Hallazgos ultraestructurales en lesiones foliares asociadas a 'vena roja' en helecho hoja de cuero*

Ultrastructural findings in foliar lesions associated with 'red vein' in leather leaf fern

María del Milagro Granados-Montero^1§, Ethel Sánchez-Chacón², Maribel Vargas-Montero² y Cinthya Barboza-Aguilar²

¹ Universidad de Costa Rica- Centro de Investigación en Protección de Cultivos. Sede Central Rodrigo Facio. Escuela de Agronomía. San José, Costa Rica. Tel. 506 2511 4214. C. P. 12060. San José. §Autora para correspondencia: maria.granadosmontero@ucr.ac.cr.

² Universidad de Costa Rica-Centro de Investigación en Estructuras Microscópicas. Ciudad de la Investigación. San José, Costa Rica. (ethel.sanchez@ucr.ac.cr; cynthia.barboza@ucr.ac.cr; maribelle.vargas@ucr.ac.cr).

* Recibido: julio de 2013
Aceptado: octubre de 2013

Resumen

La vena roja del helecho hoja de cuero (Rumorah adiantiformis) se cataloga como una enfermedad de etiología desconocida, ya que no se conoce cuál es su agente o factor causal. Ésta alteración, al igual que el síndrome de Sterloff (SS), se ha venido presentando desde hace varios años en Costa Rica, lo que ha producido situaciones económicas desfavorables, reduciendo el área sembrada en 60% y provocando una disminución en los puestos de trabajo 70%. Se registra muy poca investigación a nivel mundial que caracterice ambas patologías, por lo que es imposible realizar una estrategia de manejo apropiada, lo que conlleva al aumento del costo económico, social y ambiental del cultivo. Con el fin de describir ultraestructuralmente los síntomas de la enfermedad, se colectó tejido foliar por un período de dos años (2007 y 2008) en Poás de Alajuela, Costa Rica, y se realizaron observaciones mediante microscopia electrónica de barrido y transmisión. Los tejidos con síntomas revelaron la presencia de cristales laminados en las células del mesófilo esponjoso y acumulaciones cristalinas amorfas en el parénquima del haz vascular, así como gran cantidad de cristales en las vacuolas del mesófilo esponjoso. Éstos cristales, aparentemente, están compuestos por oxalato de calcio, no se evidenció presencia de cristales en tejidos asintomáticos. Este artículo describe los hallazgos ultraestructurales en follaje con y sin síntomas de vena roja en plantas de helecho y menciona como una posibilidad de la causa condiciones de estrés por desbalances nutricionales.

Palabras clave: Rumorah adiantiformis, ultraestructura, cristales, microscopia electrónica.

Abstract

The red vein leather leaf fern (Rumorah adiantiformis) is classified as a disease of unknown etiology, and it is not known what his agent or causal factor. This alteration, like Sterloff syndrome (SS) has been presenting for several years in Costa Rica, which has produced unfavorable economic conditions, reducing the area planted in 60% and causing a decrease in jobs 70%. Very little is recorded worldwide research that characterizes both conditions, so it is impossible to make an appropriate management strategy, which leads to increased economic costs, social and environmental dimensions of culture. In order to describe ultrastructural symptoms of the disease, leaf tissue was collected for a period of two years (2007 and 2008) in Poas, Alajuela, Costa Rica, and observations were made by scanning electron microscopy and transmission. Tissues with symptoms revealed the presence of laminated glass in spongy mesophyll cells and amorphous crystalline accumulations in the parenchyma of the vascular bundle, as well as lots of crystals in the spongy mesophyll vacuoles. These crystals are apparently calcium oxalate compounds, no evidence of crystals in the presence of asymptomatic tissues. This article describes the ultrastructural findings foliage with and without symptoms of red vein fern plants and mentioned as a possible cause stress conditions nutritional imbalances.

