Histología del daño en fruto y rama de aguacate 'Hass' por escamas armadas (Hemiptera: Diaspididae)*

Histology of the damage in fruits and branches of 'Hass' avocado trees caused by armored scales (Hemiptera: Diaspididae)

Rubén Hernández-Rivero¹, M^a de Lourdes C. Arévalo- Galarza^1,2§, Guadalupe Valdovinos-Ponce³, Héctor González-Hernández³, Jorge Valdez-Carrasco³ y Martha Elva Ramírez-Guzmán^2,4

¹ Recursos Genéticos y Productividad- Fruticultura-Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco, km 36.5. Montecillo, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230.

³ Posgrado en Fitosanidad Colegio de Postgraduados. gvanpon@colpos.mx; hgzzhdz@colpos.mx; jvaldez@colpos.mx

⁴ Posgrado en Estadística-Colegio de Postgraduados. marthag@2010@gmail.com

* Recibido: septiembre de 2012
Aceptado: abril de 2013

Resumen

Las escamas armadas Abgrallaspis aguacatae y Hemiberlesia lataniae son plagas ocasionales en aguacate 'Hass'; sin embargo, causan problemas durante la producción y empaque del fruto. A pesar de su importancia como plagas, las interacciones entre estos insectos y sus plantas hospederas han sido poco estudiadas. El objetivo de este trabajo fue determinar si las especies de escamas armadas causan alteraciones histológicas en frutos y ramas de aguacate 'Hass'. Se colectaron frutos en madurez fisiológica y ramas jóvenes con y sin presencia de escamas armadas en cinco huertos comerciales de Michoacán, México en enero y julio de 2011. Se realizaron cortes histológicos para observar los cambios a nivel celular como respuesta a la presencia de la escama. Se identificaron tres especies: Hemiberlesia lataniae, Hemiberlesia diffinis y Abgrallaspis aguacatae. Éstas escamas no provocaron cambios macroscópicos ni anatómicos en los tejidos de ramas y frutos, pero como respuesta a la presencia y al proceso de alimentación de estas especies, se detectó acumulación de fenoles en paredes celulares, interior de las células de la epidermis y corteza así como en las paredes y el citoplasma de los tejidos epidérmico y parenquimatoso del exocarpio, en las paredes y el citoplasma de los tejidos epidérmico y parenquimatoso del exocarpio y en el área en donde se localizó el insecto. En rama, los estiletes de las escamas se detectaron en corteza, y en frutos la mayoría fueron localizados a nivel de las células del exocarpio. Aparentemente la penetración del aparato bucal de las escamas en los tejidos del aguacate fue intracelular y no se observó asociación de los estiletes con el tejido vascular.

Palabras clave: Hemiberlesia lataniae, Hemiberlesia diffinis, Abgrallaspis aguacatae, polifenoles, plantaciones de aguacate, plaga.

Abstract

Armored scales Abgrallaspis aguacatae and Hemiberlesia lataniae are occasional pests of 'Hass' avocado trees; however, they can cause problems during the production and packing of the fruit. Despite its importance as pests, the interactions between these insects and their host plants has been little studied. The aim of this study was to determine if armored scale species cause histological alterations in fruits and branches of'Hass' avocado trees. Physiologically mature fruits and young branches with and without the presence of armored scales were collected in five commercial orchards of Michoacán, Mexico, in January and July 2011. Histological sections were performed in order to observe changes that occurred at the cellular level in response to the presence of the scales. Three species were identified: Hemiberlesia lataniae, Hemiberlesia diffinis and Abgrallaspis aguacatae. These scales caused no macroscopic or anatomical changes in the tissues ofbranches and fruits, but the accumulation ofphenols was detected, in response to the presence and the feed process of these species, in interior cell walls of epidermis and bark cells, as well as on the walls and cytoplasm of epidermal and parenchymal tissues of the exocarp, and in the area where the insects were located. In the branches, the stylets of the scales were found in the bark and fruits, and most were located in the exocarp cells. Apparently, the mouthparts of the scales penetrated the tissues of avocado intracellularly, and no association of the stylets with the vasculartissue was observed.

