Efecto de dos extractos botánicos en el desarrollo y contenido de polifenoles de ají (Capsicum annuum L.)*

Effect of two botanical extracts in the development and content of polyphenol in chili pepper (Capsicum annuum L.)

Ricardo Tighe Neira^1y5§, René Montalba Navarro², Gina Leonelli Cantergiani³ y Aliro Contreras Novoa⁴

¹ Universidad Católica de Temuco, Casilla 15-D, Temuco, Chile. Fono (56)-9-45-553901.

² Instituto del Medio Ambiente, y Departamento de Ciencias Agronómicas y Recursos Naturales, Universidad de la Frontera. Casilla 54-D, Temuco, Chile. Tel. (56)-9-45-325555. (mrene@ufro.cl).

⁴ Departamento de Ciencias Agronómicas y Recursos Naturales, Universidad de la Frontera. Casilla 54-D, Temuco, Chile. Tel. (56)-9-45-325631. (aliroc@ufro.cl).

⁵ Programa de Magister en Gestión y Manejo Agropecuario, especialidad agroecología y sistemas de producción orgánica, Departamento de Ciencias Agronómicas y Recursos Naturales, Universidad de la Frontera. Casilla 54-D, Temuco, Chile. §Autor para correspondencia: rtighe@uct.cl.

* Recibido: marzo de 2013
Aceptado: octubre de 2013

Resumen

La presencia de fitoquímicos de distinta naturaleza presente en extractos botánicos que impactan en la generación de metabolitos primarios y secundarios (principalmente polifenoles) en los cultivos en que son aplicados, se ha considerado un elemento relevante vinculado a los efectos benéficos de su aplicación foliar. Se evaluó el efecto del extracto acuoso de ortiga (Urtica dioica L.) y Ulex europaeus L., sobre parámetros de desarrollo en aji (Capsicum annuum L. var Longum cv. "Cacho de cabra"), así como en el contenido de polifenoles en hoja y fruto, como atributo funcional. El ensayo se estableció en condiciones de invernadero en la Región de La Araucanía, Chile. Los extractos se aplicaron en dosis inversas de N:P con relación 1:3.7 entre los extractos, a cada planta distribuída completamente al azar. El porcentaje de materia seca (MS%) presentó diferencias significativas a las aplicaciones de U. europaeus y U. dioica. En fructificación, U. dioica dosis 2 presentó MS% en fruto inmaduro estadísticamente igual que el testigo e inferior que los demás tratamientos. La concentración de polifenoles en hojas y frutos tendió a ser mayor en los extractos botánicos y significativamente menor en el testigo (p> 0.05) en la medición final del ciclo productivo. En frutos U. europaeus presentó valores mayores (p≤ 0.05) que los demás tratamientos incluído el testigo. Estos resultados permiten inferir la presencia de compuestos activadores del metabolismo primario y secundario en los extractos botánicos.

Palabras clave: Ulex europaeus L., Urtica dioica L., bioestimulación, metabolismo secundario.

Abstract

The presence of different types of phytochemicals present in botanical extracts that affect the generation of primary and secondary metabolites (mainly polyphenols) in the cultures in which they are applied, has been considered an important element linked to the beneficial effects of foliar application. The effect of aqueous extract of nettle (Urtica dioica L.) and Ulex europaeus L., on development parameters of chili peppers (Capsicum annuum var longum L. cv. "Cacho de cabra") as well as on the content of polyphenols in leaf and fruit, such as functional attribute. The trial was conducted under greenhouse conditions in the Araucanía Region, Chile. Extracts were applied in inverse dose N: P ratio 1:3.7 between the passages, each plant completely randomly distributed. The percentage of dry matter (DM %) showed significant differences in the applications of U. europaeus and U. dioica. In fruiting, U. dioica MS % dose 2 had statistically similar in immature fruit than the control and lower than the other treatments. The concentration of polyphenols in leaves and fruits tended to be higher in botanical extracts and significantly lower in the control (p> 0.05) in the final measurement of the production cycle. In fruits U. europaeus presented higher (p≤ 0.05) than the other treatments including the control. These results allow inferring the presence of activator compounds primary and secondary metabolism in plant extracts.