Introducción

El helecho hoja de cuero (Rumorah adiantiformis (G. Forst.) Ching) durante más de 20 años ha generado divisas importantes para Costa Rica, debido a sus altos niveles de exportación. Para el 2010 generó US$52 millones; así, el sector helechero aportó alrededor de 80% de las exportaciones de follaje en el país (Rainforest Alliance, 2010; Chaves, 2010). De acuerdo con Torres-Tamayo (1998), este follaje tiene gran presencia en el mercado de ornamentales verdes como complemento de los ramos de flores por su mayor vida útil, color más llamativo y su fronda coriácea de larga duración.

Desde sus inicios, este cultivo ha permitido la creación de fuentes de trabajo con mano de obra mixta y con niveles de salario superiores a cualquiera de las otras actividades agrícolas. Según Gónzalez et al. (1998) y Gil (2003), hasta inicios de la década anterior se consideraba a nivel mundial que Costa Rica era el primer país productor de este follaje, superando a Estados Unidos de América quién inició con la actividad, ya que no producía los volúmenes de exportación como los registrados en Costa Rica.

Las principales razones por las que el helecho producido en Costa Rica desplazó al de Florida del mercado europeo, son la calidad, tomando en cuenta la apariencia fresca, la ausencia de manchas y daños mecánicos, así como, la consistencia en la producción (volumen similar a lo largo de todo el año), además, los productores de Florida han tenido serios problemas para mantener su nivel de productividad, debido a la aparición de nuevas enfermedades y catástrofes climáticas, como los huracanes (Berrocal, 1996; González et al, 1998).

En Costa Rica, la producción de helechos se ha visto disminuida. Berrocal (1996), indica que la aparición de problemas fitosanitarios se ha multiplicado hasta convertirse en una de las limitantes más grandes de este cultivo. Dentro de los patógenos identificados que afectan el helecho están los hongos Pythium sp., Thielaviopsis sp. y Rhizoctonia sp., los cuales atacan la parte subterránea de la planta; Alternaria sp., Cercospora sp., Colletotrichum sp., Cylindrocladium sp. y Ascochyta sp. que producen manchas foliares y la bacteria Pseudomonas sp. que produce una enfermedad conocida como vena amarilla. También, el nematodo Pratylenchus penetrans (Cobb) que aunque no produce daños importantes en la planta, causa decoloración de la fronda; además existen varias especies de Aphelenchoides que atacan la hoja produciendo manchas negras y Paratrichodorus acutus (Bird) (López y Vílchez, 1991).

Sin embargo, en Costa Rica los problemas fitosanitarios restrictivos para alcanzar la productividad demandada de rollos por hectárea son dos enfermedades de etiología desconocida, a saber, el Síndrome de Sterloff (SS), caracterizado por la deformación y maduración prematura de las frondas, así como estrías cloróticas en las pinnas; y la Vena Roja (VR), cuyos síntomas incluyen clorosis intervenal seguida de necrosis parda rojiza en el ápice de las hojas y la vena principal o secundarias (lo que da origen al nombre de la alteración), luego se presentan manchas o pecas rojizas sin patrón definido en la lámina foliar, las que muchas veces se inician de la punta de la pinna hacia el centro, por último marchitez y muerte prematura de la fronda. La incidencia y la severidad de los síntomas de VR se incrementan luego de períodos lluviosos y pueden llegar a alcanzar 50% de daño (Flores, 2010. Com. Per.).

Como se dijo antes, se registra muy poca información acerca de estas alteraciones. Este punto se hace notable, ya que, al no contar con un diagnóstico preciso y confiable, es imposible efectuar una estrategia de manejo apropiada. Hasta ahora los productores utilizan medidas de combate inadecuadas y por ende ineficaces. Desde su aparición han intentado diversas maneras de combate, sin éxito, lo que les provoca grandes pérdidas económicas.

De acuerdo a (Cerdas, 2010. Com. Per.) en los últimos 5 años muchas de las empresas dedicadas al cultivo han cesado funciones. Mientras algunos productores han invertido grandes sumas de dinero en programas de erradicación y resiembra, otros han decidido cambiar de cultivo; han eliminado lotes de helecho y renovando con aralia (Fatsia japonica (Thunb.) Decne & Planch.)), aunque reciben menos ingresos por la venta de este follaje, estos son constantes y con menor margen de pérdidas.