Keywords: Abgrallaspis aguacatae, avocado orchards, Hemiberlesia diffinis, Hemiberlesia lataniae, pest, polyphenols.

Introducción

El aguacate se cultiva en 60 países del mundo, de los cuales México destaca como el principal productor (29% de la producción mundial), exportador (40%) y el de mayor consumo per cápita (10 kg) (Gutiérrez et al, 2010; SE, 2012). En 2010, México exportó 368 mil toneladas principalmente a Estados Unidos de América (73.3%), Japón (11%) y Canadá (6.8%). Por lo que este fruto representa una de las principales fuentes de divisas agrícolas para el país (SE, 2012). La producción nacional de aguacate se lleva a cabo en 28 entidades federativas, de las cuales Michoacán destaca por ser el principal productor, aportando 86% de la producción, con la mayor superficie sembrada y cosechada (SE, 2012).

Sin embargo, en el sistema productivo del aguacate la presencia de plagas insectiles y enfermedades afectan la productividad y el rendimiento del cultivo, limitando en algunos casos el comercio internacional debido a los riesgos fitosanitarios que representan y a la exigencia de productos de mejor calidad en los mercados. Recientemente, en Estados Unidos de América, se reportó la presencia de ciertas especies de escamas armadas en frutos de aguacate 'Hass' provenientes de Michoacán, México, de las cuales algunas no están reportadas para este país (Morse et al., 2009).

Las escamas armadas pertenecen a la familia Diaspididae y constituyen el grupo más numeroso de la superfamilia Coccoidea con alrededor de 400 géneros y 2 650 especies, de las cuales cerca de 200 son consideradas plagas de importancia económica (Miller y Davidson, 1990; Moran y Goolsby, 2010). La mayoría de las especies de este insecto son polífagas y cosmopolitas, mientras que otras son endémicas de una determinada región geográfica (Kondo y Muñoz, 2009).

A nivel mundial se reportan asociadas al cultivo de aguacate a 53 especies de escamas armadas pertenecientes a 29 géneros, pero pocas son de interés cuarentenario (Evans et al, 2009; Kondo y Muñoz, 2009). En México particularmente en Michoacán, se han detectado nueve especies, de las cuales Hemiberlesia lataniae (Signoret) y Abgrallaspis aguacatae (Evans, Watson y Miller) fueron las de mayor distribución en el estado, siendo A. aguacatae probablemente endémica de Michoacán (Lázaro-Castellanos et al, 2011).

En México, el interés en la presencia de estos insectos en el cultivo de aguacate se ha ido incrementando por ser una plaga distribuida en la región productora. Sin embargo, a la fecha se desconoce el efecto de su establecimiento y alimentación en ramas y frutos. Además, existe escasa información acerca de la variabilidad en la susceptibilidad y en los mecanismos de defensa utilizados por el tejido vegetal ante el ataque de la escama armada (Miller y Davidson, 2005). En este sentido, la histología es una de las herramientas para el diagnóstico e identificación y hábitos de algunos fitopatógenos, que provee información de la interacción planta-patógeno, permitiendo conocer los mecanismos estructurales de defensa que tiene la planta para contrarrestar el ataque del patógeno. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación, fue determinar si las especies de escamas armadas presentes en frutos y ramas de aguacate 'Hass' causan alteraciones a nivel histológico y sus implicaciones en los frutos y ramas.

Materiales y métodos

Histología

Durante enero y junio de 2011, se colectaron frutos en madurez fisiológica y ramas jóvenes (1 a 1.5 cm de diámetro) con y sin presencia de escamas armadas (A.aguacatae y Hemiberlesia spp.) de huertas comerciales de aguacate 'Hass', ubicadas en el estado de Michoacán, México. De cada huerta se seleccionaron 5 árboles (tres con presencia de escama y dos sin escama) aparentemente homogéneos en fenología y tamaño. Los muestreos se realizaron en los cuatro puntos cardinales y en dos estratos del árbol: medio (3 a 4 m) y bajo (1 a 2.5 m). Se recolectaron cuatro frutos y cuatro ramas por árbol, cubriendo un total de 40 frutos y 40 ramas por huerto. Los frutos y ramas se disectaron en fragmentos de aproximadamente 1 cm² y se agruparon en muestras con presencia de escama, sin escama y en muestras en donde se removió el insecto.

