Identificación de especies de Pythium aisladas de plantas ornamentales*

Identification of Pythium species isolated from ornamental plants

Marlene Díaz-Celaya¹, Gerardo Rodríguez-Alvarado¹, Hilda Victoria Silva-Rojas², Martha Elena Pedraza-Santos³, Rafael Salgado-Garciglia⁴ y Sylvia Patricia Fernández-Pavía^1§

¹ Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Carretera Morelia-Zinapécuaro, km 9.5. Tarímbaro, Michoacán, México. C. P. 58880. Tel. 01 443 2958323 y 2958324. (marle_dc@yahoo.com.mx), (gra.labpv@gmail.com). ^§Autora para correspondencia: fpavia@umich.mx.

³ Facultad de Agrobiología. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Paseo Lázaro Cárdenas esq. Berlín. Colonia Viveros, Uruapan, Michoacán, México. C. P. 60090. Tel. 01 452 5236474. (marelpesa@yahoo.com.mx).

⁴ Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Ciudad Universitaria. Morelia, Michoacán, México. C. P. 58060, Tel. 01 443 3265788. (rafael.salgadogarciglia@gmail.com).

* Recibido: junio de 2011
Aceptado: octubre de 2011

Resumen

El uso de plantas ornamentales como elementos decorativos en jardines e interiores, ha tomado gran importancia en todo el mundo. Sin embargo, uno de los principales problemas en la producción de estas plantas en vivero es el inadecuado manejo fitosanitario, que ocasiona enfermedades causadas por Pythium spp. que afecten todas las etapas del ciclo de producción, ya que el patógeno es capaz de sobrevivir en agua, residuos de plantas y suelo. Debido al auge del cultivo de plantas ornamentales en vivero y a las pérdidas económicas producidas por patógenos vegetales, se han realizado estudios en diferentes viveros a nivel mundial, para detectar la presencia de estos; no obstante, en México los trabajos que existen son muy escasos. El objetivo de este estudio fue detectar e identificar especies de Pythium en muestras de tejido enfermo y en la rizosfera del suelo, procedentes de viveros ubicados en Morelia, Tarímbaro y Uruapan en el estado de Michoacán, mediante la caracterización morfológica y molecular. El estudio se realizó durante los años 2008 y 2009. Dieciocho aislamientos fueron obtenidos a partir de 17 hospederos, de los cuales 14 fueron patogénicos en pepino. Trece aislamientos se caracterizaron en base a las secuencias de la región ITS del ADNr y a las características morfológicas; las especies de Pythium identificadas fueron: un aislamiento con P. aphanidermatum, tres de P. cylindrosporum, uno con P. dissotocum, dos de P. irregulare, tres con P. splendens, dos de P. ultimum var. ultimum y uno con Pythium sp. nov.

Palabras clave: oomicete, patógeno, vivero.

Abstract

The use of ornamental plants as decoration in gardens and interiors has become worldwide quite important. However, one of the main problems in the production of these plants in the nursery is the inadequate phytosanitary handling, allowing diseases caused by Pythium spp. to affect all stages of production due that the pathogen can survive in water, plant residues and soil. With the rise of ornamental plants culture in nurseries and economic losses caused by plant pathogens, studies have been conducted in different nurseries around the world for detecting its presence; however, in Mexico there are only very few papers related to this matter. The aim of this study was to detect and identify Pythium species in samples of diseased tissues and soil's rhizosphere from nurseries located in Morelia, Tarimbaro and Uruapan in Michoacan State, by morphological and molecular characterization. The study was conducted in 2008 and 2009. Eighteen isolates were obtained from 17 hosts and 14 of them were pathogenic on cucumber. Thirteen isolates were characterized based on the sequences of the ITS region of rDNA and morphological characteristics; identified Pythium species were: one isolation with P. aphanidermatum, three of P. cylindrosporum, one with P. dissotocum, two of P. irregulare, three with P. splendens, two of P. ultimum var. ultimum and one with Pythium sp. nov.

