Inoculación con bacterias promotoras de crecimiento vegetal en tomate bajo condiciones de invernadero*

Inoculation with plant growth promoting bacteria on tomato under greenhouse conditions

Diana Beatriz Sánchez López^1§, Ruth Milena Gómez-Vargas¹, María Fernanda Garrido Rubiano¹ y Ruth Rebeca Bonilla Buitrago¹

¹Laboratorio de Microbiología de Suelos. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA). Vía Mosquera-Cundinamarca, Colombia, km 14. Tel. (057) 4227300. Ext. 1401, (rgomezv@corpoica.org.co; mgarrido@corpoica.org.co; rbonilla@corpoica.org.co). §Autora para correspondencia: dbsanchez@corpoica.org.co.

* Recibido: febrero de 2012
Aceptado: agosto de 2012

Resumen

El incremento en la población mundial ha aumentado la demanda de alimentos y así mismo la demanda de fertilizantes químicos los cuales no sólo son costosos sino también contaminantes. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la aplicación de varias cepas candidatas a promotoras del crecimiento vegetal sobre el crecimiento y producción del cultivo del tomate. El estudio se realizó en 2010, en el Centro de Investigación Tibaitatá (Corpoica) ubicado en Mosquera (Cundinamarca- Colombia). Se emplearon las cepas TVL-1 y TVL-2 que se encuentran identificadas como Enterobacter sp., además las cepas Pseudomonas sp. PSO13, PSO14, y Bacillus sp. BEOO2 y BEOO3. Los resultados demostraron la capacidad intrínseca de las cepas para solubilizar una fuente de fósforo poco soluble donde la utilización de las cepas TVL-1, TVL-2 y PSO14 evidenciaron los mejores resultados. Las cepas TVL-1, TVL-2 y PSO13 presentaron actividad fosfatasa. Adicionalmente, las bacterias fueron capaces de producir índoles y sideróforos bajo las condiciones evaluadas. El experimento en invernadero evidenció que las cepas TVL-2 y PSO14 incrementaron de manera significativa la biomasa y desarrollo de la planta (p< 0.05) así como el rendimiento en la producción de frutos lo que se puede asociar a las capacidades bioquímicas asociadas a promoción de crecimiento vegetal evaluadas en el laboratorio.

Palabras claves: BPCV, Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp., biofertilizante.

Abstract

The increase in world population has also increased the demand for food and so does the demand for chemical fertilizers which are not only costly but also pollutants. The aim of this paper was to evaluate the effect of applying several candidate strains to plant growth promoters on growth and yield of tomato. The study was conducted in 2010, Tibaitatá Research Center (Corpoica) located in Mosquera (Cundinamarca, Colombia). The strains used were TVL-1 and TVL-2 identified as Enterobacter sp., also the strains Pseudomonas sp. PSO13, PSO14, and Bacillus sp. BEOO2 and BEOO3. The results demonstrated the intrinsic ability of the strains to solubilize a poorly soluble phosphorus source where the use of the strains TVL-1, TVL-2 and PSO14 showed the best results. The strains TVL-1, TVL-2 and PSO13 had phosphatase activity. Additionally, the bacteria were able to produce siderophore and indoles under the conditions evaluated. The greenhouse experiment showed that, the strains PSO14 and TVL-2 significantly increased biomass and plant development (p< 0.05) as well as fruit yield production that can be associated with biochemical capabilities associated with promotion of plant growth evaluated in the laboratory.

Introducción

El tomate (Solanum lycopersicum Mill.) es una de las hortalizas más difundidas en todo el mundo con alto valor económico, ya que representa 30% de la producción hortícola a nivel mundial (Mejía, 2007). Su demanda aumenta considerablemente y con ella su cultivo, producción y comercio. El incremento anual de la producción en los últimos años, se debe principalmente al rendimiento e incremento de la superficie cultivada (Jaramillo et al, 2007).

