum lycopersicum L. (Yazdani et al., 2009), su utilización se ha convertido en una alternativa para disminuir el uso de fertilizantes químicos y aliviar diversos estreses de la planta, causado por la falta o el exceso de disponibilidad de algún nutriente en el suelo (Fu et al., 2010).

El fósforo (P), después del nitrógeno, es el segundo macronutriente más limitante para el crecimiento de las plantas (Yadav et al., 1997). Para solucionar de manera sostenible ésta deficiencia, se ha planteado el uso de bacterias solubilizadoras de fosfatos (BSF) como inoculantes para el aumento de la disponibilidad y absorción de P por cultivos de interés económico (Kumar et al., 2001). Dentro de los cultivos que han adquirido importancia recientemente en nuestro país, se encuentra la Physalis peruviana L.; esta es una especie frutícola andina relevante por su potencial para la exportación como fruta fresca, generando divisas por varios millones de dólares al año (Zapata et al., 2002); sin embargo, pocos estudios se conocen respecto al uso de BSF sobre la eficiencia en la fertilización fosfórica en dicha especie frutícola. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar microorganismos con potencial de promoción de crecimiento vegetal a partir de cepas aisladas de Physalis peruviana L. sobre el crecimiento y desarrollo de esta especie.

Se emplearon 12 cepas presuntivas de Pseudomonas sp. y Bacillus sp.: UVLO18, UVLO22, UVLO25, UVLO26, UVLO27, UVAG37, UVAG38, UVAG41, UVAG42, UVAG45, UVAAG57 y UVAAG63. Estas fueron aisladas de la rizósfera de cultivos de Physalis peruvianaL. en los municipios de Ventaquemada y Arcabuco, Boyacá, Colombia (5°32'N 73°22' W). Se utilizó para su crecimiento el medio King B (Merck, USA), su incubación fue a 28±2°C y 150 rpm.

Inicialmente se evaluó la promoción de crecimiento vegetal de estas 12 cepas sobre semillas desinfectadas de Physalis Peruviana L., bajo condiciones de invernadero, utilizando como fertilización fosfórica una fuente insoluble de fósforo como el Fosfato tricálcico (FT). Para ello se empleó un diseño experimental completamente al azar con cinco replicas por tratamiento. Se implementaron 15 tratamientos: T1-testigo absoluto, T2-testigo químico (100% FT), T3-testigo químico (50% FT), T4-UVLO18 + 50% (FT), T5-UVLO22 + 50% (FT), T6-UVLO25 + 50% (FT), T7-UVLO26 + 50% (FT), T8-UVLO27 + 50% (FT), T9-UVAG37 + 50% (FT), T10-UVAG38 + 50% (FT), T11-UVAG41 + 50% (FT), T12-UVAG42 + 50% (FT), T13-UVAG45 + 50% (FT), T14-UVAAG57 + 50% (FT), T15-UVAG63 + 50% (FT). En cada tratamiento se inoculó 5 ml de suspensión bacteriana a una concentración celular de 1X10⁸ UFC/ml en medio LB (g/L: 10 Triptona, 5 Extracto de levadura, 5 NaCl, pH: 7,0 ± 5). Las variables de respuesta evaluadas fueron: Longitud de la parte área (cm), longitud radical (cm), peso seco de la parte aérea (g), peso seco de la raíz (g), peso fresco de la parte área (g), peso fresco de raíz (g), aérea foliar (cm²). Se realizó un muestreo destructivo al mes de establecido el ensayo. Las cuatro cepas que reportaron los mejores resultados, durante el experimento en invernadero, se identificaron a nivel molecular mediante el estudio del 16S rDNA usando el Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Alemania) y el Kit PCR Super Mix (Invitrogen, Brasil). Los productos de PCR fueron secuenciados por la empresa MACROGEN. Mediante la herramienta bioinformática Geneious 4.8 y la base de datos GenBank del NCBI, se extrajeron mediante BLAST las secuencias cercanamente relacionadas con un 98% de identidad y un 100% de cobertura.

Luego, se determinaron características de promoción de crecimiento vegetal, como solubilización de fosfato tricalcico y producción de índoles, a las cuatro cepas.La determinación cuantitativa de solubilización de fosfato tricálcico, se llevó a cabo por la técnica de azul de fosfomolibdeno (Fiske y Subbarow, 1925), evaluando cinco fuentes de carbono (1M): glucosa, sacarosa, manitol, ácido málico, y ácido glutámico a 30±2 °C y 150 rpm durante cinco días.Mientras que la determinación de índoles totales se realizó mediante el ensayo colorimétrico basado en el reactivo Salkowsky (12 g/L FeCl₃ en 7.9 M H₂SO₄) (Glickmann y Dessaux, 1995), a 540 nm, empleando el medio K-lactato suplementado con triptófano a 100 mg/L (Carreno-López et al., 2000).