Key words: nursery, oomycete, pathogen.

INTRODUCCIÓN

El género Pythium consta de más de 120 especies (Dick, 1990), que se encuentran ampliamente distribuidas en todo el mundo. Pythium puede vivir como saprófito sobre restos de plantas muertas o puede ser patógeno. En sistemas de producción tales como invernaderos, viveros, campos agrícolas y bosques ocasiona pudrición de semillas, ahogamiento de plántulas, pudrición de raíces, frutos y otros órganos vegetales que se encuentran en contacto con el suelo (MacDonald et al., 1994; Agrios, 2005). También se asocia con una reducción en el vigor de plantas adultas, ya que daña la raíz; pero generalmente no las mata (Martin, 2009).

Este oomicete puede ser introducido en viveros, establecerse ahí, dispersarse e infectar plantas susceptibles, un número pequeño de plantas infectadas genera una gran cantidad de propágulos (MacDonald et al., 1994). Debido a las pérdidas económicas producidas por patógenos en plantas ornamentales en vivero, se han realizado estudios a nivel mundial para detectarlos y se han identificado varias especies de Pythium causando daños, entre las que se encuentran: P. aphanidermatum, P. cylindrosporum, P. intermedium, P. irregulare, P. pachycaule, P. paroecandrum, P. spinosum, P. splendens, P. sylvaticum, P. ultimum var. ultimum y P. vexans (Duff, 1993; Tello et al., 1995; Al-Sa'di et al., 2007), en agua de riego se ha identificado P. dissotocum, P. porphyrae, P. sulcatum y P. torulosum, (Kong et al., 2004). Los estudios sobre Pythium son escasos, a diferencia del taxón Phytophthora (perteneciente también a la familia Pythiaceae) que destruye una gran cantidad de plantas.

La identificación de especies del género Pythium está basada en características morfológicas, como forma y tamaño de los esporangios, tamaño y ornamentación del oogonio, el número de anteridios y la forma en que están unidos (Van der Plaats-Niterink, 1981; Martin, 2009). La gran variación de características morfológicas dentro del género y el hecho de que estas características son compartidas entre especies, así como la ausencia de estructuras que permitan la identificación de ciertas especies o aislamientos, dificulta en gran medida la identificación de este oomicete; por lo tanto, la caracterización morfológica debe complementarse con la identificación molecular. El análisis de las secuencias ITS 1, 5.8S e ITS2 del ADN ribosomal (ADNr) ayuda a simplificar la clasificación de los aislamientos a nivel de especie.

Dicha región del ADNr es la más usada en estudios del género Pythium, ya que presenta gran variabilidad y existe la disponibilidad de iniciadores desarrollados por White et al. (1990) para su amplificación mediante la técnica de PCR. El uso de caracteres moleculares es especialmente importante, para aislamientos que no forman estructuras como oosporas y por lo tanto, no pueden ser clasificados morfológicamente a nivel de especie. Algunos estudios han demostrado que el tamaño de la región ITS del ADNr varía de 750-1050 pb, lo cual indica que es mayor que en hongos 300-700 pb, que provee de un número mayor de caracteres para su análisis (Lévesque y De Cock, 2004).

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de muestras

Se obtuvieron muestras de suelo y tejido enfermo de 25 géneros de plantas ornamentales con síntomas de marchitez de ocho viveros de los municipios de Morelia, Tarímbaro y Uruapan, del estado de Michoacán.