El fósforo (P), es uno de los nutrientes más importantes para el desarrollo de las funciones básicas del metabolismo de las plantas (Fernández, 2007). Se trata de un componente esencial de moléculas como RNA y DNA, así como de fosfolípidos (Coney, 2000). Sin embargo, muchos suelos en todo el mundo son deficientes en P disponible para el crecimiento de las plantas encontrándose en forma de quelatos insolubles (Vassilev et al, 2006), por lo que se utilizan grandes cantidades de fertilizantes de alta solubilidad, de los cuales una gran proporción es rápidamente transformada en la forma insoluble (Omar, 1998). Algunos microorganismos mejoran la disponibilidad de P para las plantas por mineralización de P orgánico en el suelo y la solubilización de fosfatos (Kang et al, 2002; Chen et al., 2006).

Éste grupo de rizobacterias pertenecen al grupo de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) y entre ellas se encuentran los géneros Pseudomonas, Azospirillum, Burkholderia, Bacillus, Enterobacter, Rhizobium, Erwinia, Alcaligenes, Arthrobacter, Acinetobacter y Flavobacterium entre otros. El mecanismo más común para la solubilización de fosfatos minerales es la producción los ácidos orgánicos (Rodríguez y Fraga, 1999), mientras que el fosfato orgánico es mineralizado por enzimas fosfatasas (Chen et al., 2006). De esta forma el fósforo queda disponible en el suelo y finalmente es absorbido por las plantas y utilizado para su desarrollo (Kang et al., 2002).

El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de la inoculación de bacterias promotoras de crecimiento vegetal sobre tomate (Solanum lycupersicum Mill.) y la capacidad fisiológica de solubilización de fosfatos tanto inorgánicos como orgánicos, la producción de compuestos indólicos totales y sideróforos por parte de éstas.

Materiales y métodos

El estudio se realizó en 2010, en el Centro de Investigación Tibaitatá (Corpoica) ubicado en Mosquera (Cundinamarca-Colombia), a una altura de 2 543 m; localizado geográficamente a 4°41" 43" de latitud norte y 74°12" 30" de latitud oeste.

Microorganismos y medios de cultivo

Las cepas Pseudomonasfluorescens PSO13, Pseudomonas putida PSO14, y Bacillus sp. BEOO2 y BEOO3, fueron proporcionadas por el banco de microorganismos del Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA y las cepas de Enterobacter sp. TVL-1 y TVL-2 y Enterobacter agglomerans UV1 (Caballero et al., 2007) fueron proporcionadas por el Banco de Microorganismos del Laboratorio de Microbiología de Suelos de CORPOICA. Las cepas fueron reactivadas en el medio de cultivo SRS modificado con roca fosfórica al 0.5% como fuente de fósforo (g/L: glucosa 10, extracto de levadura 0.5, NH₄(SO₄)₂ 0.5, KCl 0.2, MgSO₄ 7H₂O 0.3. MnSO4 7H₂O 0.004, FeSO4 7H₂O 0.2, púrpura de bromocresol 0.1, agar 15.0, pH: 7.2) a 30 ± 2 °C durante 48 h.

Para la cuantificación de la producción de compuestos indólicos se empleo el medio de cultivo K-lactato (KH₂PO₄ 0.96 g/L, K₂HPO₄ 1.67 g/L, MgSO₄ 7H₂O 0.29 g/L, NaCl 0.48 g/L, lactato de sodio 60% 17.1 mL/L, CaCl₂ 0.7% 10mL/L, FeCl₃ 7H₂O 1% 1mL/L, Na₂MoO₄ 2H₂O 0.5% 5mL/L, NH₄Cl 20% 1mL/L, pH7). Para la determinación de la producción de compuestos tipo sideróforos se empleó el medio CAS (g/L: cromo azurol S (CAS) 0.06, solución de FeIII (1 mM FeCl3 6H2O; 10 mM HCl) 10 mL, HDTMA 0.07; Agar Flo 37.00, glicerol, 10 mL, Pipes 30.24, pH 6.8) (Schwyn y Neilands, 1987)

Roca fosfórica

La roca fosfórica empleada en el presente estudio es originaria de Pesca-Boyacá (Colombia) la composición es la siguiente: 30% P₂O₅, 40% Ca, 12% Si, 0.1% Mg, 40 ppm Mn, 3 0 ppm Cu, 10 ppm Mo, 300 ppm Zn y 3% de humedad.

Solubilización y mineralización de fósforo

Tres aproximaciones fueron realizadas; una prueba cualitativa, una cuantitativa y la determinación de la actividad de la enzima fosfatasa.