Por último, se utilizó (1) un análisis de componentes principales (ACP), para analizar los datos bajo condiciones de invernadero, (2) un análisis de varianza (ANOVA) y una prueba de Tukey, para los datos bajo condiciones de laboratorio, (3) y un análisis de correlación simple, para las asociaciones entre todas las variables. Todas las pruebas tuvieron un 95% como límite de confianza.

Con base en los resultados obtenidos a partir del ACP, donde F1 fue relacionada con el tamaño de la planta y F2 con captación de nutrientes, se concluyó que las plantas inoculadas con las cepas UVAG42, UVAG45, UVLO26 y UVLO22 fueron las que más favorecieron el crecimiento de las plantas. De éstas cuatro, la cepa UVAG42 mostró los mejores resultados (Figura 1). Así mismo, fue posible evidenciar que la dosis de fertilizante fosfórico empleada tuvo un efecto importante sobre el desarrollo de la planta, donde se observó que a medida que la dosis aumentó, el tratamiento se encontró más hacia la derecha de F1 en el plano de componentes principales. Los tratamientos inoculados con las bacterias UVAG42, UVAG45, UVLO26 y UVLO22 + 50% (FT) presentaron el mismo valor en F1 que el testigo + 100% (FT). Con base en el ACP se puede inferir que el efecto positivo de los microorganismos se pudo deber a un aumento en la disponibilidad de fósforo en suelo, lo que corrobora el hecho de que inoculación + 50% de fósforo igualara al testigo con fertilización fosfórica completa.

Para la identificación molecular de las cepas UVAG45, UVLO26 y UVLO22, y de UVAG42, la secuencia parcial de 16S rDNA mostró 98% y 99% de identidad con el género Bacillus sp. y Pseudomonas sp. respectivamente. Los bacterias pertenecientes a éstos géneros han sido ampliamente reportadas por llevar a cabo procesos de solubilización y mineralización de fosfato, y síntesis de hormonas vegetales como índoles, las cuales son capacidades definidas para una BPCV (Sánchez et al., 2012).

Respecto a la capacidad de solubilización de fósforo de las cepas, los resultados permitieron visualizar un posible rol de todas las cepas en dicho proceso. Como la rizósfera es un ambiente rico en nutrientes (azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, etc.), probablemente diferentes fuentes de carbono asociadas a los exudados radiculares podrían tener un efecto significativo sobre la solubilización de fósforo que sucede en la rizósfera (Liebersbach, 2004). Cinco fuentes adicionales de carbono fueron evaluadas, debido al importante papel que juega en la atracción de los microorganismos a la rizósfera (Walker et al., 2003; Khorassani et al., 2011). Los resultados observados en el Cuadro 1, pueden inferir que la solubilización de fósforo por las bacterias en estudio posiblemente fue influenciada por la fuente de carbono presente. Adicionalmente, las cuatro cepas evaluadas respondieron de manera similar con las diferentes fuentes de carbono utilizadas en el presente estudio; la que estimuló en mayor cantidad la solubilización de fósforo fue el ácido málico, seguido por manitol, sacarosa, glucosa, y ácido glutámico. Es importante resaltar que el ácido málico ha sido ampliamente reportado como uno de los compuestos que mayor atracción microbiana genera en la rizósfera de diversos cultivos, inclusive a concentraciones mínimas de 4 mM (Law y Aitken, 2005; Bais et al., 2006). Este resultado sugiere que la solubilización de fósforo en la rizósfera puede ser afectada por muchos factores ambientales, particularmente la composición de los exudados de la planta.

Estudios adicionales mostraron que las cepas fueron capaces de producir compuestos tipo indol (Cuadro 2), alcanzando una producción máxima de 6,21 ugIAA/ml por parte de Bacillus sp. UVLO22.Una correlación entre los datos del experimento de laboratorio y las variables morfométricas de la planta podría indudablemente demostrar el rol de los caracteres definidos para una BPCV. Sin embargo, el análisis de correlación mostró que no existe relación entre estas variables.

Por lo tanto, se demostró que la inoculación con la cepa Pseudomonas sp. UVAG42 permitió reducir en un 50% la dosis de fertilización fosfórica Physalis peruviana L. Además, de manera preliminar se concluye que la promoción de crecimiento vegetal de Physalis peruviana L. con las cepas en estudio se produjo no solo por la solubilización de fósforo y la producción de auxinas, sino posiblemente por la integración de diversas capacidades definidas para una BPCV. Sin embargo, se necesita una amplia investigación para elucidar cómo las bacterias intervienen sobre el crecimiento de Physalis peruviana L. El uso selectivo de bacterias promotoras de crecimiento vegetal podría ser una alternativa viable y sostenible para disminuir los costos ecológicos, económicos y sociales por el rubro de fertilización fosfórica para este cultivo.

Agradecimientos

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural Colombiano - Laboratorio de Microbiología de Suelos CORPOICA.

Literatura citada

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