Key words: Ulex europaeus L., Urtica dioica L., biostimulation, secondary metabolism.

Introducción

Las aplicaciones foliares de extractos botánicos son utilizadas como complemento nutricional de los cultivos, mencionándose que favorecerían su desarrollo, así como también producirían mejoras en el rendimiento y calidad del producto (Fregoni, 1986). No obstante, sus beneficios no se reducirían al aporte nutricional, sino que más bien a efectos positivos y negativos como bioestimulación y fitotoxicidad provocado por metabolitos secundarios, grupos fitohormonales u otros compuestos que estarían formando parte de estos extractos botánicos (Teaca et al, 2008).

En cultivos tradicionales, los metabolitos primarios como aminoácidos, nucleótidos, azúcares y lípidos (Ávalos y Pérez-Urria, 2009) son maximizados debido a la optimización de las prácticas convencionales de cultivo (Mitchell y Chassy, 2009). Por otra parte, los metabolitos secundarios corresponden a compuestos de diversos grupos químicos como fenilpropanoides, flavonoides, alcaloides y terpenos, sin función definida en procesos metabólicos como fotosíntesis y respiración celular (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Son originados en pequeñas cantidades y de forma restringida dentro de la planta y asociada a algunos géneros, familias o incluso a sólo algunas especies (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Dentro de las funciones asociadas a estos compuestos se mencionan la defensa ante la presencia de elementos bióticos y abióticos, motivo por el cual se ha observado que los niveles de estrés se relacionarían con la producción de estos compuestos (Sepúlveda et al, 2003). Del mismo modo, dada su importancia para la salud humana algunos de ellos son catalogados como "funcionales" (Zhao et al, 2007).

Dentro de los extractos botánicos se encuentran los de ortiga (Urtica dioica L.), siendo uno de los más utilizados como bioestimulante y fertilizante foliar. Estas funciones se asocian a su alto contenido de flavonoides, ácidos fenólicos, ésteres, terpenoides, (Grevsen et al., 2008; Lapinskaya, y Kopyt'Ko, 2008), saponinas, entre otros (Oleszek et al., 1999), y de nutrientes como Nitrógeno, en contenido variable en relación a su disponibilidad en el suelo, dado que ha sido descrita como una especie nitrofílica (Taylort, 2009).

Por otra parte, existen reportes de extractos foliares acuosos de leguminosas tales como Vigna unguiculata L. Walp. cv. Iron Clay y Mucuna deeringiana (Bort) Merr., sobre Capsicum annuum L., con efecto positivo en altura y MS (Adler y Chase, 2007), por lo cual resulta plausible considerar que mediante el uso de algunos extractos vegetales se pueda incrementar el crecimiento de los cultivos y su calidad nutricional para el ser humano.

Las concentraciones de los elementos y compuestos mencionados, permiten pensar en un extracto acuoso que aplicado sobre otras especies vegetales herbáceas en estado vegetativo y productivo genere efectos en su crecimiento y/o desarrollo, además de la activación del metabolismo secundario, producto de la presencia de alcaloides, es el caso del incremento en el contenido de polifenoles en respuesta a cafeína (Batish et al., 2008). Esto se debe, a que los fertilizantes foliares son absorbidos a través de la cutícula o los estomas de la hoja debido a la composición de la superficie de ésta, que permite la absorción de nutrientes (Hossain y Ryu, 2009), y que posteriormente, moviliza vía transporte apoplasto o simplasto hacia los tejidos vasculares y luego al floema, o son transportados activamente a través de la membrana plasmática de las células de la hoja donde luego estos compuestos orgánicos son incorporados y transportados fácilmente en toda la planta (Haynes y Goh, 1977), incidiendo en el crecimiento y desarrollo de las plantas, relacionado probablemente a grupos fito-hormonales endógenos que actúan como retardantes del crecimiento, inductores de floración, promotores de madurez y de la producción de biomasa, entre otros (Chaterjee et al, 2005; Bachman y Metzger, 2008; Mohamed et al, 2013); y por otra parte, al mejorar la nutrición mineral en tejidos de la planta crean un equilibrio nutricional que permite soportar las condiciones de estrés abiótico, como por ejemplo a la salinidad, sequía, estrés hídrico, entre otros, al compensar los nutrientes deficientes en los tejidos de la planta, alterando las vías de fijación de nitrógeno y carbono.