A nivel mundial, solamente existe el reporte de una enfermedad similar al síndrome de Sterloff, denominada síndrome de la distorsión del helecho, FDS por sus siglas en inglés, la cual de acuerdo a Kloepper (2007) y Kloepper etal. (2010) está presente en 60% de las fincas helecheras de Costa Rica y consiste en el torcimiento y distorsión de las frondas, algunas veces con estrías cloróticas y bronceadas. Esta enfermedad está asociada a la presencia de una bacteria endofítica a nivel de rizoma, la cual incrementa sus poblaciones luego de repetidas aplicaciones del fungicida sistémico benlate (Kloepper et al, 2012).

De acuerdo a (Kopler, 2010. Com. Per.) uno de los síntomas que pueden estar asociados al FDS es la vena roja, pero no se ha hallado evidencia de su relación con la presencia de la bacteria. Menciona además, que no se conoce el grado de asociación de ambos síntomas (FDS y VR), pero que son problemas complejos, en los que intervienen muchos factores e interacciones entre ellos.

Debido a la incertidumbre del origen de la enfermedad y de su epidemiología, se desarrolló esta investigación, como una primera etapa descriptiva, con la finalidad de proveer información útil para un posterior entendimiento de la causa, su desarrollo espacio-temporal y manejo.

Materiales y métodos

Las muestras se colectaron en una finca ubicada en Poasito de Alajuela con coordenadas 10° 10' 0" latitud norte 84° 12' 0" longitud oeste y con una altitud aproximada a los 1 200 msnm y con suelos del orden andisol. Se realizaron seis muestreos en dos años consecutivos (2007 - 2008). Cada muestra constó de 600 g de tejido foliar, él cuál se dividió para ser procesado para observación en microscopía electrónica, para análisis fitopatológico de hongos y bacterias, y para análisis de la concentración de nutrientes. Las observaciones microscópicas estuvieron focalizadas en la revisión de las venas principales de las frondas (con o sin síntomas).

Caracterización en campo

Se visitó 4 veces (2 en estación seca y 2 en estación lluviosa) el área de la finca que reiteradamente presentaba síntomas de la alteración, se determinó su distribución espacial y se colectó una gama de síntomas foliares asociados a la alteración. También, se visitaron áreas sin problemas y se tomaron muestras de frondas asintomáticas. Se trató de ordenar los síntomas de manera gradual de acuerdo a la cantidad de tejido afectado por fronda (severidad), con el fin de tener una idea de las etapas de desarrollo de la enfermedad. Las muestras fueron trasladadas al laboratorio donde se realizaron los procedimientos descritos más adelante. Para fines de este estudio, el material se dividió solamente en, "sano" si no presentaba ningún síntoma visible y en "vena roja" cuando las pinnas presentaban coloración rojiza en las venas principales o secundarias. No se tomó material con daños muy avanzados, ya que en estos casos es imposible determinar si sus características ultraestructurales se deben a la alteración en estudio o a procesos de senescencia Figura 1.

Microscopia electrónica de barrido y transmisión (MEB y MET)

Las muestras se procesaron tanto para ser observadas en microscopia electrónica de barrido como de transmisión. Las secciones de frondas procesadas para microscopia de barrido, fueron fijadas en solución de glutaraldehido 2.5% y paraformaldehido 2% en amortiguador de fosfato de sodio (0.1M pH 7.4), posteriormente se lavaron en amortiguador, se pos-fijaron con tetraóxido de osmio 2%, se lavaron con agua destilada y se colocaron en sacarosa 2M (como crioprotector), para congelarlas en nitrógeno líquido. Luego se procedió a seccionarlas y se descongelaron en sacarosa 2 M, se lavaron cinco veces con agua destilada y se deshidrataron en una gradiente ascendente de etanol (30% - 100%). Posteriormente se realizaron cuatro cambios con alcohol terbutílico y se secaron en un Sublimador marca Eiko ID-2, Japón. Una vez secas, las muestras se orientaron y montaron en bases de aluminio utilizando cinta adhesiva doble cara de carbón, se cubrieron con 30 nm de oro en un cobertor iónico marca Eiko-ID-2, Japón. Se observaron con el microscopio electrónico de barrido Hitachi, S-570 (Japón), a un voltaje de 15 Kv. Las micrografías se tomaron utilizando cámara digital modelo Pentax K 100 acoplada al microscopio electrónico.