Obtención de aislamientos a partir de tejido vegetal

Los aislamientos fueron realizados directamente de las secciones de raíces de las plantas con síntomas. Se hicieron cortes de tejido de 5 a 10 mm a partir del borde de la lesión, estos se desinfestaron con una solución de hipoclorito de sodio (0.6%) durante 30 s. Algunos cortes únicamente se enjuagaron con agua. Después se colocaron en una caja Petri con medio selectivo de harina de maíz (PARN) conteniendo: pentacloronitrobenceno (PCNB) (0.1 g litro-¹), ampicilina (0.27 g litro-¹), rifampicina (0.01 g litro-¹) y natamicina (0.02g litro-¹) y en medio selectivo V8 (PARN) conteniendo: PCNB (0.1 g litro-¹), ampicilina (0.27 g litro-¹), rifampicina (0.01 g litro-¹) y natamicina (0.02 g litro-¹). Se incubaron a temperatura ambiente (23 °C ±3 °C) hasta que se observó el crecimiento de colonias.

Obtención de aislamientos a partir de suelo o sustrato de siembra

Se tomaron muestras de la rizosfera del suelo directamente de plantas enfermas. Se colocaron en una caja Petri 10 g de suelo y 20 ml de agua destilada estéril, se usó como cebo hojas completas o discos de azalea (Rhododendron indicum). Las cajas Petri se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente (23 °C ±3 °C). Posteriormente los discos o las hojas completas se desinfestaron con una solución de hipoclorito de sodio (0.06%) durante 30 segundos. Se sembraron en medio selectivo de harina de maíz PARN y se incubaron a temperatura ambiente (23 °C ±3 °C), hasta que se observó el crecimiento de colonias. Los aislamientos puros se transfirieron a medio de cultivo de harina de maíz, a partir de los cuales se obtuvieron cultivos de punta de hifa y se almacenaron a 15 °C en tubos de microcentrífuga con agua destilada estéril.

Caracterización morfológica

Extracción de ADN

Los aislamientos obtenidos que crecieron en medio líquido de chícharo estéril; el ADN se extrajo a partir de micelio de cada aislamiento, para lo cual se utilizó el siguiente protocolo: cada aislamiento que creció en medio líquido de chícharo, el cual se preparó colocando 120 g de chícharos en 1 000 ml de agua destilada, este se esterilizó durante 20 min a 121 °C. Posteriormente se filtró con manta de cielo y se aforó a 1 litro con agua destilada, y se esterilizó nuevamente. Se vació en cajas de Petri y se incubó a 25 °C, de una a dos semanas para obtener abundante crecimiento micelial. El micelio se enjuagó con agua destilada estéril en un embudo, con tela filtrante (Miracloth). Posteriormente el micelio se envolvió con papel filtro y papel aluminio estériles y se deshidrató durante 24 a 48 h a 4 °C.

El micelio deshidratado se molió en un mortero estéril con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y se transfirió a tubos de microcentrífuga. El micelio se almacenó a -20 °C hasta que fue utilizado. A cada tubo con micelio molido se le agregaron 900 µl de búfer de extracción (0.05 M EDTA, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M NaCl, 0.25% SDS, 0.75% Mercaptoetanol), precalentado a 65 °C. Las muestras se incubaron a 65 °C durante 1 h. Posteriormente se adicionan 450 µl de una solución de acetato de amonio 7.5 M, se mezclaron vigorosamente durante 5 min y se mantuvieron en hielo durante 20 min.

Los tubos se centrifugaron a 13 200 revoluciones por minuto (rpm) durante 15 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 800 µl de isopropanol, los tubos se agitaron manualmente y se mantuvieron en hielo por 30 min. Las muestras se centrifugaron nuevamente a 13 200 rpm durante 15 min. Los tubos se mantuvieron invertidos para drenar el líquido, y la pastilla se secó a temperatura ambiente. La pastilla se resuspendió en 450 µl de TE pH 7.5 y luego se agregó 1 µl de ARNasa A (20 mg ml), se dejó toda la noche a 4 °C.