(El-Fouly et al., 2002; Shaaban et al, 2004; Hussein et al, 2008; Bellaloui et al, 2013), regulando la función de los estomas, osmoregulación, balance catiónico-aniónico y síntesis de proteínas (Hawkesford et al, 2012), manteniendo la presión de turgencia (Mengel yArneke, 1982) y mejorando la conductancia estomática, tasa de transpiración y fotosíntesis neta (Zareian et al, 2013), así como también a lo manifestado en la inhibición de la germinación y el crecimiento de plantas expuestas a extractos etanólicos de Melissa officianalis, Lavandula angustifolia y Achillea millefollium, efectos que son atribuibles a aleloquimícos como alcaloides y otros compuestos metabólicamente activos y tóxicos presentes en la solución.

Lo anterior puede resultar menos atractivo en la producción pero el valor nutritivo por unidad de producto puede ser superior (Mitchell y Chassy, 2009), debido a que en la planta tratada se generan como respuesta compuestos derivados del metabolismo secundario del tipo fenólico con carácter antioxidante, benéficos a la salud humana, siendo los más abundantes biosintetizados por el reino vegetal (Wood et al, 2002; Sepúlveda et al, 2003).Al respecto, se ha comprobado que la cafeína es un alcaloide que provoca estrés abiótico en las plantas incrementado significativamente el contenido de polifenoles endógenos en Phaseolus aureus Roxb de 26 μg mL^-1 a 45 μg mL^-1 con la adición de 2000 μM del alcaloide (Batish et al, 2008).

Dado los antecedentes presentados y, considerando especialmente la composición nutricional y niveles de metabolitos tóxicos en las especies U. europaeus y U. dioica, resulta de interés evaluar el efecto de extractos acuosos sobre parámetros de desarrollo y concentración de polifenoles totales en ají (C. annuum), dado que es posible presenten efecto diferencial en variables productivas y de activación del metabolismo secundario, manifestado en el aumento de la concentración endógena de polifenoles totales, de los cuales existen antecedentes en C. annuum.

Materiales y métodos

Sitio y condiciones de experimentación

El ensayo se realizó en la estación experimental Pillanlelbún de la Universidad Católica de Temuco, coordenadas 38° 39' 17.2" latitud sur, 72° 26' 56" longitud oeste. Se utilizó un invernadero de 180 m², metálico con cubierta de polietileno y sistema riego por goteo; se aplicó fertilización orgánica en base a humus de lombriz (Eisenia foetida).

Material vegetal

Las especies U. europaeus y U. dioica fueron utilizadas como fuente de extractos acuosos totales. La primera de ellas se obtuvo de la estación experimental Pillanlelbún de la Universidad Católica de Temuco, en estado de fructificación; y la segunda del predio experimental Maquehue de la Universidad de La Frontera, en estado de floración.

Preparación y estandarización de los extractos

Los extractos vegetales se prepararon. a) en base de tallos jóvenes de U. europaeus de entre 15 cm y 60 cm de longitud, sin flores y con espinas; y b) en base a brotes y hojas de U. dioica en estado de floración. Para la obtención de los extractos acuosos totales se procedió a triturar el material vegetal con un mortero de cerámica y una picadora eléctrica de uso doméstico marca Oster, posteriormente se llevo a una solución en proporción 1:10 de material fresco triturado y agua destilada respectivamente, y almacenaron en oscuridad a 4 °C ±1 °C por 7 días (Pacheco et al, 2004). Posteriormente, se filtró con una bomba de vacío (Welch 1399 Duoseal Vacuum Pump) y papel filtro Whatman N°2. Se determinó el contenido de N y P₂O₅ de los extractos utilizando el método Kjeldahl y Nitro-vanado-molibdato, respectivamente (Cuadro 1).

