Virulencia de aislados monospóricos de Isaria fumosorosea sobre inmaduros de Bemisia tabaci*

Virulence of monosporic isolates of Isaria fumosorosea on immatures of Bemisia tabaci

Esaú Ruiz Sánchez¹, Wilberth Chan Cupul^2§, Jairo Cristóbal Alejo¹, José María Tun Suárez¹, Alfonzo Pérez Gutiérrez¹ y Joel Lara Reyna³

¹División de Estudios de Posgrado e Investigación, Instituto Tecnológico de Conkal. Antigua Carretera Mérida-Motul, Conkal, km 16.3. Yucatán, México. C. P. 97345. Tel. 01 999 9124130 Ext.121 (esau_ruiz@hotmail.com); (jairoca54@hotmail.com); (tun@colpos.mx); (pega51mx@yahoo.com.mx).

³Colegio de Posgraduados. Campus Campeche. Carretera Haltunchén-Edzná, km 17.5, Sihochac, Municipio de Champotón, Campeche. C. P. 24450. Tel. 01 555 8046800, Ext. 64706 (jlara@colpos.mx).

* Recibido: mayo de 2012
Aceptado: enero de 2013

Resumen

Los hongos entomopatógenos son una alternativa promisoria para el control biológico de insectos plaga en la agricultura. En este trabajo se evaluó la virulencia de ocho aislados monospóricos nativos del estado de Yucatán y se usó como referencia un aislado monospórico de una cepa comercial de Isaria fumosorosea sobre huevos y ninfas de Bemisia tabaci. Los bioensayos de dosis-mortalidad se realizaron con cuatro suspensiones de esporas (1 x 10⁴ a 1 x 10⁷ conidios ml^-1). Se evaluó la mortalidad de huevos y ninfas y se calculó la CL₅₀ y TL₅₀ para todos los aislados. La mortalidad de huevos a los 7 días posinoculación de 1 x 10⁷ conidios ml^-1 osciló entre 28.6 y 59.1%; los aislados monospóricos nativos If-Hal M1, If-Tim M1 fueron los más virulentos ya que causaron 59.1 y 51.1% de mortalidad, respectivamente. La mortalidad en ninfas a los 12 días de posinoculación de 1 x 10⁷ conidios ml^-1, osciló entre 59.6 y 81%; los monospóricos nativos If-Tiz M1 y If-Hal M1 obtuvieron los valores más altos con 81 y 70.5%, respectivamente. La concentración letal media (CL₅₀) más baja fue para el monospórico de la cepa comercial Paesin M1 con 1.4 x 10⁵ conidios ml^-1. Con respecto a los tiempos letales medios (TL₅₀), se observó que los más bajos fueron para el monospórico comercial Paesin M1 y el nativo If-Hal M1 con 4.9 y 5 días, respectivamente. Dos aislados monospóricos nativos (If-Tim M1 e If-Hal M1) presentaron alta virulencia para ser considerados en un programa de producción de bioplaguicidas a escala regional en la península de Yucatán.

Palabras clave: control biológico, hongo entomopatógeno, mosca blanca.

Entomopathogenic fungi are a promising alternative for the biological control of insect pests in agriculture. In this study, we evaluated the virulence of eight monosporic isolates native to Yucatan, using as a reference a monosporic isolate from a commercial strain of Isaria fumosorosea on eggs and nymphs of Bemisia tabaci. The dose-mortality bioassays were performed with four spore suspensions (1 x 10⁴ to 1 x 10⁷ conidia ml^-1). We evaluated the mortality of eggs and nymphs and calculated the LC₅₀ and LT₅₀ for all isolates. Egg mortality at 7 days after inoculation of 1 x 10⁷ conidia ml^-1 ranged between 28.6 and 59.1%; the native monosporic isolates If-Hal M1 and If Tim M1 were the most virulent, causing 59.1 and 51.1% mortality, respectively. The mortality of the nymphs 12 days after inoculation of 1 x 10⁷ conidia ml^-1 ranged between 59.6 and 81%; the native monosporic isolates If-If-Tiz M1 and If-Hal M1 obtained the highest values with 81 and 70.5%, respectively. The median lethal concentration (LC₅₀) was lower for the monosporic isolate of the commercial strain Pae-sin M1 with 1.4 x 10⁵ conidia ml^-1. Regarding mean lethal times (LT₅₀), it was observed that the lowest ones were those of the monosporic isolate of the commercial strain Pae-sin M1 and of the native isolate If-Hal-M1 with 4.9 and 5 days, respectively. Two native monosporic isolates (If-Tim-M1 and If-Hal-M1) showed high enough virulence to be considered for a regional bio-pesticides production program in the Yucatan Peninsula.