El material disectado, se fijó por 48 h en una mezcla de formaldehido, ácido acético glacial, etanol al 96% y agua destilada en proporción 100:50:50:350 mL. Posteriormente, se lavó con agua corriente durante 15 minutos, se deshidrató e infiltró en un procesador automático de tejidos Tissue -Tek® II, modelo 4640-B® (Sakura Finetechnical Co., LTD. Tokio Japan) durante 5 horas en cada una de las siguientes soluciones: etanol al 50, 70, 85, 96 y 100%; etanol absoluto: xilol absoluto (1:1), xilol absoluto y en dos cambio de paraplast (SIGMA chemical®) por 2.5 h en cada uno.

El tejido vegetal, se embebió en paraplast y se cortó transversalmente a 11 (μm de grosor en un micrótomo rotatorio (Jung Histocut®, Marca Leica, modelo 820). Los cortes se montaron en portaobjetos con adhesivo de Haupt, se extendieron en una plancha térmica (C. O. Slide - Warner, modelo 26020 ) a 20- 25 °C durante 24 h y se tiñeron con safranina- verde rápido según la metodología de López et al. (2005). Las observaciones se realizaron en un microscopio óptico marca Carl Zeiss^®, modelo Axiostar.

Estimación de polifenoles

Para la estimación de polifenoles totales, se seleccionaron de 5 a 12 preparaciones (laminillas) representativas de cada uno de los tratamientos evaluados (con presencia de la escama, sin escama, escama removida, y con dos especies de escama por sección de rama). De cada laminilla se seleccionaron aleatoriamente tres cortes y de cada corte se tomaron fotografías de seis campos visuales diferentes (dos campos antes de observarse la escama, dos campos visuales del sitio en donde se localizó la escama, y dos campos visuales después de observar la escama). De cada uno de los campos visuales capturados se seleccionaron al azar diez puntos y en ellos se midió el color en valores R (Red) G (Green) B (Blue), con el programa GIMP versión 2.6.11. Las imágenes se tomaron con una cámara digital para microscopía Pax cam 3® integrada a un fotomicroscopio III de Carl Zeiss®. Las fotografías se tomaron con el objetivo de 40 x a una resolución de 300 dpi.

Del material colectado en campo, se tomaron diez hembras adultas de cada género y especie (Hemiberlesia spp y Abgrallaspis aguacatae), conservadas en alcohol al 70% y se montaron siguiendo la técnica de Kosztarab (1963). La identificación a nivel de especie se hizo con las claves de Evans et al. (2009).

Análisis estadístico

Los valores de color R G B, se analizaron de manera conjunta, mediante la construcción de una variable canónica. El modelo estadístico utilizado para frutos y ramas fue el mismo:

Donde: R_ijk = valor de color R de la k- ésima observación del sitio j- ésimo dentro del tratamiento i- ésimo; G_ijk= valor de color G de la k- ésima observación del sitio j- ésimo dentro del tratamiento i- ésimo; B_ijk= valor de color B de la k- ésima observación del sitio j- ésimo dentro del tratamiento i- ésimo; μ= vector de medias general; ζ_i= tratamiento i-ésimo, donde i = 1,...,4 para rama, i = 1,...5 para fruto; δ_j (ζ_i)= sitio j-ésimo dentro del tratamiento i-ésimo, donde j = 1,..., 6. Si j = 1 y 2 se refiere al sitio antes de localizarse el insecto, j= 3 y 4 sitio de localización del insecto y j= 5 y 6 se refiere al sitio después de la localización del insecto; ∈_ijk= error experimental.

Posteriormente con las variables canonícas W₁= 0.0391R - 0.0071G + 0.0291B (en rama) y W₁= 0.0274R -0.0468G + 0.0701B (en fruto) generadas a partir del modelo (1), se procedió a probar los siguientes juegos de hipótesis y se realizaron comparaciones múltiples con la prueba de Tukey a= 0.05, a través de un análisis univariado de varianza (ANOVA):

A partir del modelo:

Finalmente se ubicaron las medias de tratamientos y de sitios dentro de tratamientos en el espacio canónico y se calcularon las correlaciones entre las variables originales y las variables canonícas creadas.