Posteriormente se agregaron a cada tubo 450 µl de cloroformo: alcohol isoamil (24:1) y se mezcló vigorosamente durante 5 min, en seguida los tubos se centrifugaron a 13 200 rpm durante 5 min y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. Se agregaron 45 µl de acetato de sodio 3 M y 1 ml de etanol 100% frío, los tubos se agitaron manualmente y mantuvieron por 1.5 h a -20 °C. Se centrifugaron los tubos a 13 200 rpm durante 15 min. Se descartó el sobrenadante y se secó la pastilla a temperatura ambiente. Esta se resuspendió en 100 µl de TE pH 7.5, y se dejó toda la noche a 4 °C. Las muestras se analizaron por electroforesis, colocando 5 µl de ADN en un gel de agarosa 1%/TAE durante 90 min a 50V.

Para amplificar la región de los espacios transcritos internos (ITS1, 5.8S e ITS2) se utilizaron los oligonucleótidos ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (White et al., 1990), los cuales hibridizan dentro de los genes 18S ADNr y 28S ADNr. Las condiciones usadas para la realización del PCR fueron las siguientes: 4 min a 95 °C, 34 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C, 2 min a 72 °C y un paso final de extensión a 72 °C durante 10 min. Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en geles de agarosa (1.5%) para determinar el grado de amplificación.

Después se purificaron con un kit comercial (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System-Promega), y se enviaron a la compañía Macrogen (Corea del Sur). Las secuencias obtenidas se ensamblaron y editaron usando BioEdit version 7.0.5 (Hall, 1999), con el cual se creó una secuencia consenso. Esta secuencia se comparó con las secuencias de aislamientos tipo, depositadas en el GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante la opción BLASTN 2.2.19 (Zhang et al., 2000).

Identificación de especies de Pythium mediante técnicas moleculares

Para establecer las relaciones filogenéticas entre las especies de Pythium, las secuencias consenso obtenidas de cada aislamiento, se compilaron en un archivo fasta y se alinearon con el profile mode de Clustal W 1.8.1 (Thompson et al., 1994), incluido en el programa Mega 4.0.2 (Tamura et al., 2007).

Para determinar los valores de confianza de los agrupamientos dentro del árbol resultante, se realizó un análisis boostrap con 1 000 repeticiones al azar (Felsestein, 1985). Las secuencias de referencia de cada una de las especies encontradas en este trabajo se obtuvieron del GenBank (NCBI). Phytophthora sp. número de acceso FJ217679 se asignó fuera de grupo.

Pruebas de patogenicidad en plántulas de pepino

Preparación del inóculo. Se usaron hojas de pasto lavadas con agua y jabón, las cuales se cortaron en trozos de aproximadamente 1 cm de longitud y se colocaron en tubos de ensayo con agua destilada. Los tubos se esterilizaron durante 20 min a 121 °C. Los tubos con las hojas de pasto estériles se inocularon con discos de micelio de los diferentes aislamientos de Pythium. Se incubaron hasta que se observó al micelio colonizando las hojas de pasto. Se utilizó este método ya que el pasto no e s tóxico para la planta inoculada, como lo puede ser el medio de cultivo que se utiliza en otros protocolos de inoculación.

Germinación de semillas. Se usaron semillas de pepino verde (Cucumis sativus L.) (Víta®). Las semillas se lavaron con agua destilada estéril, enseguida se sumergieron en etanol (96%) durante 5 s, nuevamente se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Las semillas se transfirieron posteriormente a cajas Petri estériles en las que se colocó papel filtro estéril humedecido. Se incubaron a 25 °C expuestas a la luz durante 6 días.

Trasplante e inoculación de las plántulas. Las plántulas de pepino se colocaron en macetas de plástico que se llenaron con suelo (turba/agrolita) estéril, humedecido; se mantuvieron a 23 °C ±3 °C, expuestas a la luz. Seis días después del trasplante se realizó la inoculación, la cual se hizo colocando una de las hojas de pasto colonizadas por Pythium cerca del tallo de cada plántula y se cubrió con suelo. Después de la inoculación se regó cada plántula con el propósito de mantener condiciones de alta humedad. Seis plántulas por aislamiento fueron inoculadas y tres fueron usadas como control. Durante el experimento las plántulas se mantuvieron a temperatura ambiente (23 °C ±3 °C) y en condiciones de alta humedad.