Los tratamientos (Cuadro 2) estuvieron constituidos por dos dosis de cada extracto, una equiparada en función a la dosis de aplicación de N (d1) y la otra (d2) equiparada en función a la concentración de P₂O₅, resultando una relación inversa de N:P de 1:3.7 entre los extractos. Adicionalmente, fue incluido un testigo constituido por agua destilada. Los cuatro tratamientos y el testigo, se distribuyeron completamente al azar dentro del invernadero. La unidad experimental y observacional estuvo constituida por grupos de 10 plantas de C. annuum en 10 repeticiones.

Evaluación de parámetros de productividad

Los extractos se asperjaron desde inicios de floración en volumen indicado en el Cuadro 2, fraccionados en tres aplicaciones separadas por 10 días una de otra. Su efecto se determinó en los periodos de inicios de floración (a) y productivo (fruto maduro) (b) así las variables fueron para (a) materia seca total (MS g), porcentaje de materia seca total (MS%), concentración de polifenoles totales en hojas y tasa de crecimiento relativo (TRC) (Ecuación 1) que expresa el crecimiento en MS a partir de un gramo de MS de la planta en un intervalo de tiempo, con relación a un tiempo inicial (Jarma et al, 2006), y para (b) materia seca de fruto maduro (MSfm g), porcentaje de materia seca de fruto maduro (MSfm%), materia seca fruto inmaduro (MSfi g) porcentaje de materia seca de fruto inmaduro (MSfi%).

TRC = (ln Wf - ln Wi)/(Tf - Ti) (1)

Las determinaciones de MS se realizaron por medio de muestras destructivas en estufa de secado (Binder, Klase 2.0) con aire forzado a 60° C por 48 h en cinco oportunidades, 10 días posteriores a cada aplicación. En estado productivo se midió en frutos maduros e inmaduros, como resultado de la suma de la cosecha escalonada realizada cada 7 días.

Evaluación del contenido de polifenoles en hoja y fruto de C. annuum

La determinación de polifenoles en floración se realizó en hojas adultas de la medición final. En el período productivo se determinó en frutos maduros de la primera cosecha; en ambos casos se utilizó el método de Folin-Ciocalteau descrito por Georgé et al. (2005) que considera soluciones de acetona/ agua, carbonato de sodio y ácido gálico a una concentración de 7/3 v/v, 75 g L^-1 y 5 mg L^-1 a 30 mg L^-1, respectivamente. La absorbancia se midió a 760 nm en un espectrofotómetro UV visible, después de 15 minutos de haberse sometido a una temperatura de 50 °C, los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico (EAG) en 100 g BMS.

Diseño experimental y análisis estadístico

Las unidades experimentales se distribuyeron completamente al azar dentro del invernadero. Los datos resultantes fueron sometidos a un análisis de varianza (ANDEVA) y posteriormente las variables MS (g), MS (%) y TRC a la prueba de comparación múltiple de Tukey (p≤ 0.05). Los datos de MSfm (g), MSfm (%), MSfi (g), MSfi (%) y MSft (g), se sometieron a la prueba de Kruskal Wallis y posteriormente al test de DUNN (p≤0,05). La concentración de polifenoles totales en hojas y frutos se analizó por medio de unANDEVA y utilizó la prueba de Duncan y Thamane (p≤ 0.05), respectivamente. Todos los datos fueron analizados con el paquete estadístico JMP 5.0®.

Resultados y discusión

Las variables productivas (MS g y MS %), medidas en estado de floración, no presentaron diferencias significativas en las fechas evaluadas; sin embargo, en la cuarta evaluación el MS% obtenido con U. europaeus d2 fue significativamente mayor al de los demás tratamientos, excepto para U. dioica d2 (Figura 1).