W₁ es un contraste entre B (tejido sin daño) vs R (tejido dañado) vs G (tejido poco dañado). Por lo tanto, si los valores de las medias para la primera variable canoníca (W₁), son mayores y positivos significa que hay una menor acumulación de fenoles y en consecuencia menor daño al tejido vegetal (rama y fruto). En contraste si los valores de las medias de W₁ son menores e incluso negativos, significa que hay una mayor acumulación de fenoles y por lo tanto mayor daño. Esta variable canónica (W₁) es un indicador de un posible daño en los tejidos vegetales analizados. El análisis univariado y multivariado, así como la comparación múltiple de las medias de tratamientos y de sitios dentro de tratamientos se realizaron con la prueba de Tukey α= 0.05, usando el paquete estadístico SAS® para Windows versión 9.1.3.

Resultados y discusión

Identificación de las especies de escamas armadas

Se identificaron tres especies de escamas armadas: Hemiberlesia lataniae (Signoret), H. diffinis (Newsted) (escamas blancas) y Abgrallaspis aguacatae (Evans, Watson y Miller) (escama café), las cuales se detectaron infestando frutos y ramas de aguacate 'Hass'. H. lataniae es una especie cosmopolita y altamente polífaga presente en diversos hospederos tanto frutales, como ornamentales y forestales (Miller y Davidson, 2005; Vargas y Rodríguez, 2008). De acuerdo con estudios realizados por Lázaro-Castellanos et al., 2011), H. lataniae estuvo presente en diez huertos de aguacate 'Hass' muestreados en nueve municipios del estado de Michoacán, y fue la de mayor distribución en este estado. Esta escama, se ha reportado infestando aguacate en California EUA (Rugman-Jones et al, 2009), Israel (Gerson y Zor, 1973), Australia (Waite, 1988), Chile (Vargas y Rodríguez, 2008) y Sudáfrica (De Villiers y Van Den Berg, 1987).

La escama H. diffinis se ha reportado en una amplia variedad de hospederos (Fauna Entomológica de Nicaragua, 2012). Ésta es una especie de menor distribución en la zona productora de aguacate en Michoacán, México (Lázaro-Castellanos et al, 2011) y ha reportado infestando aguacate en Nicaragua (Fauna Entomológica de Nicaragua, 2012).

Abgrallaspis aguacatae es una especie de reciente descripción asociada al aguacate 'Hass' (Evans et al, 2009), encontrándose en nueve huertos ubicados en seis municipios de Michoacán, siendo una especie de amplia distribución y probablemente endémica de este estado (Lázaro-Castellanos et al, 2011).

Anatomía de ramas y frutos de aguacate sin escamas armadas

Fruto. El exocarpio, que puede ser rugoso e irregular (Barrientos et al, 1996), presentó una cutícula gruesa, continua y homogénea que cubrió el tejido epidérmico (Schroeder, 1950), proyectándose entre, las paredes anticlinales de las células (Figura 1D). La epidermis estuvo formada por un sólo estrato celular y se extendió completamente sobre la superficie del fruto. Al igual que en las ramas, las células presentaron fenoles a manera de inclusiones más o menos densas de color castaño a rojizo (Figura 1D). Adyacentemente, se localizaron varias capas de células parenquimatosas isodiamétricas de pared delgada y con abundantes cloroplastos, los cuales le dan el color verde al exocarpio (Barrientos et al, 1996) (Figura 1D). El mesocarpio estuvo constituido por células grandes de pared delgada y con pequeñas inclusiones de lípidos (Figura 1E). El xilema y el floema formaron haces de tejido vascular distribuidos en las células del mesocarpio (Figura 1F).

Respuesta histológica al establecimiento de escamas armadas en ramas y frutos de aguacate

Rama. No se observaron alteraciones estructurales en los tejidos de rama de aguacate en respuesta al establecimiento de las escamas armadas (Figuras 2A, y 2B). Hill et al. (2011) observaron que solo algunos genotipos de kiwi (Actinidia chinensis) infestados con H. lataniae, indujeron la formación de una herida en el punto de contacto entre la peridermis de la rama y la presencia de esta escama y las células del colénquima mostraron acumulación de material fenólico, hipertrofia y colapso celular.