RESULTADOS

Obtención de aislamientos

Se obtuvieron 18 aislamientos del género Pythium a partir de 17 de las 25 plantas ornamentales muestreadas procedentes de viveros de Morelia, todas mostrando síntomas de marchitez (Cuadro 1). No se detectó Pythium en las plantas de los municipios de Tarímbaro y Uruapan.

Caracterización de los aislamientos

La caracterización morfológica de los aislamientos permitió la identificación de siete especies de Pythium: P. aphanidermatum (Edson) Fitzp., P. cylindrosporum B. Paul, P. dissotocum Drechsler, P. irregulare Buisman, P. ultimum Trow var. ultimum, P. splendens Hans Braun. y Pythium sp. nov. Detectándose más de una especie en todos los viveros. La identificación morfológica se confirmó mediante la secuenciación de las regiones ITS 1, 5.8 S e ITS2 del ADNr (Van der Plaats-Niterink, 1981; Lévesque y De Cock, 2004; McLeod et al., 2009) (Cuadro 2). Las características morfológicas observadas se muestran en el Cuadro 3 y en la Figura 1. Se detectaron tanto especies homotálicas como heterotálicas.

La posición filogenética de las especies dentro del género Pythium se muestra en la Figura 2, el árbol fue construido con secuencias correspondientes al espacio transcrito interno (ITS) del ADNr usando el método de máxima parsimonia.

Pruebas de patogenicidad

Catorce de los 18 aislamientos obtenidos en este estudio fueron patogénicos en pepino, los síntomas de ahogamiento en las plántulas se presentaron entre dos y nueve días después de la inoculación. Los testigos no presentaron síntomas.

DISCUSIÓN

Los problemas fitosanitarios que ocasionan enfermedades en viveros dedicados a la producción y venta de plantas ornamentales, no son tratados en la mayoría de las ocasiones debido a la falta de conocimiento acerca de la identidad de los patógenos que las ocasionan. Por esto, el presente trabajo constituye un avance importante debido que se identificaron siete especies de Pythium, ocasionando síntomas de marchitez en 17 especies de plantas ornamentales en viveros de Morelia, Michoacán.

En México son escasos los reportes acerca de enfermedades causadas por oomicetes en viveros. Existen reportes de patógenos que causan daños en plantas ornamentales en viveros de diferentes partes del mundo, entre los que se encuentran los ocasionados por los oomicetes Pythium (Duff, 1993; Tello et al., 1995; Kong et al., 2004; Al-Sa'di et al., 2007) y Phytophthora (Warfield et al., 2008; Moralejo et al., 2009; Yakabe et al., 2009).

Debido a que Pythium puede encontrarse como saprofito, se han diseñado pruebas de patogenicidad en las cuales se utilizan plántulas de pepino como cebos, para la evaluación del potencial infeccioso de aislamientos de Pythium (Sánchez et al., 2001; Sánchez y Gallego, 2002). Esta prueba de patogenicidad en plántulas de pepino resultó muy efectiva, ya que permitió seleccionar 14 aislamientos patogénicos de los 18 aislamientos de Pythium, obtenidos de cuatro viveros de Morelia, Michoacán. Esto es indicativo del gran problema fitosanitario que ocasiona este patógeno en la producción masiva de plantas. Asimismo, se detectó el amplio rango de hospedantes que tiene este oomicete, al haberse aislado de diferentes plantas ornamentales. De las plantas ornamentales analizadas únicamente el género Rhododendron, había sido previamente reportado a nivel mundial como hospedante de Pythium (Ho, 1986).