Key words: biological control, entomopathogenic fungus, white fly.

Introducción

La mosquita blanca Bemisia tabaci (Gennadius) es una de las especies fitófagas más dañinas a nivel mundial, especialmente en regiones de clima cálido. Bemisia tabaci afecta a una gran variedad de cultivos de importancia económica, en particular las hortalizas de las familias solanáceas, cucurbitáceas y leguminosas (Collen et al, 2007; Cabanillas y Jones, 2009). Para el control de B. tabaci se ha usado desmesuradamente insecticidas químicos, con efectos perjudiciales, como la contaminación ambiental y de alimentos, aparición de poblaciones resistentes de insectos, daños a la salud del hombre, desequilibrios en funcionamiento de redes tróficas, y el abatimiento de la biodiversidad y el equilibrio de los agroecosistemas (Mier et al., 2004).

El control biológico de insectos plaga mediante hongos entomopatógenos ofrece un método alternativo para el control de las poblaciones de B. tabaci en los sistemas de producción agrícola, esta estrategia ha sido integrado satisfactoriamente en los programas de manejo integrado de plagas (MIP) (Kim et al, 2011). El hongo entomopatógenos Isaria fumosorosea (Wise) Brown y Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) antes Paecilomycesfumosoroseus asignado al clado Isaria por Luangsa y colaboradores (2005), es una de las especies más promisorias para el control biológico de la mosquita blanca y otros insectos plaga (Scorsetti et al, 2008). Isaria fumosorosea se ha desarrollado exitosamente para el control biológico de Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) (Ali et al., 2010), Trialeurodes vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) (Avery et al, 2004), Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) (Kim et al, 2008) y B. tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) (Cabanillas y Jones, 2009).

En estudios previos en la búsqueda agentes de control biológico de B. tabaci, Panyasiri et al. (2007) evaluaron la virulencia de varias especies de hongos entomopatógenos sobre ninfas de B. tabaci, encontrando el mayor porcentaje de mortalidad con I. fumosorosea (76.7%) al aplicar una suspensión de 1 x 10⁷ conidios ml^-1. Scorsetti et al. (2008) evaluaron la virulencia de aislados fúngicos del sureste de Argentina sobre ninfas de B. tabaci, destacando I. fumosorosea como el más patogénico con 76.7% de mortalidad a los 7 días posinoculación de una suspensión de 1 x 10⁷ conidios ml^-1. En el sureste de China Zhu y Jun (2011) evaluaron la patogenicidad de diversas especies de hongos entomopatógenos en ninfas de B. tabaci, resultando la especie I. fumosorosea la más patogénica con 97% de mortalidad a los 6 días de posinoculación de una suspensión de 1x10⁸ conidios ml^-1.

La búsqueda y evaluación de aislamientos nativos de I. fumosorosea con potencial biocida sobre B. tabaci, adaptados a las condiciones locales es una de las actividades a considerar dentro del desarrollo de un insecticida microbiano para el manejo integrado de B. tabaci en regiones de interés. Los aislados fúngicos obtenidos en campo de insectos micosados presentan un germoplasma propio con alta variabilidad intraespecífica, debido a su amplio rango de hospederos, patogenicidad y características morfológicas y fisiológicas, por lo que un proceso de selección puede ser llevado a cabo mediante la obtención de cultivos monospóricos para seleccionar cepas con alta virulencia sobre B. tabaci (Mier et al, 2004; Ayala et al, 2005; Cortez, 2007).

El objetivo de este estudio fue evaluar la virulencia de aislados monospóricos de I. fumosorosea en estadios inmaduros de B. tabaci. La hipótesis del presente trabajo establece que al menos un aislado monospórico nativo de I. fumosorosea es igual de virulento que el aislado comercial obtenido del producto Paesin (Agrobionsa^® México).