Las muestras procesadas para microscopia electrónica de transmisión se fijaron y pos-fijaron de la misma forma que para microscopia de barrido, seguidamente se deshidrataron en el gradiente de etanol, se infiltraron con resina Spurr y se polimerizaron a 70 °C durante 72 h. Se realizaron cortes para microscopia de luz (0.35 um) y cortes ultrafinos (60-70 nm) utilizando un ultramicrótomo marca Reichert Ultracut, luego se contrastaron con acetato de uranilo al 4% en metanol y con hidróxido de plomo. Se prepararon aproximadamente 150 rejillas con cortes y fueron observadas a 100 Kv con microscopios electrónicos de transmisión marca Hitachi modelos H-7000 y H-7100. Las micrografías fueron tomadas utilizando placas fotográficas Fuji (Japón).

Análisis fitopatológico

A cada muestra se le realizó un análisis fitopatológico el cual consistió en hacer aislamientos en medios de crecimiento básicos y registrar cuáles hongos o bacterias se recuperaron; se utilizó la metodología propuesta por Agrios (2005). Una vez que se obtuvo el cultivo puro del microorganismo aislado, se procedió a realizar su identificación a nivel morfológico; en el caso de hongos de acuerdo a sus características en cultivo y estructuras microscópicas, y según el perfil bioquímico por medio de la prueba API-20, en el caso de bacterias.

Análisis químico foliar

De cada muestra de tejido se tomó una submuestra de 500 g para realizar análisis químico completo y conocer el estado nutricional de las plantas. Se determinaron las concentraciones de N, P, Ca, Mg, K, S, Fe, Cu, Zn, Mn y B.

Resultados y discusión

Aunque se presume que la alteración puede ser debida a un fitoplasma, como en el caso del crisantemo, se consideró importante conocer la presencia de hongos o bacterias, para tratar de asociar la aparición de los síntomas con presencia de estos organismos. A partir de los análisis fitopatológicos de tejido dañado se recuperaron los hongos Pestalotia sp., Alternaria sp. y Glomerella sp., así como las bacterias Pseudomonas luteola (Kodoma) y P.fluoresceins (Migula), Sphingomonas paucimobillis (Holmes), Burkholderia cepacia (Palleroni & Holmes) y Xanthomonas sp. Sin embargo, estos organismos fueron aislados también a partir de follaje asintomático para vena roja.

Los hongos Pestalotia sp. y Alternaria sp., así como las bacterias del género Pseudomonas son mayormente oportunistas, lo que significa que se alojan en un hospedero que generalmente presenta condiciones de estrés, el cual puede deberse a desbalances nutricionales por deficiencia o toxicidad, inadecuado contenido de agua (estrés hídrico por inundación o sequía), temperaturas extremas o cambios bruscos, así como cualquier otro factor que debilite la fisiología normal de la planta.

El estudio por medio de microscopia electrónica de barrido (MEB) a las muestras asintomáticas mostró que los haces vasculares se encuentran normales y sin ningún tipo de alteración ultraestructural. Mientras que, en el sistema vascular de las frondas enfermas se presentan alteraciones morfológicas, los conductos son más pequeños que los de una planta sana y presentan un recubrimiento en las paredes externas con un material de apariencia friable y cristalina, del cual no se conoce su composición. No se observó ninguna estructura propia de hongos o bacterias (Figura 2).