La identificación morfológica de los aislamientos se confirmó con las secuencias de las regiones ITS1, 5.8S e ITS2 del ADNr, se identificaron siete especies: P. aphanidermatum, P. cylindrosporum, P. dissotocum, P. ultimum var. ultimum, P. ir regulare, P. splendens y Pythium sp. nov. Es importante mencionar que las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias de los aislamientos tipo. Se menciona esto porque existen secuencias en el GenBank (NCBI), que están incorrectamente clasificadas, y no corresponden a la especie que reportan. Las secuencias obtenidas del aislamiento PV8 presentaron 95% de homología con P. debaryanum, debido a este bajo porcentaje se puede considerar como una especie no descrita. Con respecto a las especies identificadas, cuatro de ellas ya han sido reportadas en viveros ornamentales, P. dissotocum, P. ultimum var. ultimum, P. aphanidermatum y P. irregulare (Duff, 1993; Tello et al., 1995; Kong et al., 2004; Al-Sa'di et al., 2007).

Se ha reportado que entre las especies de Pythium más patogénicas se encuentran P. cylindrosporum, P. aphanidermatum, P. dissotocum y P. splendens (Miller y Sauve, 1975; citado en Moorman et al., 2002; Kong et al., 2004), todas ellas identificadas en este estudio. Las enfermedades causadas por Pythium son un importante factor limitante que afecta la producción de cultivos florales (Kong et al., 2004). Además, Pythium puede ser transportado de un lugar a otro a través de suelo o agua de riego infestados, al igual que por medio de esquejes, semillas o plantas infectadas. En Michoacán se comercializan plantas provenientes de diferentes estados entre los que se encuentran el Estado de México, Guanajuato, Guerrero y Jalisco, por lo que este patógeno se está diseminando de un estado a otro en el país.

CONCLUSIONES

Se obtuvieron 18 aislamientos de Pythium a partir de muestras de suelo y tejido enfermo de 17 especies ornamentales de cuatro viveros de Morelia.

Se identificaron siete especies de Pythium en base a las características morfológicas y a las secuencias de las regiones ITS1, 5.8S e ITS2 del ADNr:P. aphanidermatum, P. irregulare, P. cylindrosporum,P. dissotocum,P. ultimum var. ultimum, P. splendens, Pythium sp. nov.

Se reportan 13 hospederos para las diferentes especies de Pythium identificadas eneste estudio: rada (Ruta graveolens), primavera (Primula acaulis), Buxus sempervirens, pino (Cedrus sp.), violeta africana (Saintpaulia hybrida), violeta imperial (Cyclamen persicum), azalea (Rhododendron indicum), gazania (Gazania rigens), belén (Impatienshawkerixhybrida), amor deunmto (Portulaca grandiflora), santolin (Santolina chamaecyparissus), panalillo (Alyssum maritimum) y gerbera (Gerbera sp.).

De las plantas ornamentales analizadas únicamente el género Rhododendron, había sido previamente reportado a nivel mundial como hospedante de Pythium.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos de manera muy especial a la Dra. Gloria Abad por su valiosa ayuda en el análisis de las secuencias, para la determinación de las especies.

LITERATURA CITADA

Agrios, G. N. 2005. Plant Pathology. 5^ta edición. Editorial Academic Press. México. 922 p.         [ Links ]

Al-Sa'di, A. M.; Drenth, A.; Deadman, M. L.; Al-Said, F. A.; Khan, I. and Aitken, E. A. B. 2007. Potential sources of Pythium inoculum into greenhouse soils with no previous history of cultivation. J. Phytopathol. 156:502-505.         [ Links ]

Dick, W. M. 1990. Keys to Pythium. Ed. Dick, M. W.. Department of Botany. School of Plant Sciences. University of Reading. Reino Unido. 64 p.         [ Links ]

Duff, J. D. 1993. The incidence of Phytophthora and Pythium species in Northern territory nurseries. Australasian Plant Pathol. 22:149-151.         [ Links ]

Felsestein, J. 1985. Confidence limits on phylogenesis: an approach using the boostrap. Evolution. 39:783-791.         [ Links ]

Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. NucleicAcids Symposium Series. 41:95-98.         [ Links ]

Ho, H. H. 1986. Pythium dimorphum from Rhodondendron. Mycopathologia. 93:141-145.         [ Links ]