El análisis de varianza para la acumulación de compuestos fenólicos mostró diferencias significativas en la epidermis y corteza de las ramas de aguacate en respuesta al establecimiento de las escamas armadas (Cuadro 1). El depósito de estos compuestos fue significativamente mayor en ramas infestadas con especies de escama blanca (H. lataniae y H. diffinis) en comparación con las infestadas por la escama café y con dos especies de escama por sección de rama (Cuadro 1), y podrían ser el resultado de la respuesta de la planta ante el ataque de insectos herbívoros, la cual involucra la activación de diversos genes que codifican la síntesis y acumulación de metabolitos secundarios (entre ellos los compuestos fenólicos).Algunos de estos compuestos fenólicos participan activamente restringiendo la invasión del insecto al resto de la planta (Sepúlveda et al, 2004) y podrían estar relacionados con la inhibición de la actividad de enzimas pectolíticas producidas por el insecto (Agrios, 2004).

La escasa deposición de compuestos fenólicos observada en secciones de rama con escama café y con dos especies de escama por sección de rama, posiblemente se deba a que la rama ya presentaba crecimiento secundario. Hill et al. (2011), observaron que ramas maduras de kiwi (Actinidia chinensis) infestadas con H. lataniae mostraron una respuesta más lenta y menos pronunciada al establecimiento de esta escama comparada con la observada en ramas jóvenes.

Fruto. Se observaron depresiones del tejido epidérmico asociadas con el establecimiento de las escamas armadas (Figura 3A). Es probable que tales cambios se hayan originado por la presión mecánica generada sobre el exocarpio; sin embargo no siempre se encontró tal asociación, además el exocarpio de la variedad 'Hass' es rugoso e irregular (Barrientos et al, 1996), y las escamas tienden a localizarse en este tipo de superficies (Washington y Walker, 1990; Morse et al, 2009), para protegerse de depredadores y de las condiciones ambientales, ya que al emerger de los huevecillos, la ninfa migratoria no presenta una cubierta protectora.

Los tejidos epidérmico y parenquimatoso del exocarpio del fruto presentaron acumulación de compuestos de naturaleza fenólica, esta respuesta fue mayor en aquellos tejidos en donde se removieron las escamas (Figuras 3B y 3C) (Cuadro 2). La acumulación de fenoles observada en ramas y frutos de los resultados observados en las ramas y frutos de aguacate 'Hass' analizados, sugieren que las escamas se alimentan a partir de células vivas sin estimular la muerte de estas (De la garza, 1996; Stout et al, 2006), o quizá su establecimiento no provoco un estrés tan severo que provocara un daño celular importante, pero si estimuló la síntesis de enzimas como la fenilalanina amónico liasa (PAL), la cual es clave en la biosíntesis de la mayoría de los compuestos fenólicos (Agrios, 2004; Van Ledyveld, 1983), de los cuales Ramírez y Bor (1973), en frutos de aguacate refrigerados identificaron los siguientes: isómeros del ácido clorogénico y p-coumarylquinic, catequinas, leucoantocianinas, isoflavonoides, ácido cafeinico y p-cumarico. Siendo el ácido caféinico y cúmarico los que se encontraron en mayores cantidades en frutos mediana y altamente dañados (Van Ledyveld, 1983). No se observaron alteraciones celulares ni anatómicas en los diferentes tejidos del fruto (exocarpio y mesocarpio) a pesar de la presencia de las especies de escamas armadas (A. aguacatae, Hemiberlesia spp), y el insecto aparentemente desarrollo normalmente.

Similares observaciones reportaron Washington & Walker (1990) en frutos de limón infestados con escama roja de California (Aonidiella aurantii Maskell), los cuales presentaron una mínima cantidad de células dañadas asociadas con la alimentación de esta escaguacate 'Hass', sugiere que el establecimiento de las escamas indujo la biosíntesis de la fenilalanina amonialiasa (PAL), enzima involucrada en la biosíntesis de ácido caféico y cúmarico, en respuesta a condiciones de estrés (Agrios, 2004; Van Ledyveld, 1983), (Ramírez y Bor, 1973; van Ledyveld etal., 1984;Agrios, 2004). En frutos al igual que en ramas no se observaron alteraciones estructurales, en respuesta al establecimiento de las escamas (Figura 3D).