Evaluación cualitativa de la solubilización de roca fosfórica

La evaluación cualitativa de la actividad biológica se realizó en agar SRSM-PR con púrpura de bromocresol (como indicador de cambio de pH del medio), se sembraron alícuotas de 50μL de suspensión bacteriana en NaCl al 0.85% ajustada a un OD₆₀₀= 0.500 (ThermoSpectronic- Genesys 10uv). Todas las cepas fueron evaluadas y los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. Las placas fueron incubadas durante 48 h a 30±2 °C y se midieron los halos de solublización y el diámetro de la colonia a las 24 y 48 h (Alikhani et al, 2006).

Evaluación cuantitativa de la solubilización de roca fosfórica

La determinación cuantitativa de la solubilización de roca fosfórica en medio líquido se llevó a cabo en medio SRSM-PR con un tiempo de incubación de 12 días a 30±2 °C y 150 rpm (Labline Hertz 3525). La cuantificación del fósforo solubilizado se llevó a cabo con la técnica de azul de fosfomolibdeno (Fiske y Subbarow, 1925).

Actividad enzimática

La actividad de las enzimas fosfomonoesterasas se determinó por medio de la técnica del p-nitrofenil fosfato descrita por Tabatabai y Bremner (1969), para esto se empleo el medio SRSM sin fuente de fósforo y se realizó la lectura en la fase estacionaria del crecimiento bacteriano.

Se realizó una suspensión bacteriana de cada una de las cepas en estudio en NaCl 0.85% a un OD₆₀₀= 0.200. Se tomaron alícuotas de 10μL de la suspensión, y se sembraron por triplicado sobre una placa de petri con agar CAS a razón de una microgota por caja, por triplicado. Las placas fueron incubadas durante 48 h a 30±2 °C. Los resultados positivos se indican por el viraje de color de azul a amarillo alrededor del crecimiento bacteriano (Schwyn y Neilands, 1987).

Producción de indóles totales

Los compuestos indólicos se estimaron mediante el ensayo colorimétrico descrito por Glickmann y Dessaux (1995) empleando el medio de cultivo K-lactato suplementado con triptófano a 100 mg/L. Los cultivos se incubaron durante 72 h a 150 rpm en oscuridad y para la lectura se empleó el reactivo de Salkowsky (FeCl₃ 7H₂O 12g/L en H₂SO₄ 7.9M) en una realación 1:1 con la suspensión bacteriana, dejándose reaccionar durante 30 min en oscuridad.

Evaluación bajo condiciones de invernadero

Las raíces de las plántulas de tomate (variedad Sofía) fueron sumergidas en una suspensión bacteriana de 200 mL a una concentración de 10⁸ UFC/mL en medio SRSM-RP durante 30 min y transferida a bolsas plásticas con capacidad de 2 kg. El suelo empleado fue sin esterilizar con un pH 5.9 y una textura franco limosa. El experimento se mantuvo bajo condiciones de invernadero por tres meses a una temperatura promedio mínima de 7 °C y máxima 37 °C, humedad de roció y penetración de luz. Se realizaron muestreos destructivos cada mes durante tres meses. La fertilización biológica se realizo al primer y segundo mes de siembra con 1 mL de los inóculos. Se implemento un diseño completamente al azar, con siete tratamientos: To= testigo absoluto, T1=testigo químico, T2= 1mL de inoculo de TVL-1 y 50% de fertilización química, T3= 1mL de inoculo de TVL-2 y 50% de fertilización química, T4= 1mL de inoculo PSO13 y 50% de fertilización química T5= 1mL de inoculo PSO14 y 50% de fertilización química T6= 1mL de inoculo de BEOO2 y 5 0% de fertilización química T7= 1mL de inoculo de BEOO3 y 50% de fertilización química T8= 1mL de inoculo UV1 y 50% de fertilización química. Se emplearon tres repeticiones y tres unidades experiméntales por repetición. Las variables evaluadas fueron: longitud de la parte área, longitud radical, peso seco de la parte aérea, peso seco de la raíz y producción de flores y frutos.