Kong, P.; Richardson, P. A. and Hong, C. 2004.Pythium and recycled irrigation water. Pest and Dis. 32-35 pp.         [ Links ]

Lévesque, C. A. and De Cock, A. W. A. M. 2004. Molecular phylogeny and taxonomy of the genus Pythium. Mycol. Res. 108(12): 1363-1383.         [ Links ]

MacDonald, J. D.; Ali-Shtayed, M. S.; Kabashima, J. and Stites, J. 1994. Occurrence of Phytophthora species in recirculated nursery irrigation effluents. Plant Dis. 78:607-611.         [ Links ]

McLeod, A.; Botha, W. J.; Meitz, J. C.; Spies, C. F.; Tewoldemedhin, Y. T. and Mostert, L. 2009. Morphological and phylogenetic analyses of Pythium species in South Africa. Mycol. Research. 113:933-951.V        [ Links ]

Martin, F. 2009. Pythium Genetics, In: oomycete genetics and genomics: diversity, interactions, and research tools. Lamour, K. and Kamoun, S. (eds.).Wiley Blackwell. Estados Unidos de América. 213-239 pp.         [ Links ]

Moorman, G. W.; Kang, S.; Geiser, D. M. and Kim, S. H. 2002. Identification and characterization of Pythium species associated with greenhouse floral crops in Pennsylvania. Plant Dis. 86:1227-1231.         [ Links ]

Moralejo, E.; Pérez-Sierra, A. M.; Álvarez, L. A.; Belbahri, L.; Lefort, F. and Descals, E. 2009. Multiple alien Phytophthora taxa discovered on diseased ornamental plants in Spain. Plant Pathol. 58:100-110.         [ Links ]

Sánchez, J.; Olivares, J. S. and Gallego, E. 2001. Occurrence and pathogenicity of Pythium spp. in the dust deposited on the greenhouse roofs in the Poniente region of Almeria (South-East Spain). J. Plant Pathol. 83:13-19.         [ Links ]

Sánchez, J. and Gallego, E. 2002. Fitopatogenicidad de Pythium spp. presentes en el agua de riego del poniente almeriense (sureste de España). Revista Iberoamericana de Micología. 19:177-180.         [ Links ]

Tamura, K.; Dudley, J.; Nei, M. and Kumar, S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molec. Biol. Evol. 24:1596-1599.         [ Links ]

Tello, M. M. L.; Alonso, A. y Mateo-Sagasta, Azpeitia, E. 1995: Algunos hongos patógenos detectados en raíces de diferentes plantas ornamentales en viveros de la Comunidad de Madrid. Boletín de Sanidad Vegetal Plagas 21:517-526.         [ Links ]

Thompson, J. D.; Higgins, D. G. and Gibson, T. J. 1994. Clustal W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680.         [ Links ]

Van Der Plaats-Niterink, A. J. 1981. Monograph of the genus Pythium. Vol. 21. Centraalbureau Voor Schimmel-cultures, Baarn. The Netherlands. 242 p.         [ Links ]

Warfield, C. Y.; Hwang, J. and Benson, D. M. 2008. Phytophthora blight and dieback in North Carolina nurseries during a 2003 survey. Plant Dis. 92:474-481.         [ Links ]

White, T. J.; Bruns, T.; Lee, S. and Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribososmal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: a guide to methods and applications. Innis, M. A.; Gelfand, D. H.; Sninsky, J. J. and White, T. J. (eds.). Academic Press. Estados Unidos de América. 315-322 pp.         [ Links ]  

Yakabe, L. E.; Blomquist, C. L. and Thomas, S. L. 2009. Identification and frequency of Phytophthora species associated with foliar diseases in California ornamental nurseries. Plant Dis. 93: 883-890.         [ Links ]

Zhang, Z.; Schwartz, S.; Wagner, L. and Miller, W. 2000. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J. Computational Biol. 7:203-14.         [ Links ]