Respuesta histológica de los tejidos de ramas y frutos de aguacate a la penetración del estilete.

Rama. No se observó asociación de los estiletes con el tejido vascular de las ramas. Es posible que las fibras de este tejido actúen como una barrera física y limiten el avance y penetración de estas estructuras de alimentación (Hill et al, 2011), obteniendo estos insectos los nutrientes requeridos de las células del exocarpio y corteza. Sin embargo, se sugiere evaluar diferentes planos de corte para corroborar si existe o no asociación del estilete con el tejido vascular.

Fruto. Las paredes celulares del tejido parenquimatoso del exocarpio presentaron acumulación de compuestos de naturaleza fenólica a través de la ruta de penetración del estilete (Figura 5A). Es posible que la acumulación de estos compuestos contribuya con un aumento en la rigidez de las paredes celulares (Sepúlveda et al, 2004), actuando como una barrera física al daño causado durante la penetración del estilete. La saliva del insecto permite la penetración de los estiletes en los tejidos vegetales (Snodgrass, 1935) y su acción enzimática probablemente también indujo la acumulación de compuestos fenólicos. Aunque no existen reportes de la composición de la saliva de las escamas armadas, Baranyovits (1953) y Ebeling (1959) reportan que la escama roja de California (Aonidiella aurantii) posee una toxina salival que posiblemente sea el agente causal del daño provocado en los tejidos de ramas de cítricos, pero estos autores no dan más detalles de la composición de la toxina.

Por el contrario, las células que fueron atravesadas por los estiletes de las escamas aparentemente no presentaron daño (Figura 5B),Albrigo y Brooks (1977), observaron resultados similares en las células de corteza de ramas de cítricos atravesadas por los estiletes de la escama nieve (Unaspis citri Comst) y sugieren que las células pueden mantener su función aún después de la penetración de los estiletes.

Como se ha mencionado, una de las principales respuestas de las ramas y frutos de aguacate al establecimiento y penetración de los estiletes de las escamas armadas fue la acumulación de compuestos de naturaleza fenólica en el apoplasto y simplasto de los tejidos de estos órganos. Los frutos y ramas infestados con escamas mostraron mayor acumulación de estos compuestos en el exocarpio y en la epidermis y corteza de las ramas (Figuras 6A y 6C) con respecto a los frutos y ramas sin escama (Figuras 6B y 6D).

Conclusiones

Las escamas armadas Lo anterior posiblemente sea el resultado en la respuesta de la defensa química contra el ataque de insectos herbívoros en las plantas superiores, la cual induce la síntesis y acumulación de metabolitos secundarios que participan activamente matando al insecto y/o restringiendo su invasión al resto de la planta (Sepúlveda, 2004). Sin embargo, aún cuando hubo acumulación de compuestos fenolicos el insecto aparentemente desarrollo normalmente y alimentación de las especies de escamas armadas (A. aguacatae, Hemiberlesia spp.). Sin embargo, a pesar de la presencia de compuestos fenólicos el insecto aparentemente desarrollo normalmente. Hemiberlesia lataniae, H. diffinis y Abgrallaspis aguacatae estuvieron asociadas a ramas y frutos de aguacate ' Hass'. El establecimiento de estas escamas y la penetración de su estilete en los tejidos de ramas y frutos indujeron la acumulación de compuestos fenólicos. En ramas los estiletes de las escamas se detectaron en la corteza y en el exocarpio de frutos. No se observó asociación de los estiletes con el tejido vascular de los órganos evaluados y las células que fueron atravesadas por los estiletes de las escamas no presentaron cambios en su estructura celular.

La calidad de la pulpa no se ve comprometida por la infestación de estas escamas. Sin embargo, es necesario un manejo integral en campo que reduzca las poblaciones de esta plaga en el cultivo y por ende en los frutos de aguacate 'Hass' con el objetivo de mejorar su apariencia externa.

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