Análisis estadístico

Resultados y discusión

Solubilización y mineralización de fósforo. Evaluación cualitativa de la solubilización de roca fosfórica. Las cepas Enterobacter sp. TVL-2 y P. putida PSO14 presentaron los mayores índices de solubilización a las 24 h, mientras que Enterobacter sp. TVL-1 y TVL-2 fueron las mejores transcurridas 48 h de incubación. Se observó que los índices de solubilización incrementaron con el tiempo (Cuadro 1).

El mecanismo bacteriano que más se asocia a la solubilización de fósforo inorgánico es la biosíntesis de ácidos orgánicos entre los cuales se encuentran el ácido cítrico, láctico, succínico, glucónico y 2-cetoglucónico, entre otros (Rodríguez et al., 2004 y Gupta et al, 2007) los cuales disminuyen el pH o actúan como agentes quelantes, lo cual se encuentra relacionado con la disminución de pH encontrada en el presente estudio. La síntesis de ácidos orgánicos suele estar asociada al metabolismo de algunos carbohidratos, en este caso glucosa, la cual se metaboliza vía glucólisis y ciclo de Krebs (Gunnarsson et al, 2004). Seshadri y Ignacimuthu (2002) reportaron índices de solubilización de 2.05 ± 4.11 por Pseudomonas sp. y 1.84 ± 4.43 por Bacillus sp. en agar Pikovskaya suplementado con 0.5% Ca₃(PO₄)₂, lo cual concuerda con los resultados de esta investigación, sin embargo se debe tener en cuenta que el fosfato tricálcico es 10 veces más soluble que la roca fosfórica, por lo que la actividad microbiana es mayor en las cepas del presente estudio dada la difícil solubilidad de la fuente de fósforo empleada. De igual forma se ha reportado que microorganismos pertenecientes al género Enterobacter presentan importantes niveles de solubilización (Vassilev et al, 1997 y Sharma et al., 2011).

Evaluación cuantitativa de la solubilización de roca fosfórica

Las cepas de Enterobacter sp. TVL-1 y TVL-2, presentaron los mejores resultados (p< 0.05) (Cuadro 1).Adicionalmente, se evidenció una correlación entre la solubilización de fósforo y el pH final del medio de cultivo, el cual fue acidificado en todos los casos (R= -0,67; p= 0.05).

Yu etal. (2011) reportaron resultados similares a lo encontrado en el presente estudio con cepas de P. chlororaphis, B. cereus y P.fluorescens, siendo la fuente de fósforo fosfato tricálcico. Obtuvieron concentraciones de fósforo disponible entre 81.09 y 233.35 mg/L con una disminución significativa en el pH luego de 72 h de incubación. En el presentes estudio se encontraron niveles de solubilización de hasta 144.0 ± 0.04 mg/L en la cepa P. putida PSO14 pero empleando roca fosfórica con menor solubilidad que el fosfato tricálcico. En el caso de la cepa Enterobacter TVL-2 se presentó una solubilización de 192.5 ± 0.14 mg/L lo cual comparado con lo encontrado por Vassilev et al. (1997) con una solubilización de hasta 400 mg/L con una roca con 28.9% de P₂0₅ es bajo; sin embargo, lo anterior puede estar relacionado con la solubilidad de la roca empleada, pues de este factor depende la cantidad de fósforo disponible (P₂0₅) que puede ser liberado (Pérez y Smyth, 2005). Con relación a lo anterior, Sharma et al. (2011) Encontró una solubilización de roca fosfórica de 92.6 mg/L por parte de una cepa de Enterobacter asburiae, siendo esta actividad menor a la encontrada en las cepas del presente estudio.

Los resultados evidenciaron que sólo las cepas Enterobacter sp. TVL-1 y TVL-2 y P. fluorescens PSO13 fueron capaces de sintetizar fosfatasas, siendo la cepa Enterobacter sp. TVL-2 la que presentó la mayor producción (p= 0.05) (Cuadro 1). La actividad de las fosfatasas depende de una larga serie de factores medioambientales entre los que se encuentran: la concentración de sustrato y enzima, la composición del medio de reacción, la temperatura, el pH, los iones, e inhibidores, entre otros. Resultados similares fueron reportados por Park et al. (2010) quienes señalan en su estudio que la actividad de la fosfatasa ácida producida por las bacterias aisladas varió de 0.0034 a 0.1401 nM para géneros como Pantoea y Enterobacter, medido por la producción de p-nitrofenol. De acuerdo a lo anterior, la cepa Enterobacter sp. TVL-2 presentó una importante actividad con 0.538 ± 0.003 nM.