Materiales y métodos

Nomenclatura de los aislamientos

Los aislamientos polispóricos originales de I. fumosorosea se obtuvieron de insectos micosados colectados en zonas hortícolas del estado de Yucatán, México (Cuadro 1) y fueron mantenidos y conservados por el laboratorio de reproducción de hongos entomopatógenos del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado de Yucatán (CESVY). Éstos aislados polispóricos que originaron los monospóricos objetos de estudio del presente trabajo, se evaluaron y caracterizaron in vitro previamente por Chan et al. (2010). La identificación de los hongos se realizó mediante características morfológicas de acuerdo a Samson (1974) y Domsch et al. (1980). Dentro de los experimentos se incluyó una cepa de referencia comercialmente Paesin (Agrobionsa^® México). Los aislamientos fueron reactivados y conservados en Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) (Merck^®, Alemania) adicionado con 0.5 ppm de cloranfenicol (Lab. Sophia S. A. de C. V. México).

Obtención de cultivos monospóricos

Los cultivos monospóricos se obtuvieron a partir de una suspensión de esporas de cada aislado original, considerado como polispórico; la suspensión de esporas se preparó agregando 10 ml de agua destilada estéril más 5 μ1 de Tween 80 a las colonias polispóricas de 7 días establecidas en cajas de Petri. Las colonias se rasparon con espátula estéril, los productos se filtraron a través de una gasa esterilizada para separar las esporas del micelio y fragmentos del medio de cultivo (Gindin et al, 2000). La suspensión de esporas obtenida se ajustó a una concentración de 100 conidios ml^-1 empleando una cámara de Neubauer^® (Marienfeld, Alemania). Se depositaron 200 μl de esta suspensión en cajas de Petri con SDA vaciado en capa fina, al reverso de la caja de Petri se trazaron cuadros de 0.5 cm², las cajas se incubaron a 25 °C y se revisaron cada 12 h al microscopio compuesto 4 x-40 x, para marcar con un punto el cuadrante donde se encontraba una sola espora con tubo germinativo, el cual se cortó y transfirió a una caja nueva con SDA para su desarrollo (Ayala et al., 2005).

Colonia de Bemisia tabaci

Obtención de huevos y ninfas de B. tabaci

Se empleó la metodología descrita por Muñiz y Nombela (2001), se tomaron diez insectos adultos de la colonia de cría con un aspirador, se depositaron en una micro jaula de 1 cm de diámetro y se sujetaron en una hoja extendida de C. chinense, la microjaula con los adultos fueron retirados a las 24 h, los huevos ovipositados se emplearon de inmediato para los bioensayos respectivos. Para el caso de los bioensayos con ninfas, los huevos ovipositados se dejaron en las hojas por un periodo de 7-8 días hasta obtener ninfas de segundo instar. Únicamente se dejaron 30 huevos o ninfas por hoja como unidad experimental.

Bioensayos de patogenicidad

Para los bioensayos, únicamente se emplearon dos cultivos monospóricos de cada aislamiento polispórico nativo denominados con las iniciales M1 y M2. Se usó como referencia un aislado monospórico de la cepa comercial Paesin con un porcentaje promedio de germinación 12.1% h^-1 (Chan et al., 2010). De éstos cultivos se obtuvieron suspensiones de esporas como se describió anteriormente (Ayala et al, 2005), las suspensiones de esporas fueron ajustadas a cuatro concentraciones 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶ y 1 x 10⁷ conidios ml^-1 empleando una cámara de Neubauer^®, la viabilidad de los conidios estuvo en un rango de 11.9 a 12.5% h^-1 (Chan et al, 2010).

Las suspensiones de esporas fueron inoculadas por inmersión de hojas de C. chinense que contenían huevos o ninfas de B. tabaci durante un periodo de 15 segundos, el testigo se trató con agua destilada estéril más Tween 80^® al 0.05% V/V. Las plantas con las hojas tratadas fueron encubadas bajo condiciones de laboratorio a 27±3 °C, 75±8% de humedad relativa y fotoperiodo de 12 L: 12O, las evaluaciones de mortalidad en huevos y ninfas se llevaron a cabo diariamente por 7 y 12 días, respectivamente.

Los inmaduros de B. tabaci muertos fueron contabilizados usando un microscopio estereoscópico; se contabilizaron los huevos micosados, necrosados y no eclosionados (Gindin et al., 2000); para el caso de las ninfas, se consideraron como muertas aquéllas con cambios de coloración, brillo, forma y crecimiento de micelio sobre éstas (Ruiz et al, 2011). Para confirmar la muerte de los inmaduros de B. tabaci por efecto de los conidios de I. fumosorosea, las hojas con huevos y ninfas muertas fueron lavadas con hipoclorito de sodio 2% y enjuagadas con agua destilada estéril, para posteriormente colocarse en cámaras húmedas. Los huevos y ninfas se observaron diariamente hasta la aparición de micelio. Cabe mencionar que no en todos los casos se observó la producción de micelio en los huevos y ninfas.