En la Figura 1A los datos no se comportan de acuerdo a los esperado, especialmente en la fecha tres en que se observa una disminución de la concentración de la MS, lo que no se visualiza en la producción (MS g) en la misma fecha (Figura 1B). No obstante, en términos generales los resultados concuerdan con lo expuesto por Adler y Chase (2007), señalando que los extractos acuosos de leguminosas afectan positivamente la germinación, crecimiento y peso seco de las plantas, dentro de ellas las hortícolas. Aguilar et al. (2005), afirman que fertilizaciones realizadas en cultivo de C. annuun a base de N, P y K incrementan el rendimiento entre 56% y 69% (Kotur, 2008). Según Ciompi etal. (1996) el N incrementa el crecimiento y eficiencia fotosintética de las plantas, sin embargo, en U. europaeus d2 existe la menor concentración de N y P respecto a los demás tratamientos, dado que corresponde a la dosis de menor concentración de extracto (Cuadro 2).

Ésta respuesta es corroborada por Bajaj et al. (1979) quienes encontraron mayor respuesta en producción de biomasa con el nivel más bajo de N, lo que es confirmado por Asenjo et al. (2000); Haq y Mallarino (2000) afirmando que pequeñas cantidades de N, P y K aplicados en forma foliar aumentan significativamente el rendimiento de cultivos. La respuesta al extracto es posible se deba a su composición, dado que si bien ésta no fue determinada, la literatura indica la presencia de alcaloides y otros compuestos considerados metabolitos secundarios que causan estrés vegetal (Sepúlveda et al., 2003) , lo que posiblemente conduzca a la concentración de materia seca, y en algunos casos asociado a la disminución del rendimiento, haciendo menos atractiva la producción (Mitchell y Chassy, 2009).

La respuesta en la cuarta fecha (Figura 1) se explica por el estado fenológico del cultivo (inicios de fructificación) donde la concentración de MS se incrementa, presentando un crecimiento sigmoidal. Independiente de los extractos botánicos y dosis utilizadas, el peso seco aumentó paulatinamente con la edad del cultivo, para finalmente disminuir en la última medición, probablemente debido a la pérdida de masa foliar por senescencia (Azofeifa y Moreira, 2004) . Al respecto, Kläring (1999) encontró una respuesta similar al evaluar la acumulación de peso seco en plantas de pimentón (C. annuum var. Grossum), el que tiende a ser sigmoidal (Sedano et al, 2005).

Respecto de la producción de biomasa de fruto (Figura 2A) no existen diferencias significativas para el porcentaje de MSfm. Sin embargo, en la misma figura, en los tratamientos U. europaeus d1 y d2, y U. dioica d1, el porcentaje MSfi es significativamente superior a U. dioica d2 y el testigo. La producción de biomasa en gramos (Figura 2B) no presentó diferencias significativas para los tratamientos evaluados.

Los resultados presentados en el párrafo precedente no están asociados al nivel de nitrógeno ni fósforo de las dosis de cada tratamiento, puesto que U. europaeus d2 tiene los valores más bajos de los mismos y a la vez la mayor respuesta en MS%, su explicación puede estar asociada al origen de los productos, especialmente los extractos de la leguminosa U. europaeus, lo que es corroborado por Adler y Chase (2007) señalando que los extractos acuosos de especies de esta familia afectan positivamente el peso seco de las plantas. Por otra parte, la concentración de metabolitos causantes de estrés abiótico tales como alcaloides (Batish et al, 2008) es probablemente menor en U. dioica d2 e inexistente en el testigo.

La TRC presenta mayores valores en las mediciones uno y dos, aunque sin diferencias con el testigo, que en la medición tres en que sí se observan diferencias (Cuadro 3). Ortiz et al. (2005) señalan que la proporción de biomasa total generada en C. annuum es mayor al inicio del proceso de floración y menor durante el resto del ciclo de vida con tendencia a cero, debido a que la TRC va disminuyendo con la edad de la planta, lo que se debe al aumento gradual de tejido no asimilatorio, incrementando la proporción de la parte estructural con respecto a los tejidos metabólicamente activos, debido a la curva de crecimiento sigmoidal que caracteriza a los vegetales (Sedano et al., 2005).