Síntesis de sideróforos

Las cepas Enterobacter sp. TVL-1 y TVL-2, P. putida PSO14 y Bacillus sp. BEOO2 y BEOO3 fueron capaces de producir este grupo de compuestos, evidenciando un incremento asociado al tiempo. La cepa que presentó mayor producción tanto a las 24 como a las 48 h fue la cepa P. putida PSO14 (p< 0.05) (Cuadro 2).

Producción de índoles totales

Al evaluar la producción de compuestos indólicos se observó un comportamiento similar en todas las cepas evaluadas, presentado los mejores resultados las cepas de Enterobacter sp. TVL-2 y TVL- 1 (p< 0.05). (Cuadro 2). En general, la producción de auxinas por las bacterias, especialmente el ácido 3-indolacético, ha evidenciado influir significativamente sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas. Varios estudios han demostrado que la producción in vitro de AIA y otras hormonas fisiológicamente activas derivadas del L- triptófano, son una característica de las cepas BPCV (Peñas y Reyes, 2007; Teixeira et at., 2007). Ali et al. (2009) encontraron que diferentes aislamientos de Bacillus sp. aumentaron la concentración deAIA producido al aumentar la concentración de L-triptófano en el medio de cultivo con resultados que oscilaban en rangos entre 19.6 ± 0.7 μg/ mL y 21± 0.6 μg/ mL. Es importante resaltar que en el presente ensayo se utilizaron concentraciones bajas de triptófano (100 mg/L) para evaluar la producción de índoles, lo cual permite afirmar que las cepas evaluadas pueden ser consideradas como promotoras del crecimiento vegetal por su alta síntesis de este tipo de compuestos con valores que oscilan entre 18 y 25 (μg/mL.

Experimento en invernadero. Longitud de la planta. Los resultados en altura de la planta mostraron incrementos en el tamaño de la planta hasta dos veces en los tratamientos con Enterobacter sp. TVL-2 y Bacillus sp. BEOO2 en el segundo mes de muestreo. En el tercer mes, la bacteria que mostró ejercer el mayor efecto fue P. putida PSO14 la cual fue casi tres veces mayor con respecto al testigo absoluto, mientras que comparado con el testigo químico presentó una diferencia de 30% (Figura 1).

La longitud radical fue incrementada por la inoculación bacteriana. En el primer mes se observan diferencias importantes ejercidas por la cepa E. agglomerans UV1 y Enterobacter sp. TVL-1 de casi dos veces con respecto al testigo absoluto En el segundo mes se observó que la cepa P. fluorescens PSO13 superó 16% al testigo químico y al tercer mes de muestreo, se encontraron diferencias significativas con respecto al testigo absoluto por parte de la cepa P. putida PSO14 (Figura 2).

La cepa P. putida PSO14 fue la que más influyó sobre el proceso de elongación de las plantas de tomate, lo cual pudo estar relacionado con la capacidad de producir metabolitos benéficos, tales como fitohormonas y sideróforos o a la solubilización de fósforo inorgánico aumentando su disponibilidad para la planta. Se debe destacar que a pesar que P. putida PSO14 no mostró los mejores resultados in vitro si evidenció el mejor efecto sobre la planta en las dos variables de longitud, estos resultados pueden ser explicados con base en la presencia de diferentes condiciones entre las pruebas realizadas en invernadero y laboratorio, las cuales pueden influir significativamente sobre la capacidad de las bacterias para promover el crecimiento vegetal. Resultados similares han sido reportados por Kirankumar et al. (2008) y Kumar et al. (2010) quienes evidenciaron que el género Pseudomonas mejoró significativamente el crecimiento vegetal de plantas de tomate registrando mayor altura, mayor rendimiento del fruto y absorción de nutrientes.