Se empleó un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Los resultados de mortalidad en huevos y ninfas bajo la concentración de 1 x 10⁷ conidios ml^-1 se analizaron con un análisis de varianza y comparación de medias Tukey p≤ 0.05 empleando el programa GraphPad InStat (GraphPad Software Inc., 2000). Con los datos de mortalidad de las cuatro concentraciones de esporas se calculó la concentración letal media (CL₅₀) y el tiempo letal medio (TL₅₀) de cada aislado monospóricos usando programa estadístico SAS ver. 8 e para Windows (SAS Institute Inc., USA)

Resultados y discusión

Mortalidad en huevos

La Figura 1 muestra el porcentaje de mortalidad en huevos de B. tabaci por efecto de la aplicación de una suspensión de 1 x 10⁷ conidios ml^-1 de nueve aislados monospóricos de I. fumosorosea. Los aislados If-Hal M1 (59.1%) y If-Tim M1 (51.1%) fueron más virulentos que los aislados If-Tiz M2 (33.2%) y If-Tic M1 (28.6%); sin embargo, If-Tiz M2 y If-Tic M1 fueron estadísticamente igual de virulentos que el resto de los aislados monospóricos evaluados.

En B. tabaci se ha descrito que el estadio de huevo es uno de los menos susceptibles al ataque de hongos entomopatógenos; sin embargo, en este estudio algunos monospóricos de I. fumosorosea causaron porcentajes de mortalidad en huevos mayor a 50%, valores mucho más altos que los reportados por Lacey et al. (1999), quienes encontraron porcentajes de mortalidad menores a 20% al inocular una suspensión de 1 x 10³ conidios cm² de I. fumosorosea en huevos de B. tabaci. En otro estudio de patogenicidad, Espinel et al. (2009) observaron 50.5% de mortalidad en huevos de B. tabaci por efecto de la inoculación de 1 x 10⁷ conidios ml^-1 de I. fumosorosea.

Los resultados del presente estudio también sugieren que los monospóricos de I. fumosorosea sobresalientes, son más virulentos en huevos de B. tabaci que otras especies de hongos entomopatógenos como Lecanicillium lecanii que han mostrado un rango de 14 a 26% de mortalidad (Gindin et al., 2000). Para el caso de Metarhizium anisopliae se han reportado tasas de mortalidad variables en huevos, por ejemplo Skrobek (2001) observó valores de 33-45 % y Ruiz et al. (2011) encontró 9.9-32.2%. Para el caso de otro hongo comúnmente usado en B. tabaci, como Beauveria bassiana, también se ha observado baja patogenicidad en huevos, por ejemplo Al-Deghairi (2008) reportó 5% de mortalidad, por su parte Espinel et al. (2009) reportaron 30% de mortalidad, ambos estudios emplearon una suspensión de conidios similar a la evaluada en el presente trabajo. La actividad ovicida de los aislados monospóricos de I. fumosorosea permitiría una reducción de la población inicial de la plaga lo que repercutiría en obtener densidades poblacionales bajas y en consecuencia menores daños a los cultivos.

Mortalidad en ninfas

Los aislados monospóricos If-Tiz M1 y If-Hal M1 causaron los porcentajes más altos de mortalidad con 81.0 y 70.5%, respectivamente, resultando estadísticamente igual al aislamiento monospóricos de la cepa comercial Paesin M1 (70.6%). La buena actividad insecticida de I. fumosorosea en ninfas de B. tabaci ha sido previamente reportada. Por ejemplo, Scorsetti et al. (2008) encontraron mortalidades de ninfas B. tabaci de 76.6% por efecto de la inoculación de 1x10⁷ conidios ml^-1 de I. fumosorosea.

Panyasiri et al. (2007) encontraron resultados similares al evaluar la patogenicidad de I. fumosorosea bajo condiciones controladas (30 °C, 80-85% HR), donde los porcentajes de mortalidad en ninfas oscilaron entre 36.7 a 76.7%. Es probable que los porcentajes de mortalidad aumenten si se incrementan las concentraciones de esporas. Al respecto, Saito y Sugiyama (2005) evaluaron la patogenicidad de aislados de I. fumosorosea en ninfas de B. tabaci aplicando una concentración de 0.6 x 10⁸ conidios ml^-1, y encontraron una mortalidad promedio de 98%.