La diferencia entre el testigo y U. europaeus d2 probablemente se deba a la menor concentración de sustancias causantes de estrés del extracto, dado que corresponde a la dosis más baja. Por otra parte, el testigo y la dosis de mayor concentración (U. europaeus d1) presentaron valores negativos, lo que se relaciona con el efecto nocivo de alcaloides, ácidos fenólicos y otros metabolitos (Reigosa y Pazos-Malvido, 2007), que en bajos niveles producen un efecto estimulador y en concentraciones elevadas pudieron eventualmente causar el efecto contrario (Máximo y Lourenco, 2000). Para el caso de U. dioica, la presencia ácidos fenólicos reportados por Grevsen et al. (2008); Lapinskaya y Kopyt'Ko (2008) y saponinas (Oleszek et al, 1999) pudieron haber causado la respuesta encontrada. Al respecto, Reigosa y Pazos-Malvido (2007) señalan que ácidos fenólicos y otros metabolitos secundarios tienen un efecto detrimental en el crecimiento vegetal.

En el Cuadro 4 se pueden observar diferencias estadísticamente significativas en la concentración de polifenoles en hoja y fruto en dos estados fenológicos de C. annuum. En floración el testigo presenta la mayor concentración de polifenoles en hoja, no así al finalizar el ciclo productivo en que los extractos presentan los mayores valores a excepción U. dioica d1. The concentrations reported in this study are higher than Respecto de la evaluación en frutos el efecto es más claro those reported by Lan et al. (2005) who obtained in oregano en favor de U. europaeus d2. (Origanum vulgare L.) and cinnamon (Cinnamomum verum)

Las diferencias estadísticas encontradas en hoja para floración y final del ciclo productivo estarían asociadas a las estrategias de defensa de la planta ante condiciones de estrés biótico y abiótico (Reyes et al, 2005), en este caso, dado probablemente por el alto nivel de alcaloides y lectinas (Máximo et al., 2006) de U. europaeus, y ácidos fenólicos (Grevsen et al., 2008; Lapinskaya, y Kopyt'Ko, 2008) y saponinas (Oleszek et al, 1999), entre otros presentes en U. dioica, induciendo la síntesis y acumulación moléculas de bajo peso molecular conocidos como metabolitos secundarios (Sepúlveda et al., 2003), así como también a la presencia cumarinas, quinonas y esteroides de los que se reporta efecto alelopático (Batish et al, 2008), que pueden contribuir a la generación de estrés en la especie tratada.

Las concentraciones reportadas en este estudio son superiores a las señaladas por Lan et al. (2005) quienes obtuvieron en orégano (Origanum vulgare L.) y canela (Cinnamomum verum) entre 540 mg EAG por 100 g¹ y 1.850mg EAG por 100 g^-1, respectivamente. Sin embargo, inferiores a los presentados por Pastore (2006) que reportó entre 8.000 mg EAG por 100 g^-1 y 12.000 mg EAG por 100 g^-1 en hojas de té verde.

En frutos el comportamiento fue similar al encontrado en hoja, con valores significativamente mayores (p< 0.05) en U. europaeus d2 con diferencias del orden de 36% respecto del testigo, lo que ha sido asociado al efecto estimulante del metabolismo secundario asociado a la presencia de alcaloides u otros compuestos (Batish et al, 2008), en C. annuum el efecto fue probado por Adler y Chase (2007). Existen resultados que asocian directamente la concentración de polifenoles a pigmentos y presencia de etileno (Park et al., 2006; Solomon et al, 2006).

Conclusiones

Los extractos acuosos de U. europaeus y U. dioica, en las dosis evaluadas, generan efectos en la concentración de la producción de biomasa y concentración de polifenoles, siendo la dosis d2 de U. europaeus la de mayor efecto, por lo tanto, es factible la utilización de estos extractos en el cultivo de C. annuum, al mejorar calidad funcional de éste.

Literatura citada

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