Peso seco de la planta

En cuanto a la biomasa radical las cepas Enterobacter sp. TVL-2 y P. putida PSO14 mostraron los mejores resultados superando al testigo químico por 23% y 10%, y presentando diferencias estadísticamente significativas respecto al control absoluto (Figura 4).

El aumento de la biomasa radical tiene fuertes repercusiones en la capacidad de las plantas para asimilar los nutrientes del suelo puesto que representa una mayor exploración del suelo por parte de éstas (Antoun y Prevost, 2005). Varios estudios han mostrado que el ácido 3-indolacético (AIA) tiene un importante impacto sobre el desarrollo radicular de las plantas (Ashrafuzzaman et al, 2009). Patten y Glick (2002) aseguraron que el género de Pseudomonas sp., tiene potencial para estimular el crecimiento de las plantas por la producción de AIA; lo cual se observó en el presente estudio. De igual manera, Gravel et al. (2006) mostraron que la cepa de P. putida subgrupo B1 es capaz de sintetizar AIA a partir de diferentes precursores, encontrando además un incremento en el peso seco de la raíz y en la producción de frutos de plantas de maíz.

Todos los tratamientos mostraron diferencias estadísticamente significativas en el número de flores a los 90 dds con respecto al control absoluto. La inoculación con la cepa Enterobacter sp. TVL-2 exhibió los mejores resultados con un valor promedio de nueve flores por planta, en relación a una flor del testigo absoluto y 4 del testigo químico (Figura 5).

En el número de frutos los resultados también se evidenciaron al tercer mes, en el cual las cepas Enterobacter sp. TVL-2 y P. putida PSO14 superaron 29% y 17% al testigo químico y al testigo absoluto con una producción de 6 frutos por planta en relación a 1 (Figura 6).

La producción de auxinas también se encuentra íntimamente relacionada con los procesos de fructificación de las plantas (Srivastava y Handa, 2005). Por tanto, se puede inferir que la inoculación con las bacterias favoreció la producción de frutos, teniendo en cuenta que las cepas evaluadas presentaron producción de indoles. Con relación a los resultados obtenidos en el presente estudio se debe mencionar que otros autores (Badri et al, 2009) han reportado la capacidad productora de indoles, sideróforos y solubilización de fósforo como mecanismos que promueven el crecimiento de las plantas (Ma et al, 2011). Otros autores han reportado el efecto de cepas de P. marginalis y P. putida sobre la producción de tomate bajo condiciones de invernadero, aumentando el número de frutos 11 y 23.3% (Gravel et al, 2007). De forma adicional se ha encontrado que P. fluorescens incrementa ésta producción hasta 13.35% (Gagné et al, 1993), B. subtilis, 25% (Mena y Olalde, 2007) y Gluconacetobacter diazotrophicus en 17.77% (Luna et al., 2011); resultados que soportan lo encontrado en el presente estudio.

Se debe resaltar la dosis de fertilización empleada en aquellos tratamientos que fueron inoculados con las diferentes cepas evaluadas, la cual correspondió a 50% de la fertilización total que recibió el testigo químico. Con relación a lo anterior se puede observar en todas las variables agronómicas evaluadas que los tratamientos inoculados que presentaron los mejores resultados siempre superaron o igualaron al testigo químico, lo cual fortalece la importancia de este tipo de inoculantes como complemento de la fertilización de síntesis que permita mitigar su uso en exceso.

Conclusiones

De forma preliminar se puede establecer que la inoculación de las plantas de tomate con las cepas Enterobacter sp. TVL-2 y P. putida PSO14 exhibe un gran potencial para estimular el crecimiento y la producción de este cultivo. El uso de este tipo de bacterias, pueden ser una alternativa prometedora como biofertilizantes para el cultivo de tomate y la producción en la agricultura sostenible teniendo en cuenta que disminuiría el impacto sobre el medio ambiente al reducir el uso excesivo de fertilizantes de síntesis química. De igual forma, se podrán reducir los costos de producción al requerirse la mitad de la dosis de fertilizante químico, que al ser suplementado con la fertilización bacteriana permite obtener los mismos resultados. Por tanto, la inoculación con estos microorganismos promotores de crecimiento vegetal representa una alternativa limpia y segura para asegurar la fertilización de los cultivos sin incurrir en los costos ambientales y económicos de la fertilización química tradicional.

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