Los resultados del presente trabajo confirman la patogenicidad de I. fumosorosea sobre inmaduros de B. tabaci, los cultivos monospóricos If-Tiz M1 y If-Hal M1 fueron igual de virulentos que los cultivos monospóricos de la cepa comercial Paesin; sin embargo, las cepas nativas tienen la ventaja de estar adaptadas a la región de estudio y se esperaría que bajo condiciones de campo su actividad fuera mayor que la actividad de la cepa comercial Figura 2.

Concentración letal medio (CL₅₀) en ninfas

El Cuadro 2 muestra la concentración letal media (CL₅₀) de los aislados monospóricos evaluados. Se consideran que los valores son significativamente diferentes cuando no se traslapan los intervalos de confianza (Cabanillas y Jones, 2009). El aislado comercial Paesin M1 fue más patogénico al obtener la CL₅₀ más baja con 1.4 x 10⁵ conidios ml^-1; seguido del aislado If-Tiz M1 con una CL₅₀ de 3.2 x 10⁵ conidios ml^-1. Existen varios reportes sobre la virulencia de I. fumosorosea en B. tabaci que pueden ser comparados con el presente trabajo por emplear protocolos similares; por ejemplo Hernández y Garza (1994) reportaron una CL₅₀ de 4.3 x 10⁸ conidios ml^-1 para el aislamiento PF2 de I. fumosorosea en ninfas de B. tabaci, valor substancialmente mayor a los valores observados en el presente estudio. Vidal et al. (1997) encontraron una CL₅₀ en rango de 2.6 x 10⁴a 2.3 x 10⁶ conidios ml^-1 de I. fumosorosea sobre ninfas de B. tabaci. Por el contrario, Panyasiri et al. (2007) encontraron una CL₅₀ más baja (9.41 x 10⁴ conidios ml^-1) con una cepa de I. fumosorosea nativa de Tailandia.

Algunos autores mencionan que I. fumosorosea es un hongo con mayor especificidad hacia B. tabaci, ya que los valores obtenidos de CL₅₀ son menores comparado con las CL₅₀ de otros hongos entomopatógenos u otras especies de Isaria. En este contexto, Negasi et al. (1998) estudiando la patogenicidad de Isariafarinosus sobre ninfas de B. tabaci, encontró una CL₅₀ de 3.1 x 10⁶ conidios ml^-1.

Tiempo letal medio (TL₅₀) en ninfas

La virulencia de un determinado aislamiento no solo es indicada por su CL₅₀, si no también por el tiempo en días requerido para causar 50% de mortalidad de las ninfas tratadas (TL₅₀). El Cuadro 3 muestra el TL₅₀ de los aislados monospóricos sobre ninfas de B. tabaci; estadísticamente el aislamiento comercial Paesin M1 y el monospórico If-Hal M1, obtuvieron los valores más bajos con 4.6 y 5.0 días, respectivamente; el TL₅₀ del resto de los aislamientos osciló entre 5.3 y 6.7 días. En estudios previos Zhu y Jun (2011) y Saito y Sugiyama (2005) reportaron valores de TL₅₀ de 4.4 y 4.1 días, respectivamente, al aplicar una suspensión de 1 x 10⁷ conidios ml^-1 de I. fumosorosea sobre ninfas de B. tabaci. Por el contrario, Cabanillas y Jones (2009) encontraron un TL₅₀ más bajo, 3 días, al emplear un aislado de I. fumosorosea aplicando 1 000 esporas/ mm² sobre ninfas de B. tabaci; el resultado de este último estudio pudo ser favorecido por la reactivación del hongo en un medio de cultivo suplementado con adultos de B. tabaci.

Conclusiones

Los aislados monospóricos nativos de I. fumosorosea resultaron igual de virulentos que la cepa comercial estudiada. Los aislados If-Hal M1 y If-Tim M1 fueron los más virulentos en huevos. En ninfas el monospórico nativo If-Hal M1 junto con If-Tiz M1 resultaron los más virulentos. Los aislados monospóricos por ser cepas nativas adaptadas a las condiciones ambientales de la región son potencialmente los candidatos idóneos para el desarrollo de bioplaguicidas a base de hongos entomopatógenos para el control biológico de B. tabaci en la península de Yucatán.

Literatura citada

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