Se observó la presencia de cristales laminados junto a los haces vasculares que presentaban alteraciones morfológicas, se pudo observar algo similar a un estado intermedio de cristalización, con similitud a una acumulación de material friable en el mesófilo esponjoso de frondas dañadas que asemejan la forma final de un cristal laminado (Figuras 3 y 4).

También, se hallaron cristales en las muestras de tejido enfermo observadas por medio de microscopia electrónica de transmisión (Figura 5). En las muestras asintomáticas no se observaron cristales.

Aunque, en este trabajo no se realizó ningún análisis para determinar la composición de los cristales, de acuerdo a las descripciones morfológicas dadas por Vincent y Nakata (2005), es posible que estos cristales sean de oxalato. Posiblemente, el recubrimiento friable observado en el haz vascular sea un tipo de cristal llamado cristal de arena y los cristales laminados sean del tipo prismático. Existen reportes de acumulaciones de oxalato en forma de cristales en cultivos que presentan sintomatologías parecidas a la vena roja del helecho; por ejemplo, Maldonado-Torres etal. (2006) reportan que en hojas de Citrus aurantifolia (Christm.) afectadas por clorosis férrica se hallaron cristales de oxalato, tanto en la superficie adaxial como en la abaxial, estos autores indican que la cantidad y longitud de los cristales aumentó conforme aumentó la severidad de la deficiencia de hierro; en esas hojas se registraron desbalances en los niveles de potasio (K), manganeso (Mn) y fósforo (P), así como en las relaciones P/Fe y K/Ca.

Se han reportado algunas enfermedades similares a la vena roja, tanto en helecho como en otros cultivos. Por ejemplo, en cowpea se producen estrías pardas en hojas maduras debido a la toxicidad de manganeso en su forma oxidada (Wissemeier y Horst, 1992). En algodón se forman manchas necróticas oscuras en las hojas nuevas, luego se producen arrugas, moteados y se tornan cuerosas, y muchas veces se produce abscisión prematura; además, se nota un retardo general del crecimiento, también debido a la toxicidad por manganeso (Sirkar y Amin, 1974).

En crisantemo, Lawson y Dienelt (1991), estudiaron una necrosis foliar caracterizada por pecas necróticas en las hojas bajeras asociadas con clorosis y senescencia prematura, la cual fue observada por más de 20 años, sin conocer su causa, pero la relacionaban con la necrosis del floema del crisantemo, enfermedad relacionada a un fitoplasma, debido a que, los síntomas de la necrosis foliar parecían idénticos a los reportados para la necrosis del floema. Los autores utilizaron microscopia electrónica de barrido (MEB) y microanálisis de rayos X (EDX) para estudiar los síntomas y lograron concluir que la necrosis foliar del crisantemo está asociada a una toxicidad por manganeso, ya que el análisis de rayos X reveló acumulaciones del elemento en las lesiones necróticas, pero no en tejido asintomático. En helecho, Lijalad (1990) informó de una alteración que produce decoloraciones intervenales de las frondas, que evolucionan en manchas color pardo-marrón; indica que parece estar relacionado con desequilibrios en los niveles de humedad relativa. Por otro lado, González et al. (1998) hacen referencia a una fisiopatía, llamada borde rojo de la hoja, cuyos síntomas son bordes color rojizo en la lámina de la hoja, como si hubiese sufrido una oxidación. Su aparición es frecuente al inicio de la primavera y parece estar relacionado con una deficiencia de los niveles de calcio en la hoja.

De acuerdo a los resultados de los análisis químicos foliares, mostrados en el Cuadro 1, las plantas que presentan síntomas tienen niveles de calcio tres veces más altos que las plantas sin síntomas, así como, la mitad de la concentración de nitrógeno y fósforo. Por otro lado, los niveles de potasio de las plantas con síntomas son aproximadamente la tercera parte de la cantidad del elemento en las asintomáticas. Con respecto a los microelementos, los niveles de hierro fueron mayores en el tejido con síntomas; es de suma importancia notar las concentraciones de manganeso y calcio en el tejido enfermo muestreado en el 2007, ya que son las más altas para estos elementos y precisamente estas fueron las muestras que mostraron los cristales en el estudio de microscopía electrónica.

Tomando en cuenta lo anterior, se especula que, las alteraciones expresadas en el follaje pueden deberse a desbalances en las concentraciones internas de microelementos, tales como hierro, manganeso o calcio, debido a la absorción de elementos en estados oxidativos tóxicos para la planta. Esto puede ocurrir cuando las raíces se encuentran en suelos inundados que presentan condiciones de hipoxia o anoxia en pocas horas, pues un agotamiento de oxígeno en el suelo se acompaña de un incremento en los niveles de CO2, descomposición anaeróbica de la materia orgánica y del incremento en la solubilidad de minerales, especialmente de hierro y manganeso, así como de la disminución del potencial redox, lo cual resulta en la producción y acumulación de compuestos potencialmente tóxicos (Parolin y Wittmann, 2010).

Las condiciones descritas se presentan con frecuencia en el cultivo del helecho hoja de cuero. Tradicionalmente, el productor cree que debe mantener su cultivo lo más húmedo posible, con el fin de reproducir su hábitat natural, por lo que es fácil observar condiciones de encharcamiento continuo, situación que no es recomendable, ya que Gónzalez et al. (1998) indican que se producen daños en el rizoma, especialmente cuando se superan las 24 h por encima de la capacidad de campo.

Por otro lado, se conoce que muchas especies de plantas pueden compartimentalizar (capacidad de dividir el citoplasma en compartimentos por medio de sistemas de endomembranas), en sus vacuolas el elemento cuando se encuentran bajo estrés por toxicidad y son capaces de formar cristales, como un mecanismo de detoxification, así el manganeso en exceso se une al ácido oxálico para formar oxalatos, por ejemplo en plantas hiperacumuladoras (Memon y Yatazawa, 1984; González y Lynch, 1999).

Conociendo lo anterior, es posible que bajo las condiciones actuales de manejo agronómico del cultivo, caracterizado por sustratos de siembra con alto contenido de materia orgánica y niveles de humedad constantemente altos; se esté favoreciendo un ambiente hipóxico que desencadene la producción de formas de manganeso en estados oxidados, los cuales al ser absorbidos por las raíces y translocados al follaje, provocan condiciones internas de estrés oxidativo, a lo que la planta responde por medio de la formación de cristales, los que pueden obstruir los haces vasculares y producir los síntomas descritos antes.

Al respecto, Vargas-González (1998) indica que en Costa Rica enfermedades como la vena roja, la vena amarilla y el mongolismo del helecho hoja de cuero fueron controladas mediante suplementos de boro, calcio y manganeso. Lo que indica que la causa de las alteraciones podrían ser desbalances nutricionales.

De comprobarse que la vena roja es debida a un desbalance nutricional, la estrategia de manejo de la enfermedad estaría basada en prácticas culturales tendientes a reducir la cantidad de agua del sustrato y a equilibrar los niveles de minerales en la planta, lo que evitaría el uso de bactericidas y por ende el riesgo a la salud humana y el deterioro ambiental. Lo cual es de suma relevancia, porque la actividad helechera es una de las que presenta mayores impactos ecotoxicológicos, así como riesgos significativos de que los trabajadores padezcan envenenamiento agudo o crónico por la exposición a plaguicidas (Mo-Lee, 2001).

Definitivamente, es importante que se continúe con investigaciones que generen conocimiento acerca de la causa real de esta enfermedad, de manera que sea posible elaborar, validar e implementar estrategias de manejo apropiadas y enfocadas desde un punto de vista integrado, con la finalidad de disminuir los volúmenes de insumos químicos aplicados.

Conclusiones

Los resultados permiten concluir que la sintomatología de la vena roja del helecho hoja de cuero está relacionada con alteraciones ultraestructurales en los haces vasculares y presencia de cristales en el mesófilo de las frondas enfermas.

Los datos de concentración de elementos a nivel foliar dejan ver que existen desbalances nutricionales asociados con el tejido que presenta síntomas.

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